Введение к работе
Актуальность темы. Одной из важнейших задач современной лей-козологии является разработка новых и совершенствование существующих методов ранней и дифференциальной диагностики гемооласто-зов. За последние десятилетия отечественными исследователями внесен огромный вклад в изучение лейкоза крупного рогатого скота (Б.Б.Ермолаев, 1963; Г.А.Симонян, IS63, 1975; Т.П.Кудрявцева. 1967; Н.В.Румянцев, 1975; В.П.Шишков, 1975; Г.Ф.Корошслов, 1975; Г.С.Петровский, 1979; Л.Г.Бурба, 1983; В.М.Нахмансон, 1986; З.И.Тамошюнас, 1987 и др.). Методами комплексных клинико-гематоло-гических, цитологических, иммунологических, биохимических и вирусологических исследований были всесторонне изучены особенности патологических изменений при данной болезни. *їз разработанных прижизненных методов диагностики лейкоза сравнительно достоверным остается гематологический, а для уточнения и подтверждения диагноза - цитоморфологические методы. Вместо с тем, диагноз, установленный морфологическим методом исследования не всегда подтверждается патоморфологическим анализом, незначительный лимфоцитоз может тлеть место и при некоторых заболеваниях нелелкозной природы, а зрелые лимфоциты не во всех случаях поддаются идентификации. Исходя из этого перед лейкозологами встала необходимость изыскания дополнительных тестов, позволяющих дифференцировать незначительные морфологические и структурно-функциональные изменения в крови при лейкозе от таковых, обусловленных причинами нелейкозного характера.
В настоящее время все большее применение получают физико-химические методы изучения структуры и функций клеток, среди которых значительное место принадлежит методу флуоресцентных зондов. Благодаря способности целого ряда флуоресцирующих соединений (как внутриклеточной природы, так и вводимых в клетку извне) отвечать изменением параметров собственной флуоресценции на изменение физико-химических свойств окружения, создается возможность следить с их помощью за такими параметрами клеток, как внутриклеточный рН, содержание Саг+, состояние митохондриального и лизосомального аппарата, состояние клеточных мембран, синтетическая активность клетки, содержание некоторых внутриклеточных соединений и др. (Ю.А.Владимиров, Г.Е.Добрэцов, 1980; В.П.Зорин, 1984). Все это дает возможность изучать различные системы клеточной регуляции, к числу наиболее важных из которых относят систему рН-регуляции.
Анализ литературных данных о взаимосвязи между изменениями физико-химических свойств и функциональных характеристик клеток, скорости протекания внутриклеточных процессов, пролиферативной активности и т.п. с одной стороны, и пространственно-временными сдвигами величины внутриклеточного рН с другой, убедительно показывают, что ионы водорода могут и должны играть важную регуляторную роль в процессах клеточной жизнедеятельности (Л.Л.Литинская, А.М.Зекс-лер, В.Е.Туровецкий, 1987 и др.).
В то же время проблемы участия ионов водорода в лейкозной трансформации лимфоидных клеток изучена явно недостаточно (Т.Н.Багла-ев и др., 1982) и требует дальнейших углубленных исследований. При этом, особо перспективным представляется комплексный анализ изменений, происходящих на клеточном уровне, включающий в себя, наряду с изучением модификации внутриклеточного рН, исследование таких важных параметров структурно-функционального состояния как содержание АТФ, синтетическая активность и состояние клеточных.мембран.
Такой подход, в конечном итоге, должен обеспечить расшифровку механизмов лейкозной трансформации и, как следствие, создать дополнительные методы ранней и дифференциальной диагностики данного заболевания. Это, в значительной степени, и определяет важность и актуальность данной диссертационной работы.
