Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Сальмонеллез пушных зверей и его специфическая профилактика 9
1.2. Морфология иммунной системы млекопитающих 16
1.2.1. Система иммунитета млекопитающих 16
1.2.2. Морфологическая характеристика центральных органов иммунной системы 20
1.2.3. Морфологическая характеристика периферических органов иммунной системы 21
1.3. Поствакцинальные иммуноморфологические изменения у животных при
разных способах введения бактериальных антигенов 28
2. Материалы и методы исследований 39
2.1. Материалы для исследований 39
2.2. Методы исследований 40
3. Результаты собственных исследований 44
3.1. Результаты изучения поствакцинального иммунного ответа у песцов после пероральной иммунизации 44
3.1.1. Результаты гематологических, биохимических, серологических и иммунологических исследований 44
3.1.2. Иммуноморфогенез у песцов после пероральной иммунизации 49
3.1.2.1. Иммуноморфогенез в тимусе 49
3.1.2.2. Иммуноморфогенез в глоточных миндалинах 51
3.1.2.3. Иммуноморфогенез в нижнечелюстных лимфатических узлах 55
3.1.2.4. Иммуноморфогенез в селезенке 59
3.1.2.5. Иммуноморфогенез в брыжеечных лимфатических узлах 63
3.1.2.6. Иммуноморфогенез в лимфоидной ткани кишечника 65
3.2. Результаты изучения поствакцинального иммунного ответа у песцов после комбинированной иммунизации 72
3.2.1. Результаты гематологических, биохимических, серологических и иммунологических исследований 72
3.2.2. Иммуноморфогенез у песцов после комбинированного способа иммунизации 77
3.2.2.1. Иммуноморфогенез в тимусе 77
3.2.2.2. Иммуноморфогенез в глоточных миндалинах 80
3.2.2.3. Иммуноморфогенез в нижнечелюстных лимфатических узлах 81
3.2.2.4 Иммуноморфогенез в селезенке 84
3.2.2.5. Иммуноморфогенез в брыжеечных лимфатических узлах 86
3.2.2.6. Иммуноморфогенез в лимфоидной ткани кишечника 88
3.3. Сравнительный анализ результатов иммунного ответа у песцов, полученных
после вакцинации против сальмонеллеза разными способами 93
4. Обсуждение результатов исследований 108
5. Выводы 122
6. Список литературы
- Морфология иммунной системы млекопитающих
- Методы исследований
- Результаты гематологических, биохимических, серологических и иммунологических исследований
- Иммуноморфогенез в селезенке
Введение к работе
Актуальность темы. Борьба с сальмонеллёзом всегда была важной и актуальной задачей, а в последнее время сальмонеллёзная инфекция широко распространена среди сельскохозяйственных животных, птицы и пушных зверей и имеет тенденцию к дальнейшему росту (Г.Ф. Коромыслов, 1995; А.В. Жаров, Е.В. Зимина, 2001; И.А. Домский , 2003, 2004; А.Н. Панин, 2006; О.В. Мерзленко, 2006; G. Baljer, 1984; К. Berger, 1985; В.Р. Smith, 1986; К. Nordstoga, 1992).
По данным B.C. Слугина (2004), переболевшие сальмонеллёзом звери в 85% случаев остаются бактерионосителями. В связи с этим, большое значение имеют мероприятия, направленные на своевременную специфическую профилактику, снижение и ликвидацию потерь животных от сальмонеллёза.
В последние годы в России и за рубежом для профилактики сальмонеллёза сельскохозяйственных животных и птицы все чаще применяют аттенуированные штаммы сальмонелл (Б.Ю. Шустер, 1988; Б.Ю. Шустер с соавт., 1994; V.L. Cooper. 1989; К. Onoznka, 1989; М. Nakamura, 1985).
В целях совершенствования профилактических сальмонеллёзных препаратов, применяющихся в звероводстве, были использованы вакцины на основе аттенуированных штаммов сальмонелл и с успехом испытаны на пушных зверях (И.А. Домский, А.Н. Кульминский, 2000; И.А. Домский, 2002, 2003; З.Н. Бельтюкова, 2006).
Применение вакцины из аттенуированных штаммов сальмонелл позволило апробировать разные способы ее введения животным, в том числе и пероральный. Указанный способ широко применяется для иммунизации человека и сельскохозяйственных животных (В.В. Никольский, 1968; А.А. Воробьев, 1973; А.В. Гайдамака, 1990; B.C. Прудников, 1991; H.I. Rettig, 1971; P. Porter et al., 1975; G. Borsch, 1984; G. Bulger e.a., 1986). Более того, в ходе научных исследований был предложен и комбинированный способ, представляющий сочетание перорального и парентерального способов введения антигенов, что позволяет вовлечь в иммунологический процесс большее количество участков лимфоидной системы и обеспечить более напряженный иммунитет (А. Н. Мешалова, 1974; В. П. Бойко, 1977; Б.Б. Перший, 1980).
