Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современный взгляд на проблему пищевой аллергии ( обзор литературы) 12
1.1. Факторы, способствующие развитию пищевой аллергии 13
1.2. Механизмы формирования пищевой аллергии и оральной толерантности .17
1.3. Роль микробиоты кишечника в развитии пищевой аллергии и ее влияние на иммунитет слизистых оболочек .25
1.4. Роль грудного молока в профилактике пищевой аллергии у детей .31
1.5. Принципы диетологической профилактики пищевой аллергии 35
Глава 2. Материалы и методы исследования.
2.1. Дизайн исследования. Требования к пациентам, включенным в исследование 38
2.2. Методы клинического исследования .39
2.2.1.Сбор аллергологического анамнеза 40
2.2.2. Клинический осмотр беременных женщин и ими рожденных детей 41
2.2.2. Биохимические методы 42
2.2.2.1. Исследование проницаемости кишечной стенки .42
2.2.2.2. Биохимическое исследование кала беременных женщин .43
2.2.3. Микробиологическое исследование кала у детей 48
2.2.4. Иммунологические методы обследования 51
2.2.4.1.Исследование аллергенспецифических
IgE–антител в копрофильтратах 51
2.2.4.2 Исследование цитокинов и sIgA в грудном молоке .53
2.2.5. Статистический анализ данных 54
Глава 3. Общая характеристика наблюдаемых пациентов
3.1.Характеристика беременных женщин .56
3.2. Характеристика новорожденных детей .58
3.3. Характеристика детей с атопическим дерматитом 63
Глава 4. Исследование экскреции с мочой -лактоальбумина грудного молока у новорожденных детей 71
Глава 5. Показатели цитокинов в грудном молоке здоровых женщин и женщин, страдающих аллергическими заболеваниями .. 75
Глава 6. Результаты исследования микробиоты кишечника у беременных женщин и детей из группы высокого риска развития пищевой аллергии 81
Глава 7. Обсуждение полученных результатов 92
Выводы 100
Практические рекомендации 101
Список литературы 102
- Механизмы формирования пищевой аллергии и оральной толерантности
- Роль грудного молока в профилактике пищевой аллергии у детей
- Клинический осмотр беременных женщин и ими рожденных детей
- Характеристика детей с атопическим дерматитом
Механизмы формирования пищевой аллергии и оральной толерантности
При попадании в желудочно-кишечный тракт пищевые антигены способны вызывать местный и системный иммунный ответ, иммунную память и иммунную толерантность. Иммунный ответ слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта обусловлен поступлением антигена в пейеровы бляшки, в которых происходит их взаимодействие с Т- и В-лимфоцитами. Пройдя через системную циркуляцию, лимфоциты возвращаются в собственную пластинку слизистой оболочки кишки, в которой осуществляется их дифференцировка в зрелые антителосекретирующие (в основном IgA, при аллергии - IgЕ) эффекторные Т-лимфоциты и плазматические клетки [103].
Сенсибилизация к пищевым аллергенам может развиться при проникновении их в организм оральным путем, а также через воздействие пищевых аллергенов на дыхательный тракт и кожу. Однако оральный путь является основным путем их проникновения во внутренние среды организма. У детей первых месяцев жизни наибольшее значение для реализации генетических и иммунных механизмов в развитии пищевой аллергии и пищевой толерантности имеет состояние желудочно-кишечного тракта и его барьерных функций [69].
Барьер желудочно-кишечного тракта представляет собой сложную многоуровневую морфофункциональную систему, препятствующую поступлению генетически чужеродных соединений во внутреннюю среду организма. Он состоит из клеток слизистой оболочки кишечника, пристеночной микробиоты, слизи и местной иммунной системы.
