Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Актуальные проблемы гипоксических нарушений в перинатальный период развития плода и новорожденного (обзор литературы) 11
1.1. Эпидемиология гипоксического поражения мозга у новорожденных детей 11
1.2. Патофизиология гипоксического поражения головного мозга новорожденного 13
1.3. Проблемы механизма регуляции ремоделирования внеклеточного матрикса при перинатальной гипоксии 15
1.4. Проблема прогнозирования и ранней диагностики перинатальной гипоксии 19
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 24
2.1. Организация исследования 24
2.2. Дизайн исследования
2.2.1 Критерии включения новорождённых в исследование 25
2.2.2 Критерии исключения новорождённых из исследования
2.3. Методы исследования новорождённых детей 26
2.4. Методы, использованные при проведении лабораторного исследования 28
2.4.1 Взятие образца плазмы пуповинной крови новорожденных и образца плазмы крови новорожденных на 3-4 сутки жизни 28
2.4.2 Определение концентрации матриксной металлопротеиназы-1 28
2.4.3 Определение концентрации матриксной металлопротеиназы-9 29
2.4.4 Определение концентрации тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ-1 30
2.4.5 Определение концентрации белка S100B 32
2.4.6 Определение концентрации лактата 32
2.5 Статистическая обработка результатов .33
ГЛАВА 3. Особенности течения анте и интранатального периода у недоношенных детей 36
3.1 Социальные факторы риска развития гипоксического повреждения центральной нервной системы недоношенных детей 36
3.1.1 Возрастная и социальная характеристика матерей недоношенных детей 36
3.1.2 Вредные привычки родителей 37
3.2 Соматическая патология и акушерский анамнез матерей исследуемых групп 37
3.2.1 Соматическая патология матерей исследуемых групп 38
3.2.2 Акушерский анамнез матерей исследуемых групп
3.3 Осложнения течения беременности матерей изучаемых групп 40
3.4 Состояние плацент исследуемых групп 41
3.5 Особенности течения интранатального периода 42
3.6 Характеристика детей исследуемых групп 44
3.6.1 Физическое развитие детей .44
3.6.2 Состояние детей сразу после рождения 45
3.6.3 Сопутствующая патология недоношенных детей 46
3.6.4 Результаты нейросонографии у детей на 3-4-й день жизни 47
3.6.5 Неврологическая симптоматика детей исследуемых групп 49
ГЛАВА 4. Факторы риска и течение раннего неонатального периода у доношенных детей 52
4.1 Факторы риска развития гипоксического повреждения центральной нервной системы у доношенных детей 52
4.1.1 Возрастная и социальная характеристика матерей доношенных детей .52
4.1.2 Вредные привычки родителей 53
4.2 Экстрагенитальная патология и акушерский анамнез матерей доношенных детей 53
4.2.1 Соматическая патология матерей 53
4.2.2 Акушерский анамнез матерей исследуемых групп 55
4.3 Осложнения течения беременности и гистология плацент матерей доношенных детей .55
4.3.1 Осложнения течения беременности матерей исследуемых групп 55
4.3.2 Состояние плацент исследуемых групп
4.4 Особенности течения интранатального периода 57
4.5 Клиническая характеристика доношенных детей
4.5.1 Физическое развитие доношенных детей исследуемых групп 59
4.5.2 Состояние доношенных детей сразу после рождения 60
4.5.3 Сопутствующая патология у доношенных детей исследуемых групп 62
4.5.4 Результаты нейросонографии у доношенных детей 62
ГЛАВА 5. Исследование системы матриксных металлопротеиназ в плазме пуповинной и венозной крови на 3-4 день жизни у новорожденных с гипоксическим поражением центральной нервной системы 65
5.1 Особенности состояния системы матриксных металлопротеиназ в плазме пуповинной и венозной крови на 3-4-й день жизни недоношенных новорожденных при гипоксическом поражении ЦНС 66
5.2 Состояние системы матриксных металлопротеиназ в плазме пуповинной и венозной крови на 3-4-й день жизни у доношенных новорожденных с гипоксическим поражением ЦНС 72
5.3 Особенности состояния системы матриксных металлопротеиназ у новорожденных при перинатальном гипоксическом
поражении ЦНС различной степени тяжести 75
5.3.1 Особенности состояния системы матриксных металлопротеиназ у недоношенных детей с различной степенью гипоксического поражения центральной нервной системы 75
5.3.2 Особенности состояния системы матриксных металлопротеиназ у доношенных детей с различной степенью гипоксического поражения центральной нервной системы 78
5.4 Сравнительная характеристика системы матриксных металлопротеиназ у недоношенных и доношенных детей в зависимости от преобладающего неврологического синдрома 80
ГЛАВА 6. Клиническая информативность оценки параметров системы матриксных металлопротеиназ при перинатальном гипоксическом поражении ЦНС 83
6.1 Исследование диагностической значимости параметров системы матриксных металлопротеиназ, повреждения ЦНС и гипоксии в плазме пуповинной и венозной крови у новорождённых детей 84
6.1.1 Исследование диагностической значимости параметров системы матриксных металлопротеиназ у доношенных детей 84
6.1.2 Исследование диагностической значимости параметров системы матриксных металлопротеиназ у недоношенных детей 87
6.2. Результаты клинического обследования детей в течение первых 6 месяцев жизни 95
6.3 Возраст снятия детей с диспансерного учёта у врача невролога 95
6.4 Примеры использования оценки параметров системы матриксных металлопротеиназ для диагностики перинатального гипоксического поражения ЦНС и прогноза в первый год жизни 97
Обсуждение полученных результатов 103
Выводы 122
Практические рекомендации 123
Список сокращений 124
Список литературы
- Проблемы механизма регуляции ремоделирования внеклеточного матрикса при перинатальной гипоксии
- Взятие образца плазмы пуповинной крови новорожденных и образца плазмы крови новорожденных на 3-4 сутки жизни
- Состояние плацент исследуемых групп
- Экстрагенитальная патология и акушерский анамнез матерей доношенных детей
Введение к работе
Актуальность исследования
Патология центральной нервной системы (ЦНС) у детей раннего возраста,
обусловленная гипоксическим поражением головного мозга в антенатальном
периоде и родах, занимает лидирующее место среди всех факторов
перинатального поражения нервной системы у новорожденных детей и
является одной из наиболее актуальных проблем современной медицины
[Шабалов Н.П., 2006; Пальчик А.Б. и соавт., 2013; Новопольцева Е.Г., 2015].