Таким образом, разработка новых средств и способов специфической профилактики и их внедрение в практику требует всестороннего изучения изменений, происходящих в организме животного в поствакцинальный период. Оценка состояния органов иммунной системы после иммунизации заключается в выявлении специфических иммунных процессов, происходящих в организме животного после введения антигенов.
После иммунизации в органах иммунной системы возникает ряд иммуноморфологических изменений, с которыми связывают естественную резистентность, постинфекционный и поствакцинальный иммуногенез (СИ. Гинзбург-Кашнина, 1960; П.Ф. Здрадовский, 1963, 1969; Ф. Бернет, 1971; К.М. Батуев, 1979; Б.Б. Перший, 1980; Ю.А. Бородин с соавт., 1987; A. Fioretti, 1961).
В доступной нам литературе сведений об иммуноморфологических исследованиях пушных зверей после иммунизации мы не обнаружили. Получение данных, характеризующих иммуногенную активность вакцинного препарата совместно с изучением иммуноморфологических изменений в органах иммунной
системы песцов при вакцинации, является актуальным и важным направлением в изучении поствакцинального иммуноморфогенеза.
Основанием для выполнения исследований явилось соответствующее задание Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия России (письмо № 13-4-19/266 от 17.04.1996 г.), а также программа фундаментальных и приоритетных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2001-2005 г.г., 2006-2010 г.г., программы и планы научно-исследовательских работ ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт охотничьего хозяйства и звероводства им. проф. Б.М. Житкова Российской академии сельскохозяйственных наук.
Цель и задачи исследования. Цель - изучение иммуноморфогенеза у песцов, вакцинированных разными способами против сальмонеллёза вакциной, содержащей аттенуированные штаммы сальмонелл.
Задачи:
Изучить иммунологические процессы у песцов, вакцинированных против сальмонеллёза.
Изучить иммуноморфогенез у песцов после вакцинации.
Провести сравнительный анализ результатов иммунного ответа у песцов, полученных после вакцинации против сальмонеллёза разными способами.
Дать научно обоснованные рекомендации по вакцинации зверей против сальмонеллёза в ветеринарной практике звероводства.
Научная новизна. Впервые получены комплексные данные, характеризующие иммунологические и морфологические процессы в организме песцов, вакцинированных против сальмонеллёза, вакциной из аттенуированных штаммов сальмонелл. В динамике показаны гематологические, биохимические, серологические, иммунологические, морфологические и морфометрические изменения в органах иммунной системы зверей после вакцинации. Впервые проведены иммуногистохимические исследования с использованием маркеров Polyclonal Rabbit Anti - Human к CD} T- клеток.
Практическая значимость. На основании проведенных исследований изучены процессы иммуноморфогенеза в организме песцов, вакцинированных разными способами, и даны рекомендации по их практическому применению в ветеринарной практике звероводства. Полученные данные могут быть использованы в практической иммунологии и морфологии как дополнительные методы лабораторной оценки поствакцинального иммунитета для более объективной оценки реактогенности, безвредности и иммуногенной активности вакцинных препаратов и способов их введения.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на следующих конференциях и совещаниях: на Международной научно-практической конференции //Теоретические и практические вопросы ветеринарной медицины/, посвящ. 90-летию со дня рожд. д-ра вет. наук, проф. В.А. Лыжиной (Киров, 2007); на II Международной научно-практической конференции //Вопросы физиологии, содержания, кормопроизводства и кормления, селекции с-х животных, биологии пушных зверей и птиц, охотоведения/ (Киров, 2008); на Международной научно-практической
конференции //Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях/ (Воронеж, 2008); на межлабораторном научно-производственном совещании отдела звероводства (Киров, 2009).
Основные положения, выносимые на защиту:
- результаты иммунологических исследований, характеризующие
поствакцинальный иммунитет;
результаты иммуноморфогенеза в органах иммунной системы у песцов после вакцинации;
результаты сравнительного анализа поствакцинальных изменений при разных способах введения вакцины.
Публикации. Диссертантом по теме диссертации опубликованы 5 научных работ, в которых изложены основные результаты проведенных исследований. Работы опубликованы в материалах международных научных конференций, а также в научных изданиях, рекомендуемых ВАК РФ (2 публикации).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 146 страницах печатного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, практических предложений, списка используемой литературы. Работа проиллюстрирована 24 таблицами, 54 рисунками (из них 39 фотографий). Список используемой литературы включает 236 источников, в том числе 52 на иностранных языках.