Анатомически интестинальный барьер представлен эпителиальными клетками, расположенными на собственной пластинке слизистой оболочки кишечника. В собственной пластинке проходят кровеносные и лимфатические сосуды, располагаются пейеровы бляшки, одиночные лимфатические фолликулы, дендритные клетки, имеющие фибробластическое происхождение. Кишечный эпителий образован одним слоем столбчатых эпителиальных клеток, которые соединены плотными контактами в области апикального полюса и препятствует пассивной диффузии макромолекул. Это ограничивает антигены в просвете кишечника, препятствует диффузии иммуноглобулинов в просвет кишечника и создает надежный физический барьер.
В физиологических условиях слизистая кишечника покрыта биопленкой (бактериальный гликокаликс), внутри которой имеется экзополисахаридный матрикс микробного происхождения и муцин бокаловидных клеток слизистой оболочки [53]. Внутри этой биопленки устойчивость бактерий к воздействию неблагоприятных факторов в сотни раз выше, по сравнению с неиммобилизированными клетками, благодаря определенному составу слизи. Слизь обеспечивает барьерную функцию слизистой оболочки. В современном понимании слизь – это вязкоупругий секрет, основным структурным и функциональным компонентом которого является особый подкласс гликопротеинов – муцинов. Слизь образует непрерывный неперемешиваемый слой, толщина которого сильно варьирует в зависимости от отдела кишечника и состояния организма. Установлено, что связанные с муцинами секреторные иммуноглобулины IgA, противостоят бактериальной адгезии, а также благодаря способности связывать белки с образованием комплексов снижают скорость всасывания пищевых нутриентов [45]. В кишечнике у детей первых месяцев жизни продуцируется меньшее количество sIgA. Eсли этот физиологический дефицит не компенсируется sIgA грудного молока, то проницаемость кишечного барьера усиливается, нарушается формирование толерантности к пище, что может привести к развитию ПА. Другие компоненты слизи (лизоцим и лактоферрин) повышают сопротивляемость интестинального барьера. Лизоцим, взаимодействуя с гликопротеинами слизи, осуществляет бактериальный лизис. Лактоферрин из-за своего сходства с железом, оказывает бактериостатическое действие.
Таким образом, слой слизи, секреторные иммуноглобулины и сапрофитная флора представляют собой полноценный надэпителиальный барьер, защищающий слизистую оболочку от дегидратации макромолекул, физической и химической агрессии, микроорганизмов и токсинов [53].
Помимо физического и химического барьеров, создаваемых эпителием, микробиотой и слизистым слоем, иммунологическая защита является неотъемлемой частью функции интестинального барьера. Было подсчитано, что более 2/3 всех лимфоцитов в теле человека находятся в интестинальном эпителии и подэпителиальных слоях. Защитные свойства слизистых оболочек поддерживают баланс между способностью к обеспечению защитного иммунного ответа по отношению к инфекционным агентам и способностью выдерживать нагрузку антигенов присутствующих в интестинальных полостях. Иммунная система слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта выступает в качестве первого уровня защиты и снижает нагрузку на общий иммунитет являясь, таким образом, важным элементом в поддержании здоровья организма хозяина [85,144,179]
Результаты последних лет свидетельствуют о том, что эпителий слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта больше, чем просто инертный физический барьер. Эпителиальные клетки экспрессируют молекулы МНС класса II и таким образом, могут действовать как неспециализированные АРС (антиген-презентирующие клетки), которые не имеют обычные ко-стимулирующие молекулы и способствуют тем самым развитию анергии или толерантности [98].Кроме того, такие факторы, как - TGF-, ретиноевая кислота, ГЬ-10,вазоактивный кишечный пептид, TSLP, фактор роста гепатоцитов, воздействуют на кишечные дендритные клетки (ДК) в Lamina propria, регулируют иммунные реакции и обеспечивают кишечный гомеостаз [106]. Так, ретиноевая кислота (RA), которая в сочетании с TGF- имеет важное значение для дифференцировки Treg индуцированной ДК [107]. TSLP (тимус стромальный лимфопоэтин) активирует экспрессию OX40L на ДК и приводит к Тh2 ответу [77]. TSLP способствует системной базофилии, что приводит к увеличению Тh 2 цитокинов и синтезу IgE [185].