Согласно исследованиям последних лет частота данной патологии у
доношенных новорожденных детей колеблется от 15 до 30%, а у
недоношенных детей составляет около 40% [Володин H.H., 2010], так как
развивающийся мозг новорожденного чувствителен к воздействию гипоксии,
которая не только вызывает очаговые повреждения мозговой ткани, но и
задерживает развитие сосудистой системы, нарушает клеточную
дифференциацию [Лебедева О.В., 2012].
Как правило, диагностика гипоксических повреждений мозга
новорожденных детей основывается преимущественно на инструментальных
исследованиях, которые позволяют дифференцировать нормальный и
девиантный неврологические статусы с прогностической ценностью около 15%
[Пальчик А.Б. и соавт., 2010; Ремизова И.И. и соавт., 2011; Ровенская Ю. В.,
2011]. В настоящее время ведется поиск ранних маркеров повреждения
головного мозга, исследуются возможные пути защиты от повреждающих
агентов, а также способы активации репаративных процессов
[Александрова Ю.Н, 2011]. Данное направление имеет не только научно-
практическую ценность, но и социальное значение, так как у детей в результате
гипоксического повреждения головного мозга могут формироваться
отдалённые последствия [Малиновская О.Н. и соавт., 2004; Belousova T.V. еt al., 2011; Галактионова М.Ю. и соавт., 2013].
Известно, что гипоксия способствует повышению проницаемости
клеточных мембран, гибели нейронов и глиальных клеток вследствие некроза и
апоптоза, в результате чего возникает нарушение проницаемости
гематоэнцефалического барьера [Зарубина И.В., 2011; Клименко Т.М. и соавт.,
2013]. Поэтому ранняя диагностика и прогнозирование поражения центральной
нервной системы (ЦНС) могут позволить назначить новорождённым с
диагностированным перинатальным гипоксическим поражением ЦНС
специфического лечения [Белоусова Т.В., 2007, 2010; Gary D et al., 2011].
Учитывая последние данные о патологической роли матриксных
металлопротеиназ [Chakraborti S.et al., 2003; Кореновский Ю.В. и соавт., 2011, 2012] в патогенезе перинатального гипоксического повреждения центральной нервной системы у новорождённых детей, мы предопределили цель нашей работы.
Цель исследования
На основании данных перинатального анамнеза, клиники и функциональных методов исследования, а также результатов определения ферментов протеолитической системы матриксных металлопротеиназ представить данные по оптимизации диагностики течения и прогноза перинатального поражения центральной нервной системы у детей.
Задачи исследования
-
Определить и проанализировать факторы, влияющие на формирование гипоксического поражения центральной нервной системы у новорождённых детей в зависимости от их гестационного возраста.
-
Охарактеризовать особенности клинических проявлений гипоксического поражения центральной нервной системы у новорождённых детей в зависимости от срока гестации.
-
Изучить особенности системы матриксных металлопротеиназ в плазме пуповинной и венозной крови на 3-4-й день жизни у недоношенных и доношенных новорождённых детей с гипоксическим поражением центральной нервной системы.
-
Выявить связь между степенью тяжести гипоксического поражения
центральной нервной системы у новорождённых детей с активацией системы
матриксных металлопротеиназ.
5. Установить клинико-диагностическую и прогностическую
информативность основных параметров матриксных металлопротеиназ при гипоксическом поражении центральной нервной системы в первый год жизни.
Научная новизна
Впервые показано, что при перинатальной гипоксии у доношенных и
недоношенных новорожденных регистрируется активация системы матриксных
металлопротеиназ. При этом тяжесть гипоксического воздействия
соответствует более выраженным изменением в этой внеклеточной протеолитической системе.
Обнаружено, что степень активации системы матриксных металлопротеиназ в раннем неонатальном периоде, более выражена у недоношенных детей с внутрижелудочковыми кровоизлияниями.
Выявлено, что значимость различий активации системы матриксных металлопротеиназ в течение первых 3-4 суток жизни новорожденных с перинатальной гипоксией нарастает, что позволяет использовать компоненты этой протеолитической системы в качестве диагностических маркеров тяжести перинатальной гипоксии в раннем неонатальном периоде.