Морфология иммунной системы млекопитающих
В последнее время во многих регионах России отмечен неблагоприятный характер развития эпидемической и эпизоотической обстановки в отношении сальмонеллеза (92Г. Коромыслов, 1995; 72А.В.Жаров, Е.В.Зимина, 2001).
По литературным данным общие потери по причине желудочно-кишечных болезней, сопровождающихся диареей, в течение многих лет составляют около 50% от общего падежа (66В.В. Субботин, 2005). В пушном звероводстве эта проблема является достаточно актуальной. По последним данным Департамента ветеринарии МСХ РФ (105А.М. Литвинов, 1998), 60-90% всех зарегистрированных болезней пушных зверей - болезни алиментарного происхождения, причиной возникновения которых является отсутствие необходимой сортировки поступаемых кормов, некачественная термическая обработка условно годных продуктов, нарушение условий их хранения и переработки, несоблюдение ветеринарно-санитарных правил.
Высокая смертность заболевших, большие затраты на лечение больных животных, проведение лечебных и профилактических мероприятий наносит хозяйствам огромный ущерб (,06С.Я. Любашенко,1962; 152В.П. Рютова, 1970; 29И.А. Болотников, 1982; 10 11А.М. Ахмедов, 1971,1983; 58Е.П. Данилов, 1984; ,82В.А.Чижов, 1984; 127С.Г. Пак, 1988; 160Лбиб2В.С. Слугин, 1985,2003,2004).
Распространению сальмонеллеза способствует возрастание субклинических и латентных форм заболевания, инфицированность кормов, воды и окружающей среды, разные пути внедрения возбудителя в организм животного, селекция и циркуляция штаммов несущих R- факторы, формирующиеся под влиянием антибиотиков и химиопрепаратов Возбудитель сальмонеллеза относится к семейству энтеробактерий (Enlerobacteriaceae), роду сальмонелл (Salmonella), подразделяющемуся на основании ДНК - ДНК гибридизации на два вида: Sal. enterica (энтерика) и Sal. bongori (бонгори). С помощью определения устойчивости гибридов к температуре S. enterica разделена на 6 подвидов ( Л.Я. Ряпис с соавт. 1995; L.Le Minor M.Y. Popov (1987), Сборник санитарных и ветеринарных правил, 1966). По данным 11 Л,50Л.М. Рабочей (1986), штаммы сальмонелл, выделенные от пушных зверей, по свойствам не отличаются от выделенных от сельскохозяйственных животных. Вид сальмонелл, поражающих пушных зверей, может меняться в зависимости от происхождения и бактериальной загрязненности используемых кормов (" Берестов В.А. 1987; 245F. Ulbrich, 2001; 244W.Tschirch, 2001).
Установлено, что сальмонеллы являются межклеточными и факультативно внутриклеточными паразитами. Их высокая агрессивность и способность к длительному персистированию является следствием полидетерминантности факторов вирулентности, обусловленных плазмидными и хромосомными генами. Для возбудителей заболевания характерна высокая степень изменчивости патогенных, морфологических, культуральных и антигенных свойств ( М.Я. Ярцев,1996; 34Н.Б. Бушуева, 1997; 30В.М. Бондаренко с соавт. 2002; 3,0А. Fioretti, 1961).
При бактериологических обследованиях трупов павших пушных зверей, проводимых во ГНУ ВНИИОЗ, сальмонеллы выделяются более чем в 20% случаев, при этом чаще всего выделяют Sal. dublin - 60%; реже Sal. t. murium, Sal. h. suis и др. Эти результаты согласуются с данными, полученными в НИИПЗК. По данным 68В.А. Есепёнка (1998) исследовавшего патматериал от нутрий, сальмонеллы высевали от взрослых животных в 22,9 % случаях, у молодняка - 50 %.
Сальмонеллы проявляют устойчивость к температуре 60-75 С, к солями высоких концентраций и некоторым кислотам. К действию низких температур сальмонеллы также устойчивы, агаровые культуры Sal. cholerae suis не погибают при температуре -0 С в течение 142 дней, а при -10 С в течение 115 дней. Изучение действия ультрафиолетовых лучей на сальмонеллы показало, что под влиянием УФ-лучей Sal. dublin, Sal. cholerae suis теряют не только токсигенность, но и возможность агглютинироваться специфическими сыворотками. Важно отметить, что сальмонеллы обладают способностью длительное время сохранять жизнеспособность в различных почвах и воде, загрязненной даже небольшим количеством фекалий и других органических веществ, прежде всего белковых. Жизнеспособность в почве сальмонеллы сохраняют от 20 до 130 суток, в трупах до 100 суток (182В.А.Чижов, 1984).