В индукции первичного иммунного ответа на вторжение чужеродных антигенов наиболее важную роль играют антигенпрезентирующие клетки: клетки Лангерганса и дендритные клетки. Особенность всех антигенпрезентирующих клеток состоит в том, что они несут на своей поверхности высокоаффинные рецепторы для IgE. Принято различать два класса Fc домена рецептора IgE антител на клетках иммунной системы: высокоаффинный I типа - FcsRI, способный связывать мономерный IgE и низкоаффинный II типа - FcsRII, или CD23, который взаимодействует, главным образом, со связанным IgE. При кожных проявлениях пищевой аллергии клетки Лангерганса и дендритные клетки, в том числе, так называемые воспалительные эпидермальные, экспрессируют их в довольно высокой концентрации [227].
Роль грудного молока в профилактике пищевой аллергии у детей
Приготовление серийных разведений производилось по следующей методике – бралось 8-9 чистых, стерильных химических пробирок. В каждую пробирку вносилось 4,5 мл буферного раствора. Из пробирки с первым разведением чистой стерильной пипеткой (объемом 1 см3 ) 0,5 мл гомогенной взвеси вносилось в пробирку с 4,5 мл буферного раствора (разведение №2) и тщательно перемешивалось. Далее из разведения №2 отбирались 0,5 мл гомогенной взвеси и вносились в пробирку №3 с 4,5 мл буферного раствора и так далее. Обычно использовали восемь разведений. При необходимости (например, сливной рост в 8 разведении) количество разведений увеличивали до необходимого числа.
Посев материала на питательные среды. Из полученных разведений, начиная с последнего, сеяли по 1 капле на соответствующие питательные среды. Далее чашку с материалом подсушивали и ставили в термостат. Для более точного качественного анализа всех вариантов кишечных палочек, энтеробактерий, гемолизирующих форм бактерий дополнительно высевали по 1 капле из 4,5,6,7 разведений на соответствующие питательные среды и равномерно распределяли с последующим высевом на плотные среды. Из основного разведения делали ряд последующих разведений в буферном растворе с 10-3 до 10-10, производили высев на соответствующие питательные среды. Инкубация всех посевов выполнялась при 37-38С.
Количественное содержание бифидобактерий определяли следующим образом: опускали пипетку до дна пробирки, сеяли 1 мл суспензии из разведений 10-5 – 10-10 в высокий столбик в полужидкую печеночную среду Блаурокка. После посева пробирки инкубировали 48 часов при температуре 37С и делали мазки, окрашенные по Граму.
Посев для учета лактобактерий производили на полужидкую среду МРС-агар, разлитую в высокие столбики, поскольку в этих условиях легче создавать дефицит кислорода, после чего регистрировали образование газа, характерного для некоторых видов лактобактерий. Посев производили по 0,05мл из разведений 10-5- 10-7. Засеянные полужидкие среды инкубировали 48 часов при температуре 37С. Рост лактобактерий в жидкой среде вызывал помутнение всего столбика. Из полужидкой среды делали мазки и окрашивали по Граму. При микроскопии определяли наибольшее разведение кала, из которого выросли лактобактерии.
Выделение энтерококков производили на чашках Петри с селективной питательной средой (ДИФ-3), на которую высевали 0.1 мл суспензии из разведений 10-4 -10-6 и инкубировали 72 часа при температуре 42С. Выросшие колонии микроскопировали, окрашивая по Граму. Для дифференциальной диагностики энтерококков от других кокковых форм проводился тест на каталазу.
Стафилококки определяли при посеве 0,05 мл на желточно-солевой агар в чашки Петри из разведений 10-3 и 10-5. После инкубации в течении 24 часов, учитывали количество стафилококков и определяли лицитиназную активность. Через сутки петлю агаровой культуры стафилококка пересевали через бульон на поверхность 5% кровяного агара для выявления гемолитической активности.