Теоретическая и практическая значимость работы
-
Теоретическая значимость работы заключается в установлении наличия универсальной реакции системы матриксных металлопротеиназ при перинатальной гипоксии. При этом сдвиги в системе ММП при рождении в форме повышенной продукции матриксных металлопротеиназ и дефиците их тканевых ингибиторов (ТИМП) определяют скорость и тяжесть развития патологического процесса повреждения в центральной нервной системе новорожденного в раннем неонатальном периоде и длительность реабилитационного периода.
-
Установленные в исследовании закономерности могут учитываться при
диагностике перинатальной гипоксии у доношенных и недоношенных детей в
раннем неонатальном периоде.
-
Полученные результаты настоящего диссертационного исследования могут применяться в преподавании клинической неонатологии, биохимии и патофизиологии при подготовке студентов медицинских вузов в разделе «Клинико-лабораторная диагностика перинатальной гипоксии у доношенных и недоношенных новорожденных».
-
Продемонстрировано, что полученные данные системы матриксных металлопротеиназ позволяют использовать для прогнозирования гипоксического поражения центральной нервной системы у детей и определять своевременность и длительность реабилитационного периода.
Методология и методы исследования
Клиническая работа носит исследовательский характер. Для решения поставленных в диссертации задач проведено комбинированное исследование диагностики гипоксического поражения центральной нервной системы на основании клиники, данных нейросонографии в сочетании с определением уровня ММП-1, ММП-9 и ТИМП-1 в плазме пуповинной и венозной крови новорождённых детей на 3-4-й день жизни. Объект исследования – новорождённые дети, предмет исследования – пуповинная кровь и кровь новорождённых детей на 3-4-й день жизни. Достоверность полученных данных подтверждена методами математической статистики.
Положения, выносимые на защиту
1. Гипоксическому поражению ЦНС у доношенных и недоношенных
новорожденных предшествуют неблагоприятные анте и интранатальные
факторы, из которых наиболее значимы сопутствующая соматическая
патология у матери, плацентарная недостаточность и патологическое течение
родов.
2. Перинатальное гипоксическое поражение центральной нервной системы у
новорожденных детей в раннем неонатальном периоде сопровождается
повышенной продукцией матриксных металлопротеиназ-1 и -9 и пониженным
уровнем тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ-1.
3. Исследование концентраций матриксных металлопротеиназ-1 и -9,
тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ-1 в крови новорожденных в раннем неонатальном периоде повышает эффективность диагностики тяжести перинатального гипоксического поражения центральной нервной системы и прогноза неврологических нарушений на первом году жизни.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры биохимии и
клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Алтайский
государственный университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, в практику КГБУЗ «Перинатальный центр (клинический) Алтайского края».
Личный вклад автора в проводимое исследование
Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.
Апробация
Результаты исследования представлены на научно-практической
конференции педиатрической службы Алтайского края «Актуальные проблемы педиатрии» [г. Барнаул, 2013]; на 18-й международной научно-практической конференции «Внутриутробное детство — основа здоровья человека» [г. Кемерово, 2014]. Апробация работы состоялась на расширенном заседании кафедр педиатрии №1 и №2, ФПК и ППС, акушерство и гинекология №1, биохимии и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО АГМУ МЗ РФ.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации
Проблемы механизма регуляции ремоделирования внеклеточного матрикса при перинатальной гипоксии
В результате гипоксического воздействия некоторые клеточные механизмы включают повреждение клеток [68]. Тяжесть и продолжительность асфиксии определяет распространенность, характер и тяжесть повреждения [200]. У одних новорожденных развиваются пери/внутрижелудочковые кровоизлияния и перивентрикулярная лейкомаляция, у других – некроз нейронов, парасагиттальное и фокальное или мультифокальное поражение мозга [55]. Повреждение мозга [53] у новорожденных определяется комбинацией факторов риска, которые могут отличаться в зависимости от срока гестации. Теория ишемии фокусируется на роли гипоксии-ишемии, приводящей к нарушению церебрального метаболизма и повреждению [105]. Свидетельства, поддерживающие эту модель следующие: а) тяжесть и скорость нарастания дефицита кислорода в нервной ткани снижает синтез белка и вызывает гибель нейронов в течение нескольких минут [77]; б) аноксия является фактором не контролируемого высвобождения возбуждающих нейротрансмиттеров, способствующих повреждению мозга [144]; в) дефицит кислорода вызывает апоптоз или некроз нейронов [107]. Эти свидетельства основаны на результатах нескольких экспериментов на животных: дефицит глюкозы или доступности аденозинтрифосфата (АТФ) в нейронах приводит к повышению концентрации внутриклеточного кальция, активации литических энзимов, снижению продукции антиоксидантных и структурных белков [142]. Высвобождение возбуждающих медиаторов приводит к окрытию кальциевых каналов в постсинаптических клетках [113]. Повреждение усиливается свободными радикалами и оксидом азота, атакующими структурные компоненты клеток. Апоптоз включается при выходе цитохрома C в цитозоль клеток из митохондрий [149].