Сальмонеллез как самостоятельное заболевание у песцов впервые был описан С.Я. Любашенко в 1933 г. По данным 1 )6 107С.Я. Любашенко (1955,1962) к спонтанному заражению сальмонеллезом наиболее восприимчивы серебристо-черные лисицы, песцы и нутрии; более устойчивы - еноты, соболи, норки и бобры. Заражение пушных зверей сальмонеллезом чаще всего происходит через пищеварительный тракт при скармливании инфицированного корма. Нередко причиной возникновения сальмонеллеза служат занос в хозяйство больных и переболевших животных-бактерионосителей. Ежегодные небольшие вспышки сальмонеллеза на отдельных звероводческих фермах, растягивающиеся с перерывом на 1-2 месяца и больше, указывают на то, что причиной повторного возникновения болезни служат сами звери-бактерионосители. По данным B.C. Слугина (1602004), переболевшие сальмонеллезом звери в 85% случаев остаются бактерионосителями. Вспышки сальмонеллеза у пушных зверей регистрируют от начала апреля до конца сентября. На некоторых фермах в этих группах животных смертность достигает до 30%.
В связи с этим, важное значение приобретают мероприятия, направленные на своевременную специфическую профилактику, снижение и ликвидацию потерь от таких инфекционных болезней, как сальмонеллез пушных зверей. Профилактика сальмонеллезной инфекции, особенно у крупного зверя (песец), при складывающейся в настоящее время технологических особенностях содержания и кормления пушных зверей является важной актуальной практической задачей. Специфическая профилактика сальмонеллеза была разработана в 1931 году С.Н. Вышеловским, но эффективность ее остается недостаточной (16(,,162В.С. Слугин, 2003,2004). За этот период в нашей стране широко апробировались различные варианты убитых и живых вакцинных препаратов (10А.М. Ахмедов, 1983).
Наибольшее распространение в отечественном звероводстве получила поливалентная формолтиомерсановая вакцина против сальмонеллеза и колибактериоза молодняка сельскохозяйственных животных и пушных зверей, предложенная 106С.-Я. Любашенко (1962).
Позднее появилось еще несколько вариантов поливакцин: а) ассоциированная инактивированная вакцина против острых кишечных инфекций (колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиелоза и протейной инфекции) телят, поросят, ягнят, лисиц и песцов; б) ассоциированная вакцина для лисиц, песцов и енотов (60И.А. Домский с соавт. 2003). Многолетний опыт применения инактивированных вакцин свидетельствует о низкой эффективности инактивированных препаратов для профилактики сальмонеллеза ( В.В. Макаров с соавт. 1994). Это можно обьяснить тем, что сальмонеллезные антигены, находясь в организме иммунизированных животных, не способны размножаться и реплицироваться, что требует многократных прививок, введения больших доз вакцинных препаратов, что нередко обуславливает высокую реактогенность убитых вакцин (,91П.Я Щербатых, П.Ф. Сонин, 1974; 88Н.К. Кириллов, 1994).
Методы исследований
На рис. 2 видно, что уже на 7-й день после введения вакцины в сыворотке крови вакцинированных песцов увеличился титр специфических антител-агглютининов к сальмонеллезу в 20 раз (320,0) по сравнению с контрольной группой. Максимального значения показатель антител-агглютининов в РА достигает на 14-й день после исследования, что в 33 раза (403,17) выше, чем в контроле (11,89). На 21-й и 28-й дни исследования показатели титров антител в опытной группе снижались, оставаясь в 10 раз выше показателя контрольной группы. В контрольной группе песцов титры антител во все сроки исследований оставались на уровне от 10-17. В итоге установлено, что вакцинный препарат на основе живых аттенуированных штаммов сальмонелл у иммунизированных песцов активно стимулирует процесс формирования специфических антител.
Иммунологические исследования. Другим важным показателем иммунного процесса является фагоцитарная активность лейкоцитов. Данные об активности фагоцитоза в период иммунного ответа вакцинированных песцов представлены на рисунке 3. Динамика опсоно-фагоцитарной активности нейтрофилов наглядно отражает взаимодействие макрорганизма с микробом-возбудителем инфекционного заболевания в течение всего срока исследований.
