Особенности патогенеза и иммунокоррекции хронического афлатоксикоза ВI и бензольной интоксикации цыплят Деревнина, Оксана Николаевна

Введение к работе

Актуальность исследования. Афлатоксиновая и бензольная интоксикации чаще протекают в хронической форме, развиваясь при воздействии на организм малых доз токсинов /0.0025-0,05 мг/кг ц 44,0-200.0 мг/кг массы соответственно/ и вызывают, по мнению большинства исследователей "/ Pier , 1981; Захаров и др, 1990/, ослабление именной системы. Названные токсины играют важную роль в патологии животных и'человека, поскольку способны поражать большинство видов млекопитающих, птиц, рыб и других представителей животного мира /Гусман, 1970; Тутельян, 1985/. Афлатоксяны и бензол высоко токсичны и канцерогенны. Наиболее токсичен афлатоксин Bj / w'ograa , 1971/.

Для-коррекции патологических состояний, индуцируемых бензолом или анатоксином Bj,- актуальным является изучение особенностей патогенеза этих процессов, выявление причин снижения иммунологической реактивности организма, в частности установление долевого участия иммунной системы в развитии хронического афлатоксикоза В^ и бензольной интоксикации.

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования -изучение особенностей-патогенеза хронического афлатоксикоза Bj и бензольной интоксикации, анализ механизмов вовлечения иммунной системы в патологический процесс, в частности, установление корреляции изменений в иммунной системе в зависимости от изменений в белковом обмене печени. Оценка иммунокоррегирукщих свойств аминокислотных препаратов.

Для выяснения сходств и различий в механизмах развития афлатоксикоза Bj и бензольной интоксикации у млекопитающих и птиц опыты проводились на разных видах животных: мышах и цыплятах.

Для достижения поставленной Цели решались следующие задачи:

1. Изучить действие малых доз афлатоксина Bj, бензола, аминокислотных препаратов авиамина, церебролйзина на иммунный ответ, содержание общего белка и альбуминов в зависимости от продолжительности скармливания с оценкой корректирующих возможностей аминокислотных препаратов.

2. Изучить влияние малых доз афлатоксина Bj, бензола, авиамина и церебролйзина на фагоцитарный показатель й показатель завершенности фагоцитоза в зависимости от продолжительности аппликации препаратов.

3. Изучить механизмы действия малых доз афлатоксина Bj, бензола и различных доз аминокислотных препаратов на иммунную систему: а/, установить зависимость изменений в показателях специфической в неспецифической резистентности на разных-сроках после воздействия

малых доз яфлатоксииа Вт, бензола или разных доз аминокислотных препаратов от содержания в сыворотке общего белка и альбуминов; б/, сравнительно исследовать способность низких, нетоксичных для клеток концентраций афлатоксина Вт, бензола и аминокислотных irpe-ратов, индуцировать in.vitro экспрессию на костномозговых Т-пред-шоственнкках основного маркера зрелых Т-клеток Thy-1-антигена; в/, проанализировать .возможность воздействия малых доз афлатокснне Бт и бензола на иммунный ответ путем активации цитокинов гранулоцитові г/, устшіовйть зависимость содержания лизосомально-катионнь белков в (фагоцитах и степенью завершенности фагоцитоза. Основные положения, пьшоенуые на защиту.

4. Хронический афлатоксикоз Вт и бензольная интоксикация, ищу цированные мачмми дозами токсинов, протекают двуфазно. В начальный /15 дневный/ период интоксикации афлатоксин В- и бензол активируют Т-систему иммунитета, что проявляется в стимуляции тимуеза-вкеймого иммунного ответа. При втом действие токсинов на фагоцита] лый показатель гранулоцитов неоднозначно: афлатоксин Вт увеличивает, а бензол не изменяет его.

5. На поздней стадии интоксикации- оба токсина снижают показатели специфической и кеспоцифичоской резистентности. Угнетение анатоксином Б_т, но не бензолом,иммунного ответа и показателя за-воршвнности Ф-агоцитоза коррелирует со снижением концентрации белковых фракций крови.

6. Авиамин, независимо от дозы не нормализует сниженных при афлатоксикозо Вт иммуко- биохимических показателей, а при хронической бензольной интоксикации препарат высоко эффективен.