Основным патогенетическим механизмом развития перинатальной нейропатологии является нарушение мозгового кровообращения, ацидемия со снижением pH в пуповинной артерии менее 7,0 [173,26,41]. На клеточном уровне, снижение церебрального кровотока и снижение доставки кислорода препятствует окислительному фосфорилированию и включает анаэробный метаболизм с дефицитом АТФ, накоплением лактата и нарушением базовых функций клеток. Нарушение функции ионных насосов обусловливает накопление ионов натрия, кальция и воды в клетке. Деполяризация мембраны обеспечивает высвобождение возбуждающих нейротрансмиттеров, включая глутамат, который стимулирует рецепторы и вход ионов кальция в постсинаптический нейрон, где индуцирует каскад событий, включая активацию каскада оксида азота (NO) через p38 MAPK, JNK и активных форм кислорода (АФК) [108]. Комбинация дефицита энергии, ацидоза, высвобождения глутамата и накопления ионов кальция, пероксидации липидов и гиперпродукции NO вызывает гибель нейронов [199].
После реанимационных мероприятий происходит восстановление оксигенации мозга и перфузии [25,48]. При этом восстанавливается содержание в клетках АТФ и pH. Однако в период между 6 и 48 ч после рождения наблюдается вторая фаза повреждения со снижением отношения креатинфосфат/неорганический фосфат без изменения внутриклеточного pH, стабильной работой сердечно-сосудистой и дыхательной систем [157]. У новорожденных детей тяжесть вторичного дефицита энергии коррелирует с неврологическим исходом в 1-4 года жизни [184]. Механизм вторичного дефицита энергии включает дисфункцию митохондрий вследствие входа ионов кальция, возбудительную токсичность, образование свободных радикалов и NO. Митохондрии определяют судьбу нейрона после гипоксии-ишемии. Так транслокация цитохорома C в цитоплазму из митохондрий активирует каскад протеолитических цистеиновых протеаз каспаз, вызывающих фрагментацию ДНК и апоптоз [124].
Глутамат является главной возбуждающей аминокислотой в мозгу. Действие глутамата медиируется NMDA-, AMPA- и каинатными рецепторами. В течение гипоксии-ишемии, глутамат накапливается в синаптической щели вследствие повышенного выброса и нарушения повторного захвата. Удаление глутамата из синаптической щели осуществляют транспортёры глутамата - глии, где глутамат превращается в глутамин. Глутамин транспортируется в нейроны и превращается в глутамат [158].
Высокая плотность и активность рецепторов глутамата в перинатальный период создает потенциал для развития повреждающих эффектов при дефиците энергии. Гипоксия-ишемия вызывает массивный вход ионов натрия и воды в нейроны, повышение внутриклеточной концентрации ионов кальция, дисфункцию митохондрий, дефицит энергии, апоптоз и некроз. Из погибших нейронов высвобождаются литические энзимы [95], нарушающие повторный захват глутамата глией. Гликолиз обеспечивает АТФ транспорт глутамата глией, а дефицит глюкозы при ишемии повышает концентрации глутамата в синапсах [141].
В аэробных клетках активные формы кислорода (супероксидного радикала, гидроксильного радикала и перекиси водорода) образуются в цитоплазме и митохондриях. При гипоксии митохондрии продуцируют повышенные количества АФК. Дефицит антиоксидантов или избыточная продукция АФК вызывает пероксидацию липидных мембран, изменение мембранного потенциала, активацию проапоптозных медиаторов и прямое повреждение ДНК и белков.
Возбудительная токсичность вызывает дисфункцию митохондрий с дефицитом энергии, образование свободных радикалов супероксида, производных NO и гидроксильного радикала. Свободные радикалы нарушают работу мембранных насосов, способствуя высвобождению глутамата и стимуляции NMDA-рецепторов. Поскольку в нервной ткани много полиненасыщенных жирных кислот, то гиперпродукция АФК вызывает лизис липидных мембран и гибель клеток [163].
Воспалительные цитокины оказывают токсическое воздействие на развивающийся мозг [6,38,14], так как они [57,42,62] могут быть конечными общими медиаторами повреждения мозга, обусловленного гипоксией и реперфузией. Мишенями цитокинов являются астроциты, нейроны, микроглия и эндотелий ЦНС. IL-1, TNF, IL-6 и IL-8 медиируют воспаление в мозгу [114]. Возможным источником могут быть воспалительные клетки плода или матери в системном кровотоке, а также микроглия.
В последние годы патогенез повреждения мозга [13] при перинатальной гипоксии [52,30] связывают с дисфункцией внеклеточного матрикса, поскольку показано, что внеклеточный компартмент большинства биологических тканей менее защищен от оксидативного [15] повреждения, чем клетки [178]. При этом повреждение внеклеточного матрикса является следствием прямого действия активных форм кислорода на компоненты внеклеточного матрикса, обеспечивающие целостность гематоэнцефалического барьера [206].
В последнее время появились работы, свидетельствующие о роли специфических регуляторов функций внеклеточного матрикса [20] в патогенезе перинатальной гипоксии. Так в небольшом исследовании, проведенном в Перинатальном исследовательском центре университета Альберта в Канаде, показано, что у 12 недоношенных новорожденных с бронхолегочной дисплазией и/или внутрижелудочковыми кровоизлияниями в крови были повышены активности специфического протеолитического фермента матриксной металлопротеиназы 9 (ММП-9) и его тканевого ингибитора (ТИМП-1) в сравнении со здоровыми доношенными новорожденными [188]. Авторы предположили, что ММП и ТИМП могут быть вовлечены в процессы фетонеонатального развития и в патогенез бронхолегочной дисплазии и/или внутрижелудочковых кровоизлияний у недоношенных новорожденных.