Показатели рисунка 3 свидетельствуют о достоверном повышении фагоцитарной активности стимулированных иммунным процессом лейкоцитов в группе вакцинированных животных в течение 21 дня после иммунизации. Самый высокий показатель Штритера в опсоно-фагоцитарной реакции максимальных значений достиг у зверей опытной группы уже на 7-й день после иммунизации на 80% и составил 30,0±1,2 (Р 0,001), в сравнении с контролем (17,5±0,33), затем происходит снижение его значений. Через 28 дней после иммунизации животных активность фагоцитоза снизилась до уровня показателей контрольной группы. Очевидно, что факторы клеточного иммунитета включаются в иммунный процесс быстрее, чем гуморальные. В даннм случае показатель фагоцитарной активности нейтрофилов можно считать специфическим, так как при постановке реакции ОФР использовали в качестве тест объекта микрооганизма вирулентный штамм Salmonella typhimurium №371 Иммуноморфогенез у песцов после пероральной иммунизации 3.1.2.1. Иммуноморфогенез в тимусе
При гистологическом изучении строения тимуса у песцов после вакцинации наблюдали четкое деление органа на дольки (рис. 4 а). Корковая зона тимуса окрашена более насыщенно, так как в субкапсулярном слое тимоциты расположены очень плотно. Мозговое вещество более светлое и занимает центральную часть долек. При проведении морфометрии гистологических срезов отмечали, что через 7 дней после иммунизации ширина коркового слоя тимуса по сравнению с контролем увеличена в 1,4 раза (Р 0,01), а количество лимфоцитов (выраженное в рядах клеток) увеличилось в 1,3 раза (Р 0,01) (рис. 4 б), то есть происходит усиление пролиферации Т-клеток. При иммуногистохимическом исследовании к CD3, Т- клеток, установлена положительная реакция (слабоположительную реакцию в контроле). Т- клетки скапливались как в корковом, так и в мозговом веществе тимуса (рис. 5).
На 14-й день после вакцинации песцов ширина мозгового слоя увеличена в 1,3 раза (Р 0,001)(табл. 3). В мозговой зоне тимуса наблюдали увеличение количество лимфоцитов в 1,3 раза (Р 0,001), увеличение телец Гассаля в 1,2 раза (Р 0,01), (табл. 4). В последующие сроки при иммуноморфологическом исследовании тимуса отмечено, что количество лимфоцитов, как в корковой, так и в мозговой зоне долек тимуса существенно уменьшилось, что свидетельствует об активной миграции клеток за пределы органа. Анализируя полученные данные, можно сделать заключение, что пероральная иммунизация песцов живой вакциной оказывает выраженное иммуностимулирующее действие на корково-мозговую часть тимуса.
Иммуноморфогенез в глоточных миндалинах При гистологическом исследовании глоточных миндалин у песцов после иммунизации против сальмонеллеза хорошо различимы дифференцирующая лимфоидная ткань и лимфодные узелки с реактивным центром (рис. 6 а). При иммуноморфологическом исследовании через 7 дней после иммунизации наблюдали, что количество лимфоидных узелков увеличилось по сравнению с контролем в 1,4 раза (Р 0,01), а их диаметр - в 1,3 раза (Р 0,001) (рис. 6 б)(табл. 5). Под капсулой и в центре лимфоидных узелков скапливались иммунобласты, число которых достоверно увеличилось в 1,3 раза (Р 0,01), (рис. 7). При иммуногистохимическом исследовании с использованием маркеров к CD3 на Т-клетки установили положительную реакцию. Т-клетки скапливались под капсулой, в межузелковом пространстве и в центре лимфоидных узелков (рис. 8).
На 14-й день после вакцинации песцов в межузелковом пространстве глоточных миндалин отмечалась плазмоцитарная реакция, характеризующаяся увеличением количества плазмобластов, незрелых и зрелых плазмоцитов, количество которых по сравнению с контрольной группой животных увеличилось в 1,4 раза (Р 0,001). В последующие сроки исследований после иммунизации эти показатели снижались (табл.6).
