Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 13
1.1. Правастатин - лекарственное вещество для снижения уровня холестерина в крови 13
1.1.1. История открытия статинов 14
1.1.2. Физико-химические свойства правастатина 16
1.1.3. Получение правастатина
1.1.3.1. Методы культивирования штаммов-продуцентов 19
1.1.3.2. Условия, необходимые при лабораторном культивировании 21
1.1.3.3. Аппаратура, необходимая для проведения ферментации 25
1.1.3.4. Мутагенез штаммов продуцентов 26
1.2. Предпосылки применения статинов в защите растений 27
1.2.1. Роль фитостеринов для патогенов и вредителей 29
1.2.2. Роль меланинов патогенных грибов 32
1.2.3. Химические блокаторы синтеза стеринов 35
Глава II. Материалы и методы 39
2.1. Материалы 39
2.1.1. Штамм 39
2.1.2. Фитопатогены 39
2.1.3. Растворы правастатина 40
2.1.4. Эргостерин 40
2.1.5. Растительные объекты, химические реактивы, компоненты сред 40
2.2. Методы 42
2.2.1. Методы изучения меланин-ингибирующих и фунгицидных свойств правастатина in vitro 42
2.2.2. Приготовление раствора эргостерина
2.2.3. Изучения механизма действия правастатина против фитопатогенных грибов in vitro 43
2.2.4. Методы изучения фунгицидных свойств правастатина на растениях 43
2.2.4.1. Методы изучения защитного действия правастатина на устойчивость пшеницы к возбудителю септориоза в лабораторных условиях 43
2.2.4.2. Методы изучения защитного действия правастатина против возбудителя темно-бурого гельминтоспориоза ярового ячменя в лабораторных условиях 44
2.2.4.3. Методы изучения защитного действия правастатина против коричневой пятнистости табака в лабораторных условиях 45
2.2.4.4. Методы изучения защитного действия правастатина против гельминтоспориоза ярового ячменя в лабораторных условиях 47
2.2.4.5. Методы изучения защитного действия правастатина против гельминтоспориоза ярового ячменя в полевых условиях 49
2.2.5. Методы изучения антивирусной активности правастатина 55
2.2.5.1. Методика выявления защитного действия правастатина против вируса табачной мозаики (ВТМ) 55
2.2.5.2. Методика изучения механизма защитного действия правастатина против ВТМ 57
2.2.5.3. Методика определения способности правастатина оказывать прямое действие на ВТМ 58
2.2.5.4. Методика оценки влияния правастатина на устойчивость картофеля к различным вирусам 58
2.2.6. Методы получения высокопродуктивных мутантов S. xanthochromogenes 59
2.2.7. Методы биосинтеза правастатина в глубинной культуре 60
2.2.8. Приготовление водно-спиртового раствора натриевой соли
компактина 64
2.2.9. Методы хроматографического анализа 64
Глава III. Результаты и обсуждение 67
3.1. Возможность использования правастатина в защите растений 67
3.1.1. Влияние правастатина на рост ряда фитопатогенных грибов in-vitro 67
3.1.2. Влияние правастатина на гельминтоспориозную корневую гниль ярового ячменя in-vitro 70
3.1.3. Влияние правастатина на устойчивость пшеницы к возбудителю септориоза 3.1.4. Влияние правастатина на устойчивость ячменя к возбудителю темно-бурого гельминтоспориоза 75
3.1.5. Влияние правастатина на развитие коричневой пятнистости на листьях табака 76
3.1.6. Влияние правастатина на гельминтоспориозную корневую гниль на проростках ячменя в лабораторных условиях 78
3.1.7. Влияние правастатина на устойчивость ярового ячменя против возбудителей гельминтоспориоза в полевых условиях 79
3.1.8. Влияние раствора правастатина, содержащегося в культуральной жидкости S. xanthochromogenes, на устойчивость табака сорта Xanthi к вирусу табачной мозаики (ВТМ) при натирании листьев растения 88
3.1.9. Влияние растворов чистого вещества правастатина на устойчивость табака сорта Xanthi к ВТМ при опрыскивании листьев растения 91
3.1.10. Определение способности правастатина оказывать прямое действие на ВТМ 93
3.1.11. Влияние правастатина на устойчивость картофеля к М вирусу при естественном заражении в полевых условиях 94
3.2. Подбор оптимальных условий получения правастатина 96
3.2.1. Получение высокопродуктивных штаммов S. xanthochromogenes с помощью многоступенчатого мутагенеза 97
3.2.2. Влияние различных количеств растворенного кислорода (рО2) на продуктивность культуры 99
3.2.3. Подбор оптимального количества соевой муки 101
3.2.4. Подбор оптимальной концентрации глюкозы в исходной питательной среде 102
3.2.5. Подбор оптимального режима добавления глюкозы во время ферментации 104
3.2.6. Подбор оптимальных концентраций дрожжевого экстракта и пептона 105
Заключение 109
Выводы 112
Список публикаций по теме диссертации 114
Список использованной литературы 115
- Методы культивирования штаммов-продуцентов
- Растворы правастатина
- Методика выявления защитного действия правастатина против вируса табачной мозаики (ВТМ)
- Влияние различных количеств растворенного кислорода (рО2) на продуктивность культуры
Методы культивирования штаммов-продуцентов
В настоящее время остро стоит проблема заболеваний сердечнососудистой системы (ССЗ), которые являются основной причиной смерти во всем мире. В 2008 году от ССЗ умерло 17,3 миллиона человек, что составило 30% всех случаев смерти в мире, из них 7,3 миллиона человек умерло от ишемической болезни сердца (ИБС) и 6,2 миллиона человек от инсульта (по данным всемирной организации здравоохранения на 2011год). Более 80% случаев смертности от CCЗ происходит в странах c низким и средним уровнем дохода, в равной мере среди женского и мужского населения. По прогнозам к 2030 году почти 23,3 миллиона человек умрет от ССЗ (по данным Мирового отчета по неинфекционным заболеваниям, 2010 г. Женева, ВОЗ). Самой распространенной причиной инфарктов и инсультов является закупоривание сосудов, которое препятствует притоку крови к сердцу и мозгу. Причиной этому является образование жировых отложений на внутренних стенках кровеносных сосудов, атеросклеротическим поражением артерий, в большинстве случаев из-за высокого уровня холестерина в крови. (Аронов, 2001; Шевченко, 2003).