В другом, также небольшом исследовании, проведенном в Департаменте педиатрии университета Ямагучи, Япония [194], у 12 новорожденных с асфиксией обнаружены повышенные уровни ММП-9 в плазме крови при рождении и в первый день жизни новорожденных по сравнению с уровнями этих белков у 15 здоровых новорожденных. Авторы полагают, что повышенный уровень ММП-9 в плазме крови при рождении является предиктором развития неврологических нарушений у новорожденных с асфиксией. Сходные результаты были получены у 25 новорожденных с неонатальной энцефалопатией: повышение уровней ММП-9 и ТИМП-1 в плазме крови во время короткого шестичасового «окна» после рождения и далее концентрации этих биомолекул снизились [75].
Взятие образца плазмы пуповинной крови новорожденных и образца плазмы крови новорожденных на 3-4 сутки жизни
При проведении данного исследования использовался комплекс клинических, ультразвуковых и лабораторных методов исследования: 1. Изучение медицинской документации. 2. Клиническое обследование новорождённых детей с оценкой неврологического статуса у них. Сразу после рождения дети оценивались по шкале Апгар и шкале Сильвермана или DOWNES при наличии респираторных нарушений. При оценке неврологического статуса обращали внимание на: степень нарушения сознания, изменение мышечного тонуса (атония, гипотония и мышечная гипертония), изменение рефлексов (арефлексия, гипорефлексия и гиперрефлексия), а также на наличие судорог у ребёнка. Физическое развитие оценивали по перцентильным таблицам и таблице Дементьевой Г.М. и Короткой Е.В., оценка степени зрелости – по шкале Bollard. 3. Нейросонография проводилась на 3 - 4-й день жизни и на первом году жизни, проводилась на аппарате Vivid-i (General Electrics, США). Исследование проводилось с помощью линейного датчика 12v и конвексного датчика 8v. Использовалась общепризнанная методика: через большой родничок и височную кость в различных плоскостях. При этом оценивали: а) выраженность отёка перивентрикулярной, субкортикальной и кортикальной областей; б) размеры суб арахноидального пространства и межполушарой щели; в) состояние желудочковой системы.
Диагноз гипоксически - ишемического поражения ЦНС (церебральная ишемия) выставляли на основании клинических признаков (оценка по шкале Апгар, наличие синдрома возбуждения или угнетения), степени изменений в головном мозге по данным ультразвукового исследования на 3-4 сутки после рождения в соответствии с классификацией [29] РАСПМ от 2000 г.
Согласно этой классификации лёгкая степень тяжести ГИП ЦНС выставлялась при наличии интранатальной гипоксии и/или легкой асфиксии при рождении, а также синдрома возбуждения ЦНС или угнетения, длительностью не более 5-7 суток. По данным ультразвукового исследования головного мозга изменений не наблюдалось.
Для средней степени ГИП ЦНС характерно было наличие факторов, свидетельствующих о внутриутробной гипоксии плода, асфиксия средней тяжести при рождении, а также экстрацеребральные причины гипоксии, возникшие постнатально. В клинической картине отмечалось угнетение ЦНС, возбуждение, тонические или атипичные (судорожные апноэ, стереотипные спонтанные оральные автоматизмы, "педалирование" – ног) судороги - у недоношенных, у доношенных - мультифокальные клонические. Приступы были кратковременными, однократными. По данным нейросонографии выявлялись локальные гиперэхогенные очаги в мозговой ткани (у недоношенных детей чаще в перивентрикулярной области; у доношенных -субкортикально).
Тяжёлая степень тяжести ГИП ЦНС выставлялась в том случае, если у ребёнка имели место факторы, приводящие к внутриутробной гипоксии плода и/или тяжелой перинатальной асфиксии; экстрацеребральные причины стойкой гипоксии мозга (тяжелые формы СДР, гиповолемический шок и т.д.). В клинической картине отмечалось нарастание синдрома угнетения в период 12 - 72 часов, кратковременные судороги, дисфункция стволовых отделов мозга. По данным ультразвукового исследования головного мозга отмечались тяжёлые изменения (субэпендимальные кровоизлияния, отёк вещества головного мозга, выраженное повышение эхогенности перивентрикулярных структур).
Диагноз внутрижелудочкового кровоизлияния (ВЖК) выставляли на основании данных анамнеза (преждевременное рождение ребёнка, наличие факторов, свидетельствующих о внутриутробной гипоксии плода, асфиксии при рождении, дефекты при проведении реанимационных мероприятий, флюктуация системного артериального давления, введение гиперосмолярных растворов и т.д., ), метаболические нарушения, данных клинической картины – апное, чаще угнетение, переходящее в кому, судороги, бради- и тахикардия, а также данных дополнительных методов обследования (ультразвуковое исследование головного мозга – гиперэхогенные участки в таламо – каудальной вырезке, гиперэхогенные участки в области герментативного матрикса, тромбы в желудочках и т.д.).
4. Биохимическое исследование: определение лактата в плазме пуповинной крови сразу после рождения и плазме венозной крови новорождённых детей на 3-4-й день жизни.