Результаты гематологических, биохимических, серологических и иммунологических исследований
На 14-й день после иммунизации зверей в стенке собственной пластинки толстой кишки число клеточных элементов возросло, из них основную массу клеток представляли плазмобласты в стенке слепой кишки их число увеличилось в 1,9 раза (Р 0,001), ободочной кишки - в 2,5 раза (Р 0,001), прямой кишки - в 1,5 раза (Р 0,01). Через 21 день после вакцинации песцов наблюдали, что в собственной пластинке слизистой оболочки по сравнению с контролем увеличилось количество незрелых плазмоцитов - в слепой кишке в 1,9 раза (Р 0,001), ободочной кишке - в 2 раза, прямой кишке - в 1,8 раза (Р 0,001). Через 28 дней после вакцинации песцов в лимфоидной ткани толстой кишки отмечали выраженную плазмоцитарную реакцию. Количество зрелых плазмоцитов в стенке слепой и ободочной кишок увеличилось в 1,9 раза (Р 0,001), прямой кишке - в 1,5 раза (Р 0,001). Максимальное увеличение количества зрелых плазмоцитов отмечали через 28 дней после вакцинации зверей в стенке слепой кишки - в 2,3 раза (Р 0,001), ободочной кишки -в 2,4 раза (Р 0,001), прямой кишки -в 1,8 раза по сравнению с показателями контрольной группы (табл. 28). Из результатов исследований следует, что внутримышечная вакцинация песцов против сальмонеллеза вызывает в лимфоидной ткани толстой кишки клеточную пролиферацию слизистой оболочки, десквамацию энтероцитов Сравнительный анализ результатов иммунного ответа у песцов, полученных после вакцинации против сальмонеллеза разными способами
Результаты гематологических исследований. На рис. 31 видим, что на 14-й день после вакцинации общее количество лейкоцитов в крови песцов иммунизированных комбинированным способом по сравнению с животными, привитыми пероральным способом, больше на 9 %. Далее на 21-й 28-й дни последовало их снижение и выравнивание их количества в обеих группах. 9
Результаты биохимических исследований. Показатели гуморальных факторов у вакцинированных животных достоверно выше, чем в контрольной группе. Доказательством этого является повышение в обеих опытных группах количества 7- глобулинов в сыворотке крови, которое увеличились через 14 дней после иммунизации песцов, особенно в группе животных, вакцинированных комбинированным способом на 97 % (Р 0,01). После пероральнои иммунизации эти показатели ниже на 20 % (рис. 33). /
Динамика лизоцимной активности сыворотки крови у песцов после вакцинации живой вакциной разными способами Результаты серологических исследований. Динамика титров антител-агглютининов в сыворотке крови у песцов после иммунизации представлена на риунке 35. Данные исследований показывают, что при пероральной иммунизации титры антител в сыворотке крови почти достигают титров, наблюдаемых после комбинированной иммунизации. Титры антител в сыворотке крови песцов, вакцинированных пероральным способом, уже на 7-й день увеличивались на 41 % по сравниванию с комбинированным способом. Только на 14-й день после иммунизации комбинированным способом показатели становились на 12 % выше, чем при пероральном способе вакцинации. В последующие дни после вакцинации титры снизились в обеих опытных группах.
Динамика титров антител-агглютининов в сыворотке крови у песцов после иммунизации живой вакциной разными способами Результаты иммунологических исследований. Результаты сравнительных данных представлены на рисунке 36. Фагоцитарная активность нейтрофилов достоверно увеличивается на 7-й день после вакцинации в обеих опытных группах, но после комбинированного способа вакцинации показатель Штритера в ОФР на J5% был выше, чем при пероральной иммунизации, что подтверждает достаточно ярко выраженную реакцию клеточного иммунитета на вирулентный возбудитель
В мозговом слое телец Гассаля на 6 %, лимфоцитов - на 11 % больше чем при пероральном способе иммунизации. Через 14 дней после иммунизации зверей количество лимфоцитов как в корковом, так и в мозговом слое уменьшилось, что свидетельствует об активной миграции клеток за пределы органа. При комбинированном способе введения вакцинных штаммов сальмонелл установлено формирование в корково-мозговой зоне тимуса лимфоидных узелков и гиперемия междольковых и субкапсулярных сосудов (рис. 39).
При обоих способах вакцинации песцов при иммуногистохимическом исследовании тимуса при исследовании с использованием маркеров к CD3 Т-клетки, отмечали их накапливание. Из результатов исследований следует, что живая вакцина оказывает выраженное иммуностимулирующее действие на корково-мозговую часть тимуса.
При морфометрическом исследовании глоточных миндалин наблюдали, что после пероральной иммунизации диаметр лимфоидных узелков шире на 6 % (рис. 40), число иммунобластов больше на 11% (рис. 41), количество зрелых плазмоцитов - на 16 % (рис. 42), чем после комбинированного способа вакцинации. При комбинированном способе иммунизации отмечали межузелковую гиперемию.
При комбинированном способе иммунизации в нижнечелюстных лимфатических узлах ширина корковой зоны шире на 8 %, чем при пероральном способе вакцинации песцов (рис. 43). Количество вторичных лимфоидных узелков больше на 37 % (рис. 44), число иммунобластов - на 6 % (рис. 45), количество плазмобластов - на 5%, зрелых плазмоцитов - на 16 % (рис. 46), чем после перорального способа вакцинации. При комбинированном способе вакцинации отмечали гиперемию, диапедез эритроцитов.