Дрожжеподобные грибы рода Candida выделяли при посеве на среду Сабуро. После стерилизации в среду вместе с глюкозой добавляли левомицетин из расчета 53 мг на 1 литр среды. Вместо левомицетина использовали стрептомицин или неомицин по 500ЕД ex temporo. Посев производили из разведений 10-3 и 10-5. Через 48 часов инкубации при температуре 37С выросшие колонии микроскопировали. Посев для выделения грамотрицательных палочек производился на среды Эндо, Плоскирева, Левина и на 3-5% кровяной агар. Посев осуществляли из разведений 10-3–10-5-10-6 по 0,5 мл на чашки Петри и растирали стерильным шпателем. Общее количество микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae определяли посевом капли (0,05мл) суспензии из разведений 10-5 и 10-8 на четыре сектора чашки со средой Левина. Из разведений 10-3 осуществляли посев 0,1 мл на среду Плоскирева без антибиотика и из 10-5 на среду Эндо, равномерно растирая шпателем посевной материал. На кровяном агаре проводили учет морфологически различных колоний с гемолитическими свойствами, вычисляли их процент от общего количества выделенных микроорганизмов этого семейства. Посев материала для выделения анаэробных спорообразующих бактерий рода Clostridium производили на среду Вильсон – Блера. В пробирки с высоким столбиком засевали по 1 мл исследуемой взвеси фекалий из разведений 10-3–10-5-10-7. Оценка результатов. Количественное содержание всех видов микроорганизмов в одном грамме фекалий определяли по числу выросших на соответствующей среде колоний с учетом объема посевного материала и степени его разведения.
Клинический осмотр беременных женщин и ими рожденных детей
Исследование роли питания беременных женщин и кишечной микрофлоры как факторов, определяющих процессы нормального развития плода и формирование иммунного ответа ребенка, имеют важное научно-практическое значение.
Для определения влияния пробиотика Lactobacillus reuteri и характера питания на развитие аллергических состояний у детей первых месяцев жизни, были выделены две группы беременных женщин. Основную группу (n=58) составили беременные женщины, получающие гипоаллергенную диету (исключение орехов, морепродуктов, шоколада, цитрусовых) и пробиотик Lactobacillus reuteri. Контрольную группу (n=50) составили беременные женщины, получающие стандартные диетические рекомендации, предлагаемые в женской консультации.
Для коррекции дисбиотических нарушений использовался препарат, содержащий лактобактерии Lactobacillus reuteri, в виде жевательных таблеток Рела Лайф в дозе 5 мг/сут (Верман, Финляндия). Рела Лайф – пробиотик, предназначенный для детей с первых дней жизни и взрослых: содержит уникальный штамм живых кисломолочных бактерий – Lactobacillus reuteri рrotectis, эффективность которых в нормализации микрофлоры кишечника доказана в ряде клинических исследований (8,9.10).
Наблюдение за беременными женщинами проводили на протяжении всего периода применения Lactobacillus reuteri (до родов). После родов наблюдение осуществляли за детьми, рожденными от этих женщин, в течение 6 месяцев жизни, при этом оценку состояния детей и появления симптомов АтД проводили до введения прикорма.
Для определения состава кишечной микрофлоры беременных до и после родов всем беременным на 33-34 неделе беременности и 4-5 неделе после родов было проведено биохимическое исследование фекалий методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ), основанном на определении метаболической активности микрофлоры по спектрам и уровням летучих жирных кислот [2,3]. Результаты биохимического исследования метаболической активности кишечной микрофлоры у 108 беременных женщин основной и контрольной групп до соблюдения специальных диетических рекомендаций были однотипными, в связи с чем их показатели были объединены (табл.6.1). Таблица 6.1. Результаты биохимического исследования метаболической активности кишечной микрофлоры у женщин основной и контрольной группы в последнем триметре беременности до приема Lactobacillus reuteri (n=108)
С2-С4 монокарбоновых кислот отмечено повышение относительного количества уксусной кислоты при сниженном содержании пропионовой (С3) и масляной (С4) кислот (р 0,01). Выявлены низкие показатели (изо С4 + изоС5 + изоС6) и повышение соотношения изокислот к монокрабоновым кислотам (изоCn/Сп).