Цель и задачи исследований. Целью наших исследований явилось
изучение в сравнительном аспекте с помощью одного из наиболее пер
спективных направлений физико-химического анализа г метода флуорес
центных зондов и ряда других методов - отличительных особенностей
лимфоцитов периферической, крови здорового и больного лейкозом по
головья коров, возможности использования полученных данных для
идентификации нормальных лимфоцитов от. лейкемических в качестве,
дополнительного критерия оценки лейкозного процесса и дифференци
альной диагностики лейкоза крупного рогатого скота.
Дію достижения поставленной цели, на-семи отобранных, группах коров (здоровые, инфицированные ВЛКРС и больные лейкозом животные, находящиеся в предлейкозном состоянии,, начальной, развернутой и терминальной стадиях) ставилась задача, изучить в,сравнительном аспекте следующие параметры .клеток: -.
. I. Цитоморфологические.изменения лимфоцитов- периферической. - .
КрОВИ.. г ..---;:, :- .
-
Внутриклеточный рН (концентрация ионов водорода).влимфоцитах периферической крови.
-
Интенсивность флуоресценции лимфоцитов периферической кро-
ви, окрашенных люминесцентным зондом.
-
Синтетическую активносте лимфоцитов крови (отношение РНК к ДНК в клетке).
-
Содержание количества общего белка и внутриклеточной АТФ в лимфоцитах периферической крови.
-
Содержание липидов и микровязкость клеточных мембран лимфоцитов.
Научная новизна. Впервые методами комплексных гематологических, серологических (РИД), цитоморфологических и физико-химических исследований с применением флуоресцентных зондов проведено изучение морфофункциональных особенностей лимфоцитов периферической крови у здоровых, инфицированных ВЛКРС и больных на различных стадиях лейкоза коров. Доказано, что в процессе развития заболевания прогрессивное нарастание числа лейкоцитов в крови сопровождается преимущественной пролиферацией средних и больших лимфоцитов, увеличением среднего их размера, значительным повышением внутриклеточного рН и связывания ими флуоресцеина. Отмечается также одновременное возрастание уровня.АТО в клетках, повышение их синтетической активности, изменение микровязкости мембран лимфоцитов. Изменения в характере распределения .клеток в популяции по величине данных параметров имеют диагностическое и патогенетическое значение.
Практическое значение -работы. Развитые в диссертационной работе метода определения внутриклеточного рН и интенсивности флуоресценции, окрашенных флуоресцентным зондом клеток используются для изучения механизмов лейкозной трансформации и дифференциации лим-фоидных клеток. Данные методы вошли в сборник "Методические рекомендации по цитохимическим и физико-химическим методам диагностики гемобластозов крупного рогатого скота", предназначенные для научно-исследовательских учреждений, изучающих гемобластозы сельскохозяйственных животных и в "Программу профилактики и борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в хозяйствах агропромышленного объединения "Новомосковское на 1987-1992 гг.". Полученные в диссертационной работе результаты, помимо важного теоретического, имеют также большое практическое значение и могут.послужить основанием для разработки соответствующих диагностических тестов.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на "Координационном совещании по проблемам лейкозов человека и животных", (Кишинев, 1989); на научно-производственных совещаниях сот-
рудников Центрального отдела лейкозов, сравнительной и экспериментальной онкологии ВИЭВ в 1987, 1988, 1989 годах; на заседаниях Ученого Совета ВИЭВ в 1988 и 1939 годах; на научной конференции молодых ученых ВИЭВ в 1990 году;.на Республиканской научно-технической конференции "Ветеринарная медицина:.экономические, социальные и экологические проблемы" (Харьков, ноябрь, 1990).
Публикации. По теме диссертации опубликованы три научные ста
тьи и две методические рекомендации. . .
Объем работы. Диссертация изложена на 158 страницах машинопис
ного текста. Текст иллюстрирован II таблицами.и 18 рисунками. Рабо
та, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов .
исследований, результатов исследований, обсуждения полученных-ре
зультатов, выводов, практических.предложений. Список литературы
содержит 179 наименований работ, в том числе 67..-зарубежных публи
кации. -.:-..'.;..