При проведении морфометрии селезенки после комбинированного способа вакцинации отмечали, что количество вторичных лимфоидных узелков больше на 15% (рис. 47). При иммуноморфологическом исследовании селезенки после комбинированного способа иммунизации зверей отмечали, что количество иммунобластов больше на 38 % (рис. 48), плазмобластов - на 44 %, незрелых плазмоцитов - на 9 %, зрелых плазмоцитов - на 8 % (рис. 49) по сравнению с пероральным способом иммунизации. Из полученных результатов следует, что при комбинированном способе вакцинации антиген непосредственно попадает в кровь и лимфу, вызывая выраженные иммуноморфологические изменения в лимфатические узлах и селезенке, чем после пероральной иммунизации песцов.
Иммуноморфогенез в селезенке
Подобные изученные нами иммуноморфологические процессы в органах иммунитета у песцов после вакцинации против сальмонеллеза также отмечали б7В.Н. Дроздов (1965), 19XD.Barbieri (1968), которые были получены ими при иммунизации животных против сальмонеллеза и других инфекций.
Наши результаты исследований у песцов после иммунизации их вакциной из аттенуированных штаммов сальмонелл совпадают с выводами И.Н. Громова (2000), который изучал иммуноморфогенез в органах иммунной системы птиц при пероральной вакцинации против болезни Гамборо сухими живыми вирус-вакцинами из штамма «Винтерфильд 3512» и из штамма «Д 78». Он отмечал в тимусе расширение корковой и мозговой зоны долек, а также снижение плотности расположения тимоцитов в них. В пищеводной миндалине им отмечено достоверное возрастание плазмобластов и незрелых плазмоцитов по сравнению с контролем. В селезенке им установлено достоверное возрастание размеров лимфоидных узелков по сравнению с интактной птицей, а в стенке тонкой кишки достоверное увеличение плазмобластов в 3 раза. 5 И.Н. Громов (2000) выявил процессы дифференциации диффузной лимфоидной ткани тонкой кишки с образованием лимфоидных узелков и отмечал, что
При исследованиях иммуноморфогенеза у утят при парентеральной вакцинации живой вирус-вакциной из штамма «КМИЭВ-16» против гепатита A.M. Курилович (2003) отмечал дифференциацию паренхимы долек тимуса на корковое и мозговое вещество, что свидетельствовало о его морфологической зрелости. В селезенке им отмечены увеличение числа плазмобластов в 1,2 раза, незрелых плазмоцитов - в 1,5 раза, а также максимальный уровень антител в сыворотке крови птиц на 14-й день после вакцинации.
При иммуногистохимическом исследовании под капсулой, в межузелковом пространстве и в центре лимфоидных узелков глоточных миндалин, а также в паракортикальной зоне лимфоидных узелков нижнечелюстных лимфатических узлов и в периатрериальной зоне лимфоидных узелков селезенки, в красной пульпе с использованием маркеров к CD3 (это рецепторы ко всем Т- лимфоцитам независимо от их принадлежности и степени дифференцировки) получена положительная реакция. Из полученных результатов исследований следует, что вакцинация песцов живой вакциной вызывает в органах иммунной системы оптимальные условия для пролиферации, дифференцировки и селекции субпопуляций Т- клеток.
Вакцинный препарат созданный на основе живых аттенуированных штаммов сальмонелл активно стимулирует у иммунизированных песцов процесс формирования специфических антител.
Комбинированный способ вакцинации показал, что в иммунологический процесс вовлекается большее количество участков лимфоидной системы, что, по мнению 33В. П. Бойко (1977), должно обеспечить более надежную иммуногенную эффективность.
При пероральной иммунизации живые микроорганизмы проникают в лимфатические узлы кишечника и стимулируют гуморальный, клеточный местный иммунитет. В результате пероральной иммунизации отмечено, что иммунный ответ по своей активности и продолжительности не уступает иммунитету, полученному после комбинированной иммунизации.
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что при вакцинации песцов вакциной из аттенуированных штаммов сальмонелл разными способами в тимусе, глоточных миндалинах, нижнечелюстных и брыжеечных лимфатических узлах, в селезенке и в лимфоидной ткани кишечника развивались выраженные иммуноморфологические изменения. Основой формирования иммунитета является активация клеточных механизмов защиты, проявляющаяся увеличением количества иммунобластов в органах иммунной системы через 7 дней после вакцинации и увеличением в эти сроки фагоцитарной активности нейтрофилов. На 14- и 21-й дни после иммунизации в органах иммунитета увеличилось количество проплазмоцитов и плазмоцитов, являющихся основными продуцентами антител, что напрямую связано с повышением титра специфических антител в сыворотке крови в эти сроки. По данным Международного Эпизоотического Бюро (МЭБ), реакция агглютинации (РА) является основным методом оценки поствакцинального сальмонеллезного иммунитета (В.Н.Федосеева, 1993) и характеризует его напряженность.