Полученные данные свидетельствуют о снижение метаболической активности молочнокислой флоры: бифидумабактерий и лактобактерий и появление штаммов с измененными свойствами. Низкие значения пропионовой кислоты указывают на нарушение синтеза биогенных аминов, которые блокируют адгезию патогенов. При этом повышается активность отдельных штаммов аэробных бактерий, обладающих протеолитической активностью: сапрофитных штаммов стрептококков и стафилококков при снижении активности анаэробных микроорганизмов – бактероидов, эубактерий и клостридий. Снижение масляной кислоты указывает на энергодефицит колоноцитов или является признаком недостатка в рационе питания пищевых волокон. Смещение окислительно-восстановительного потенциала внутрипросветной среды смещен в сторону отрицательных значений, что свидетельствует о дисбалансе аэробных/анаэробных популяций микроорганизмов. Все эти изменения в микробиоте кишечника согласуются с наличием частых запоров, которые наблюдались у беременных женщин.
Таким образом, выявленные нарушения в микробиоте кишечника у беременных женщин создают предпосылки для изменения иммунного гомеостаза и воздействия рецепторов врожденного иммунитета ребенка на дифференцировку Т-лимфоцитов в направлении как регуляторных, так и эффекторных клеток, снижая противоинфекционную защиту в ЖКТ и за его пределами. Употребеление гипоаллергенной диеты и пробиотика Lactobacillus reuteri (Рела Лайф) в течение последнего триместра у беременных женщин оказало положительное влияние на их общее самочувствие и состояние ЖКТ. У подавляющего большинства беременных женщин (84,5%) отмечено исчезновение запоров. Причем в 2,5 раза уменьшилась частота жалоб на запоры в основной группе и в 1.4 раза в контрольной группе. Отмечена хорошая переносимость Lactobacillus reuteri у наблюдаемых женщин. Побочных реакций на его прием не отмечено.
Динамика показателей биохимического исследования метаболической активности кишечной микрофлоры у беременных женщин основной группы на фоне приема Lactobacillus reuteri представлена в табл. 6.2. Таблица 6.2.Динамика показателей биохимического исследования метаболической активности кишечной микрофлоры у беременных женщин основной группы на фоне приема Lactobacillus reuteri (n=58)
Как видно, использование данного пробиотика у женщин основной группы способствовало достоверному повышению суммарного количества монокарбоновых и изокислот (р 0,001), а также у них отмечено повышение метаболической активности молочнокислой флоры и восстановление баланса между аэробными/анаэробными микроорганизмами. На этом фоне обмечалось уменьшение запоров у беременных женщин этой группы и частоты обострений аллергичесикх заболеваний. В то же время у беременных женщин контрольной группы не обнаружено статистически значимых изменений в показателях кишечной микробиоты (табл.6.3).
Характеристика детей с атопическим дерматитом
У детей с высокой экскрецией -лактальбумина в моче в 1,95 раза чаще регистрировалась семейная предрасположенность к аллергическим заболеваниям по сравнению с детьми, имевших низкие значения этого белка (77,8% и 40,4% соответственно, P 0,05). Установлена прямая корреляционная связь между отягощенным семейным анамнезом по аллергическими заболеваниями и высокой экскрецией с мочой лактальбумина (r=+0,67). При исследовании микробиоты кишечника у наблюдаемых детей в кале выявлялся Staphylococcus aureus ( 105 КОЕ/г), причем чаще у детей с высокой экскрецией -лактальбумина в моче, чем у детей низкими значениями этого белка (88,9% против 21,2%, P 0,05) . Проведенный корреляционный анализ выявил взаимосвязь между высокой экскрецией лактальбумина в моче и повышенным количеством Staphylococcus aureus (r=+0,58). В отношении бифидомбактерий и других представителей нормальной и условно патогенной микрофлоры статистически значимых различий в обеих группах не установлено. В ходе наблюдения было выявлено, что в группе детей с высокой экскрецией -лактальбумина в моче частота встречаемости атопического дерматита была выше, чем у детей с низкими значениями этого биомаркера (66,7% против 3,8%, P 0,01) .