5. Иммуноферментное исследование: определение в плазме пуповинной крови и плазме венозной крови на 3-4-й день жизни концентрации белка S100В, матриксной металлопротеиназы -1 и -9 (ММП - 1, ММП – 9) и тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ (ТИМП – 1). 2.4 Методы, использованные при проведении лабораторного исследования
Образец венозной крови из артерии пуповины забирали сразу после ее пересечения, а образец венозной крови у новорожденных забирали на 3-4 сутки жизни. В образцы крови добавляли гепаринат лития из расчета 14 ЕД на 1 мл крови. Кровь центрифугировали в течение 15 мин при 1200 g.
В образцах плазмы крови биохимическими методами определяли концентрацию лактата (молочной кислоты), методом иммуноферментного анализа – концентрации матриксных металлопротеиназ-1 и -9 (ММП-1, ММП-9), тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ-1 (ТИМП-1) и белка S100.
Матриксная металлопротеиназа-1 (ММП-1, интерстициальная коллагеназа, коллагеназа фибробластов) является ферментом, расщепляющим компоненты внеклеточного матрикса [122,124]. ММП-1 участвует в нормальных физиологических процессах, таких как эмбриональное развитие, беременность, ремоделирование тканей, а также в патологических процессах - преждевременные роды, воспаление, метастазирование опухолей. ММП-1 секретируется в неактивной форме и активируется внеклеточными протеиназами. ММП-1 расщепляет коллаген I, II и III типов.
Для определения концентрации ММП-1 в плазме венозной крови использовался набор для иммуноферментного анализа RayBio ELH-MMP1-001 (RayBiotech, США), предназначенный для количественного определения концентрации активных и неактивных форм ММП-1 в сыворотке, плазме и супернатанте культуры клеток. Принцип метода
Применяются специфические антитела к ММП-1 человека, иммобилизированные на лунки планшета. Стандарты и образцы биологического материала помещаются в лунки, которые промываются промывочным раствором. Затем в лунки добавляются биотинилированные антитела к ММП-1 человека.
Состояние плацент исследуемых групп
Физическое развитие детей является интегральным показателем комплексной оценки здоровья и представляет собой совокупность морфологических и функциональных свойств организма, характеризующих процесс его роста и созревания, является мерилом дееспособности ребёнка, его выносливости [2,11,23]. Исходные параметрические показатели не только отражают особенности внутриутробного развития, но и в совокупности с другими предикторами определяют постнатальное развитие, т.е. являются прогностически значимыми для показателей здоровья в последующие годы жизни [64,65].
Физическое развитие детей оценивалось по таблице Дементьевой Г.М. и Короткой Е.В. и перцентильным таблицам. Степень зрелости оценивалась по шкале Болларда. Таблица 5 демонстрирует, что срок гестации недоношенных детей 2 группы (31,76±1,763) был достоверно ниже (р 0,001), чем в 1 и 3 группах (33,84±1,722 и 33,0±1,532). Оценивая физическое развитие детей исследуемых групп (таблица 5) было очевидно, что масса детей при рождении во 2 группе (дети с гипоксически – геморрагическим поражением ЦНС) была значимо ниже (р1,2 0,05, р2,3 0,05, p1,3=0,124), чем в 1 и 3 группах (1803,60±95,97 против 2088,40±75,59 и 2266,38±72,46), хотя отмечаются различия и между 1 и 3 группами. Рост у детей 2 группы был достоверно ниже, чем у детей сравниваемых групп (р1,2=0,001, р1,3=0,05 и р2,3 0,001) (таблица 5). Одним из антропометрических показателей является окружность головы, так как в ряде исследований показано, что размер окружности головы коррелирует [2] с общим коэффициентом интеллектуального развития. Соответственно, окружность головы и грудной клетки также были малы у детей 2 группы (окружность головы 29,800±1,803 против 31,64±0,39 и 31,375±2,163 при р1,2 0,001 и р2,3 0,05, р3,1=0,05; окружность грудной клетки 27,360±2,50 против 29,48±0,85 и 30,29±0,50 при р1,2 0,001 и р2,3 0,05, р1,3=0,275). Массо-ростовой коэффициент, соответственно, был значимо ниже во 2-й группе в сравнении с 3-й (р1,3=0,089 и р2,3 0,001 при 45,96±1,17 и 42,44±1,74 против 49,30±1,19), но без достоверных различий между 1-й и 2-й группами (р1,2=0,071). По половой принадлежности достоверных различий в группах наблюдения не выявлено (р=0,067) (таблица5).
Представленные данные в таблице 5 демонстрируют, что наиболее «маленькие» дети подвержены более тяжёлому повреждению центральной нервной системы, хотя антропометрические данные, представленные в таблице, соответствуют сроку гестации.
Сразу после рождения дети оценивались по шкале Апгар, при наличии респираторных нарушений - по шкале Сильвермана или модифицированной шкале DOWNES. В таблице 6 показано, что достоверно низкая оценка по шкале Апгар на 1-й минуте была у детей 1 и 2-й групп (5,77±0,20, 5,72 ± 0,30 и 8,04±0,04, р3,1 0,001, р2,3 0,01, р1,2=0,200) в сравнении с 3-й. К 5-й минуте оценка по шкале Апгар восстанавливалась, но не достигала уровня детей 3 группы (6,96±0,09, 6,64±0,18 и 8,42±0,10, р1,3=0,05, р2,3 0,01 и р1,2=0,087).