Обобщая полученные результаты, важно отметить, что впервые получены комплексные иммунологические, иммуноморфологические, морфометрические и иммму но гистохимические данные, характеризующие иммунные процессы в организме пушных зверей после иммунизации вакциной из аттенуированных штаммов сальмонелл при применении разных способов вакцинации. Полученные данные позволили глубже изучить процессы формирования иммунитета у зверей. В итоге получены научно обоснованные результаты, на основании которых даны предложения по внедрению новых способов иммунизации пушных зверей в ветеринарной практике звероводства. А также полученные данные могут быть использованы для совершенствования методов иммунологического контроля вакцинного препарата. Проведенные опыты показали, что пероральная
После пероральной двукратной и комбинированной вакцинации песцов против сальмонеллеза, вакциной из аттенуированных штаммов сальмонелл на 7-14 день наблюдалась активизация клеточного иммунитета, которая сопровождалась лейкоцитозом и лифмоцитозом, увеличением фагоцитарной активности нейтрофилов (Р 0,001).
В глоточных миндалинах, нижнечелюстных и брыжеечных лимфатических узлах, селезенке, лимфоидной ткани кишечника отмечена гиперплазия лимфоидных узелков, увеличение количества иммунобластов (Р 0,001).
При иммуногистохимическом исследовании отмечено скопление Т-клеток в тимусе, в межузелковом пространстве глоточных миндалин, в паракортикальной зоне лимфоидных узелков лимфатических узлов, в периартериальной зоне и в красной пульпе селезенки.
Через 14-21 день после пероральной и комбинированной иммунизации песцов живой вакциной активизировались гуморальные факторы защиты. Титры специфических антител-агглютининов в сыворотке крови стали в 33-38 раз выше, чем в контроле (Р 0,001). Увеличилось содержание общего белка и его у- и (3- глобулиновых фракций (Р 0,001), повышалась лизоцимная активность сыворотки крови (Р 0,05), а также в глоточных миндалинах, в нижнечелюстных и брыжеечных лимфатических узлах, селезенке и лимфоидной ткани кишечника увеличилось количество незрелых и зрелых плазмоцитов (Р 0,001), что напрямую связано с повышением титра специфических антител в сыворотке крови в эти сроки.
После 21 дня вакцинации песцов отмечали уменьшение количества лимфоцитов и лейкоцитов, содержания общего белка и его у- и (3- глобулинов. Падала лизоцимная активность сыворотки крови, снижался показатель Штритера в опсоно-фагоцитарной реакции. Активность антителообразования снизилась, но оставалась выше показателей контрольной группы. В органах иммунной системы уменьшилось количество иммунокомпетентных клеток. Через 28 дней после иммунизации показатели становились практически равными контрольным, что можно расценить как проявление гомеостаза.
Наиболее выраженные иммунные реакции в организме зверей происходили в результате введения вакцины комбинированным способом по сравнению с пероральпым применением. Общее число лейкоцитов было больше на 31 %, лимфоцитов - на 1,5 %, показатель в ОФР увеличивался на 35%, титры антител -агглютининов - на 12%, количество у- глобулинов - на 20%.
Количество лимфоцитов в корковом слое тимуса было больше на 7 %, в мозговом слое - на 11 %, телец Гассаля - на 6 %; в нижнечелюстных лимфатических узлах число иммунобластов - на 6 %, число плазмобластов на 9%, зрелых плазмоцитов - на 17 %; в селезенке количество иммунобластов - на 38 %, плазмобластов - на 44 %, незрелых плазмоцитов - на 9 %, зрелых плазмоцитов - на 8 %; в стенке тощей кишки количество иммунобластов - на 18,6%, зрелых плазмоцитов - на 11%; в стенке слепой кишки количество иммунобластов - па 10%, зрелых плазмоцитов - на 48%. иммунобластов на 6-38%, плазмобластов - на 9-44 %, зрелых плазмоцитов - на 8-48%.
При комбинированном способе иммунизации по сравнению с пероральным в нижнечелюстных и брыжеечных лимфатических узлах отмечался диапедез эритроцитов и гиперемия в краевых, промежуточных и мозговых синусах, в стенках тонкой и толстой кишок - очаговая десквамация покровного эпителия верхушек ворсинок. В тимусе происходило формирование лимфоидных узелков и гиперемия междольковых и субкапсулярных сосудов.
Установлено, что комбинированный способ вакцинации обеспечивает более надежную иммуногенную эффективность, но является более трудоемким процессом и более реактогенен для организма зверей.
Пероральная иммунизация является слабореактогенной и безвредной, а иммунный ответ по своей активности и продолжительности не уступает иммунитету, полученному после комбинированной иммунизации.