Таким образом, высокий уровень -лактальбумина грудного молока в моче новорожденных детей характеризует повышенную проницаемость барьера желудочно-кишечного тракта и способствует развитию пищевой аллергии у младенцев в виде атопического дерматита. При исследовании концентрации цитокинов IL-17, IL-2, TGF-, а также slgA в грудном молоке женщин были выявлены следующие особенности. В грудном молоке кормящих женщин, страдающих аллергическими заболеваниями или имеющих аллергические проявления в семье, выявлялись низкие показатели sIgA, TGF- и высокие IL-17 по сравнению с кормящими женщинами без аллергии. Не выявлено статистически значимых различий концентраций IL-2 в грудном молоке у женщин в двух наблюдаемых группах. Выявленный цитокиновый дисбаланс у корящих матерей с аллергией (низкие значения TGF- и высокие уровни IL-17) по-видимому, является основой для развития пищевой аллергии, как пускового фактора для аллергических заболеваний. С некоторой долей вероятности это подтверждается данными клинического наблюдения за детьми от этих матерей, у которых чаще наблюдались кожные проявления аллергии (Р 0,05).
Для определения влияния пробиотика Lactobacillus reuteri и характера питания на развитие аллергических состояний у детей первых месяцев жизни, были выделены две группы беременных женщин. Основную группу (п=60) составили беременные женщины, получающие гипоаллергенную диету (исключение орехов, морепродуктов, шоколада, цитрусовых) и пробиотик Lactobacillus reuteri. Контрольную группу (п=48) составили беременные женщины, получающие стандартные диетические рекомендации, предлагаемые в женской консультации.
Исследование микробиоты кишечника у наблюдаемых беременных женщин на 33-35 недели беременности до соблюдения специальных диетических рекомендаций были однотипными. У большинства 84(77,8%) беременных женщин отмечалось достоверное снижение суммарного количества изучаемых кислот Ci (р 0,01). В профиле С2-С4 монокарбоновых кислот отмечено повышение относительного количества уксусной кислоты при сниженном содержании пропионовой (С3) и масляной (С4) кислот (р 0,01). Выявлены низкие показатели (изо С4 + изоС5 + изоС6) и повышение соотношения изокислот к монокрабоновым кислотам (изоCn/Cn). Полученные данные свидетельствуют о снижении метаболической активности молочнокислой флоры (бифидумабактерий и лактобактерий) и появление штаммов с измененными свойствами. Низкие значения пропионовой кислоты указывают на нарушение синтеза биогенных аминов, которые блокируют адгезию патогенов. При этом повышена активность отдельных штаммов аэробных бактерий (стрептококков и стафилококков) при снижении активности анаэробных микроорганизмов (бактероидов, эубактерий и клостридий). Употребеление гипоаллергенной диеты и пробиотика Lactobacillus reuteri (Рела Лайф) в течение последнего триместра у беременных женщин оказало положительное влияние на их общее самочувствие и состояние ЖКТ. У подавляющего большинства беременных женщин (84,5%) отмечено исчезновение запоров. Причем в 2,5 раза уменьшилась частота жалоб на запоры в основной группе и в 1.4 раза в контрольной группе. Отмечена хорошая переносимость Lactobacillus reuteri у наблюдаемых женщин. Побочных реакций на его прием не отмечено. Использование данного пробиотика у женщин основной группы способствовало достоверному повышению метаболической активности молочнокислой флоры и восстановление баланса между аэробными/анаэробными микроорганизмами. На этом фоне обмечалось уменьшение запоров у беременных женщин этой группы и частоты обострений аллергичесикх заболеваний. В то же время у беременных женщин контрольной группы не обнаружено статистически значимых изменений в показателях кишечной микробиоты .