Оценка по шкале Апгар указывает на степень перенесенной гипоксии, но не всегда может указывать на состояние неврологических нарушений в прогнозе.
Новорожденным детям с низкой оценкой по шкале Апгар проводились реанимационные мероприятия в родильном зале в соответствии с методическим письмом «Первичная и реанимационная помощь новорождённым детям» от 24.04.2010г. Сразу после рождения и в динамике детям проводилась пульсоксиметрия с целью оценки эффективности реанимационных мероприятий. Минимальное значение SaO2 равнялось 45% и восстанавливалось на фоне проводимых реанимационных мероприятий до 95% к 15-20 минуте. После проведённых реанимационных мероприятий новорождённые дети переводились в отделение реанимации и интенсивной терапии.
Учитывая оценку по шкале Апгар на 1-й и 5-й минутах, очевидно, что состояние при рождении было тяжелым у детей 1 и 2 групп, то есть у детей с гипоксическим поражением центральной нервной системы. Оценка по шкале Апгар на 1-й и 5-й минутах, М±т Признак 1 группа (n=25) 2 группа (n=25) 3 группа (n=25)
Качество жизни недоношенных детей может ухудшаться вследствие хирургических и соматических проблем. Причём ухудшение качества жизни происходит обратно пропорционально массе тела при рождении [43]. Как показывают наши данные, сопутствующая патология имела место во всех группах без достоверно значимых различий, у детей имели место задержка внутриутробного развития (ЗВУР) (р=0,072), неонатальная желтуха (р=0,075) и анемия (р=0,604). Наиболее частым и тяжёлым осложнением у детей 1 и 2 групп были респираторные нарушения (72,0%±9,0 88,0±6,5 0,0±14,3, р 0,001).
Большинство церебральных нарушений возникают в первые часы и дни жизни. Клинические проявления и степень тяжести последствий пре- и перинатального поражения центральной нервной системы имеют прямую связь с характером структурных изменений головного мозга [37]. Наибольшая частота поражений центральной нервной системы у недоношенных детей связана с гипоксически – ишемическими и геморрагическими повреждениями головного мозга. По литературным данным частота данных повреждений зависит не только от массы при рождении, но и от срока внутриутробного развития [46,47]. Прогноз, как правило, зависит от механизма повреждения мозга, наиболее важными являются гипоксически – ишемический инсульт, постгеморрагическая гидроцефалия и перивентрикулярный геморрагический инфаркт. Тщательная оценка нейросоногрфии является важным прогностическим знаком.
В настоящем исследовании на 3-4 сутки жизни детям проводили нейросонографию головного мозга на аппарате Vivid-i (General Electrics, США). Исследование проводилось с помощью линейного датчика 12v и конвексного датчика 8v [37]. У детей 3 группы ультразвуковых признаков поражения головного мозга выявлено не было.
У недоношенных детей 1 группы, по данным нейросонографии (таблица 9), достоверно чаще выявлялась перивентрикулярная ишемия - 21 случай (84,0%±7,3) и умеренная вентрикуломегалия - 4 (16,0%±2,6), тогда как у детей 2 группы – субэпендимальное кровоизлияние - 8 случаев (32,0%±9,3), умеренная вентрикуломегалия – 6 случаев (24,0%±8,5), ВЖК II и III степени – 4 случая (16,0%±2,6), 8 случаев уплотнение хориоидального сплетения (ХС) (32,0%±9,3). Хотя у детей 1 группы у 1 ребёнка диагностирован отёк головного мозга (4,0%±3,9), расширение субарахноидального пространства – у 3 детей (12,0%±6,5), расширение межполушарной щели – у 3 детей (12,0%±6,5), также у 3 детей определялись кисты хориоидального сплетения (12,0%±6,5). Тогда как во 2 группе отёк головного мозга имел место у 2-х детей (8,0%±5,4), у 4-х детей в сочетании с кровоизлянием имела место перивентрикулярная ишемия (16,0%±2,6).
Экстрагенитальная патология и акушерский анамнез матерей доношенных детей
Известно, что клиническая картина повреждений головного мозга у недоношенных детей в раннем неонатальном периоде носит полиморфный характер и, как правило, не имеет специфических неврологических знаков. Поэтому не наблюдается разнообразия синдромов, а встречаются синдром угнетения или возбуждения. К тому же, на неврологический статус оказывает значительное влияние общая тяжесть состояния ребёнка, обусловленная полиорганной недостаточностью, гемодинамическими расстройствами и соматической патологией. У детей исследуемых групп отмечались синдром угнетения и синдром возбуждения, у недоношенных детей также имели место судороги на фоне общего угнетения центральной нервной системы. Рассматривая взаимосвязь синдромов и системы матриксных металлопротеиназ в нашем исследовании, было очевидно, что достоверной разницы между концентрациями ММП-1 у доношенных и недоношенных детей в плазме пуповинной крови не выявлено (при угнетении р=0,675, при возбуждении р=0,148). В тоже время достоверно значимо (р=0,012) отмечается повышение концентрации ММП-1 в плазме венозной крови на 3-4 й день жизни у недоношенных детей при синдроме угнетения, а у доношенных снижение – при синдроме возбуждения (р=0,443). Таблица 24 демонстрирует продолжающуюся активацию ММП-9 у недоношенных детей на 3-4-й день с достоверностью различий (110,11±4,838 нг/мл и 143,88±10,333 нг/мл, р=0,002 и 117,886±19,669 нг/мл и 178,557±28,468 нг/мл, р=0,023) при различных синдромах, однако у доношенных детей продолжение активации наблюдается только при синдроме угнетения (с 122,34±9,606 нг/мл до 145,51±20,321нг/мл, р=0,292). Таблица 24
Примечание. Результаты оценки при множественных парных сравнениях методом Холма -Сидака: - достоверность различий (р 0,05) при сравнении синдромов угнетения и возбуждени в группах доношенных или недоношенных детей, - достоверность различий (р 0,05) при сравнении синдрома возбуждения у недоношенных и доношенных детей. По критерию Вилкоксона сравнивались исходные данные с данными на 3-4-й день жизни.