Научная, новизна. Впервые показано, что афлатоксин Ь- и бензо. в малых дозах в нача..ыш;1 период -интоксикации, аналогично малым дозам аминокислотных препаратов стимулируют ткмуезависимый, но не влияют на тимуснозавнедмий иммунный ответ. Мёхшо1змы~иммуноетиму^ ляціш токсинами и шли нокислотными препаратами различаются. Аминокислотные препараты усиливают иммунный ответ путем ускорения созревания Т-предщуственников. Трксины подобным свойством не облада-г-ют. Иммуностимулящія токсинами осуществляется преимущественно путем Т-клоточного перераспределения. В регуляции иммунного ответа при хроническом а(латоксккозе Вт, но не бензольной интоксикации, участвуют цитокины гранулоцитов.

Угнетение специфических и неспецифичееккх показателей резисте ности анатоксином Вт, по не бензоло,/,,коррелирует с и.чгийирование белкового обмена в печени.

Авиаглин и церебролизин обладают не только иммуно.-фагоцитоамо-'дулирувщими, но^: и антитоксическими свойствами. Пммуномодулирующая активность аминокислотных препаратов в норме и патологии различается.

Теоретическое и практическое значение. Впервые установлено,.что ингибирование афяатоксином By функциональной активности Т-системн иммунитета'коррелирует"С угнетением белкового обмена перони. Показано, что иммуностимулирующая и трофическая функция а?дшокислотннх препаратов обратнозависюлы: авиации и церебролизин в малих дозах стимулируют иммунный ответ, а в большей, трофической дозе, но влияют или даже подавляют его, не изменяя фагоцитарной активности гра-нулоцитов. Работа имеет и практическую значимость. Полученные результати важны при разработке методологических подходов в вопросах профилактики, лечения хроническогоафшатоксккоза 3j и бензольной интоксикации.

.-Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации доложё-нн и обсуждены на втором и третьем Симпозиумах по проблеме загрязнения окружающей среды Центральной и Восточной Европы/Будапешт, 20-23 сентября 1994г., Варшава, 10-13 сентября 1996г./, конференции молодых-физиологов и биохимиков России /С.-Петербург, 21-23 сентября 1995г./, Ученом Совете Б1ШШІ /С.-Петербург, 28 декабря 1994г и 6 июня 1996г./, Методическом Совете кафедру биохимии Петербургского Государственного Университета /21 июня 1996г./.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, 2 статьи приняты к печати.

Структура и обьам диссертации. Диссертация содержит введение, ' обзор литэратурн, методы исследования, три главы с описанием собственных экспериментов, заключение, выводы, практические предложения, список литературы. Работа изложена на 97 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц. Библиографический указатель включает 34 отечественных и 119'зарубежных источников.

Материалы и методы исследования.

Опыты in vivo проведены на 582 мышах-самцах линии СВА, начиная с 4-х недельного возраста /масса 14-16г/, и 369 цыплятах-бройлерах, начиная'с 10-ти дневного возраста /масса 50-6Сг/. Мнгаи получены из питомника РапПслово, а цыплята - из птицефабрики Русско-Внсоокое /Россия/. Использовали препараты: афлатоксин Bj /Институт питания РАЖ, Москва/ в бензоле с.содержанием афлатоксина Bj ІЛ0"' мг/мл; бензол /'Иечп-ді" ,Венгрия/; авиамии /гядролизат крови кур, состоящий из .18"аминокислот, завод медпрепаратов, С.-Петербург/; церебролизин /гидролизат мозговой тканв,."'ЕЬате" , Австрия/.

6,

Препараты скармливали мышам через зонд в течение 15-60 дней, t цыплятам - с кормом в течение I5-I2U дней в дозах: афлатоксин Bj-и бензол мышам - 2,5-Ю и 2,2-10 мг/кг, цыплятам - 6,5*10 * 88,0 мг/кг массы соответственно; авиамин и церебролизия - обоим видам /по белку"32,0 и 1000 мг/мл соответственно/ - 6,5-10 и 65,0 мг/кг массы. Группа животных аминокислотные препараты скармливали сочетание с афлатоксином Вт или бензолом. Контрольные животные по аналогичной схеме получали физиологический раствор.