В плазме пуповинной крови концентрация ТИМП-1 у детей исследуемых групп достоверно значимых различий при синдромах не имела. А в плазме венозной крови у недоношенных детей на 3-4-й день жизни при угнетении и возбуждении отмечается достоверное повышение концентрации ТИМП-1 (23,94±1,454 и 34,877±2,394, р 0,001, 24,043±3,499 и 28,23±4,621, р=0,023) (таблица 24). У доношенных детей при синдроме возбуждения на 3-й день отмечается достоверно значимое снижение концентрации ТИМП-1 (25,987±1,887 и 15,673±1,398, р=0,016) в сравнении в сравнении с исходной. Однако у недоношенных детей при синдроме возбуждения на 3-й день жизни в плазме венозной крови концентрация ТИМП-1 в сравнении с доношенными была значительно выше (28,23±4,621 и 15,673±1,398, р 0,001). На 3-4-й день в плазме венозной крови отмечается достоверно значимое повышение концентрации белка S100В (р=0,002, р=0,012) у всех недоношенных детей , в то же время у доношенных детей только при синдроме угнетения (р 0,001).
Таким образом, максимальная активность ММП-1 наблюдалась у детей в группах с синдромом угнетения на 3-й день, также на 3-й день отмечалось и увеличение концентрации ММП-9, однако наибольший уровень наблюдался у недоношенных детей с синдромом возбуждения. Минимальная концентрация тканевого ингибитора ММП (ТИМП-1) была у доношенных детей с синдромом возбуждения на 3-й день. Учитывая репаративный эффект белка S100В очевидно увеличение её концентрации в обеих группах, особенно у доношенных детей с синдромом угнетения и у недоношенных – с синдромом возбуждения. ГЛАВА 6
Результаты настоящего исследования, представленные в предыдущих главах, свидетельствуют, что при рождении параметры состояния системы матриксных металлопротеиназ (ММП-1, ММП-9, ТИМП-1, ММП-1/ТИМП-1, ММП-9/ТИМП-1) и уровни маркеров повреждения нервной ткани (белок S100B) и при гипоксии (лактат) в плазме пуповинной крови значимо различались у здоровых новорожденных и детей с перинатальным гипоксическим поражением ЦНС. В частности, при перинатальной гипоксии регистрировались признаки активации системы ММП с нарастанием в крови маркера повреждения ЦНС – белка S100B. Однако деление новорожденных с ПГП ЦНС на доношенных и недоношенных выявили различия только по некоторым представителям системы ММП. Более значимая активация этой протеолитической системы наблюдалась к 3-4 суткам жизни новорожденных, причем наиболее выраженная активация металлопротеиназ наблюдалась при тяжелом гипоксическом поражении ЦНС.
В связи с этим мы посчитали правомерным оценить диагностическую ценность указанных маркёров для идентификации новорожденных с перинатальным гипоксическим поражением ЦНС и без такового в зависимости от срока родоразрешения (доношенные и недоношенные) и тяжести поражения ЦНС в раннем неонатальном периоде. В настоящей главе представлены результаты оценки диагностического потенциала использования параметров системы матриксных металлопротеиназ и маркеров повреждения и гипоксии при рождении и на 3-4 сутки жизни новорожденных.
При проведении ROC-анализа результатов оценки состояния системы матриксных металлопротеиназ [89,119,193,209], маркеров повреждения и гипоксии мы определили диагностические пороги этих маркеров в плазме пуповинной крови для ранней диагностики и прогноза перинатальных гипоксических поражений ЦНС.
Площади под ROC-кривыми характеризуют значимость диагностических (прогностических) тестов, при этом, чем больше площадь под кривыми, тем лучше диагностические (прогностические) характеристики исследованных маркеров [131]. Наибольшие площади под ROC – кривыми в плазме пуповинной крови представлены у ММП-9, отношения ММП-9/ТИМП-1, белка S100В и ММП-1. В то же время на 3-4-й день отмечается уменьшение площадей у отношений ММП-1/ТИМП-1 и ММП-9/ТИМП-1 при увеличении у биомаркёров. В таблице 25 представлены результаты этого исследования. В представленной таблице 25 продемонстрировано, что чувствительность этих параметров составляла от 32% у ММП-1 до 80% у ТИМП-1, а специфичность – от 84% у лактата до 100 % у ММП-1 при соответствующем диагностическом пороге (таблица 25 27) в плазме пуповиной крови и чувствительность от 36% у ММП-1 до 68% у белка S100В и специфичность от 84% у лактата до 100% у ММП-1 в плазме венозной крови на 3-4-й день жизни