Затем часть животных внутривенно иммунизировали эритроцитами барана: мышей - 2<Ю^Ь, цыплят - 5.10 клеток-;іли vi -антигеном /ЫО мг/мышь/. На 4-ые сутки после иммунизации в селезенке каждого животного модифицированным методом Jsrac , цю ruin определял! число ч«гМ-шітптелообразувдих клеток /АО/У. Для выявления АОК к-vi-антигену последний нагружалина' эритроциты барана. Конечная концентрация антигена составляла 2-Ю мг/мл. Для освобождения от иесвязавшогося vi-антигена эритроциты отмывали не менее 6 ра: ііля выявления числа igM-AOK у мн'лай и цыплят использовали свежий комплемент морской свинки /1:10/ или свежий куриный комплемент /1:3/ соответственно. Число АОК у обоих видов пересчитывали на 10 кариоцитов селезенки.

Экспрессию in vivo и in vitro Thy-1-антигена на костномозговых Т-продшєстьеніїЕках мышей и цыплят под влиянием препаратов опрі

ДЄЛЯЛИ В КОМПЛеМеНТЗаВИСИМОМ ЦИТОТОКОНЧесКОМ Тесте '/Hiadarhubor, м

lor. ,.1978/с помощью специфических антн-Тпу-1-сывороток. Для выявления мышиных Т\іу-І⁺-клеток использовали кроличью антисыьоротку против гомогенате кори головного мозга: мышей .-СВА. Для идентификации Тиу-І^-клеток цыплят-антисыворотку против тимоцитов кур. їдя достижения специфичности ангнсывороткл абсорбировали эритроцитами барана, го!»ст^!атом^аачвни^-зритроцитами-юн5&тного-лл0-Ліиди__ клетки которого исследовали /FetgLova." ...1972/. После абсорбции антисыворотки в присутствии свежего комплемента-соответствующего вида животного специфически реагировали'с Т-клетками: антисыворот ка против коры головного мозга мышей /I:50/вызывала гибель 83,0-1,3% тимоцитов и не взаимодействовала с клетками костного мозга, а ангискяоротка против куриных тимоцитов /1:100/ индуцировала гибель 92,0-2,5 тимоцитов и всего - 1,2-0,7^ клеток бурсы.

В сыворотке неиммунизированных цыплят, получавших препараты, помощьп биуретового реактива- определяли концентрацию альбуминов в общего белка.

В ДРУГОЙ Группе у НеИММуНИЗИрОВаННЫХ ЖИВОТНЫХ И i- vitrj оце

пивали влияние препаратов на фагоцитарную активность царитонеаль-ных гранулоцитов ишшй.и цыплят. Коночная концентрация іиеток пари-тонеального экссудата составляла 12,5'млн/мл, а микробных клеток-250 млн/мл. Тест-мккробом служила суточная культура S\. aureus. Определяли фагоцитарний показатель /% гранулоцнгов^ участвующих в фагоцитозе/, и фагоцитарное число /среднее арифметическое количество микробов в одном гранулоците/.

Для определения действия препаратов на способность первтоноалъ-ных гранулоцитов дезинтегрировать микробные клетки были проведенії эксперименты по изучению завершенности фагоцитарного процесса методом Бермана, Славской /1958/.

В другой группе неиммунизировйнных цнплят, получивших препарати, в гранулоцитах определяли содержание лязосомально-катиожшх белков.

Оценку антитоксических свойств аминокислотных препаратов проводили in vitro /Балокрндов и.др, 1996/. Б качестве соединении, оказывающих токсическое воздействие на спленоцитн,использовали амя-

А -

токсин Bj или бензол в разведении /10 /.

Каждый из проведенных опытов повторяли не менее 2.-3 раз. 13 опытах in vitro подсчитывали не менее 6GG-8G0 клеток. Выявление погибших клеток проводили с помощью 0,2$ водного раствора тріпіанового голубого /"Sigma"/. Жизнеспособность клеток в экспериментах \п vitro составляла не менее 80-85$. Статистическая обработка данных производилась с помощью критерия Стыодента-для независимых выборок.