Из всех известных на сегодняшний день антигиперлипидемических препаратов наиболее оптимальными в плане клинической эффективности являются статины - как природные, так и синтетические соединения. Статины способны эффективно замедлять процесс развития атеросклероза, снижая показатели заболеваемости и летальности у больных с различными формами атеросклеротического поражения ССЗ (Tonkin , Illingworth 1997 г.) Данные соединения, являясь продуктами вторичного метаболизма ряда грибов и актиномицетов, способны специфически ингибировать 3-окси-3-метилглютарат-КоА-редуктазу, катализирующую реакцию образования мевалоната из 3-окси-3-метилглютарат-коэнзима А (ОМГ-КоА), одного из ключевых ферментов, участвующих в биосинтезе стеринов (Шевченко и Шевченко, 2003).
Статины снижают содержание внутриклеточных пулов за счет обратимого подавления активности ОМГ-КоА редуктазы, что приводит к увеличению количества рецепторов для липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) на поверхности клетки и к повышению уровня разложения и выведения из организма ЛПНП. Так же статины подавляют образование ЛПНП за счет подавления синтеза в печени липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП) и их предшественников (Kaneko et al., 1978; Tsujita et al.,1979; Kuroda et al., 1979; Yamamoto et al., 1980; Manzoni, Rollini, 2002; Endo, 2004).
В 1950-х и 1960-х годах, стало очевидно, что повышенное содержание холестерина в плазме крови человека является основным фактором риска для развития ИБС. Об этом свидетельствовали работы многочисленных исследовательских групп (Tennet et al., 1960; Altshul et al., 1955 Thorp, Waring, 1962; Goldsmith et al., 1960; Hollander, Chobanian, 1959; Starr et al., 1960; Taupitz, Otaguro, 1959). Это привело к поиску лекарств, которые могли бы снизить уровень холестерина в крови. В течение 50-х и 60-х годов велся поиск ингибиторов биосинтеза холестерина, и было обнаружено много веществ, способных снижать его уровень в животных тканях. Такие найденные соединения как, никотиновая кислота (Altshul et al., 1955), холестирамин (Tennet et al., 1960), хлорфеноксиизобутиловая кислота, CPIB (Thorp, Waring, 1962), неомицин (Goldsmith et al., 1960) растительные стерины (Pollak, 1953) трипаранол (Hollander, Chobanian, 1959) Д-тироксин (Starr et al., 1960) и эстрогенные гормоны (Taupitz, Otaguro, 1959) могли блокировать различные стадии биосинтеза холестерина и существенно снижать его содержание в тканях исследуемых организмов. Однако, побочные эффекты этих препаратов ограничивали их применение на практике. Механизм действия растительных стеринов был основан на препятствовании всасывания холестерина в пищеварительном тракте. Эффективность действия растительных стеринов варьировала от пациента к пациенту (Endo et al., 1978).
Исследование путей биосинтеза холестерина показало, что начальным этапом этого пути является превращение ОМГ-КоА в мевалонат. (Siperstein, 1970; Siperstein, Fagon, 1966). Данный процесс катализируется ОМГ-КоА редуктазой. Блокирование активности этого фермента стало привлекательной целью в поиске лекарств для снижения концентрации холестерина в плазме крови. (Jonathan, 2003).
Группа японских ученых в 1970-х годах, возглавляемая доктором Akira Endo, протестировала более 6 000 штаммов микроорганизмов. В ходе исследований ими были получены первые субстанции, ингибирующие биосинтез холестерина в плазме крови человека: цитринин (citrinin) из гриба Pythium ultimum и компактин (мевастатин, ML-236B) из метаболитов гриба Penicillium citrinum. (Endo et al., 1976; Tanazawa et al., 1977; Сусеков, 2001). Впоследствии были обнаружены такие статины как ловастатин и правастатин. Цитринин необратимо связывался с ОМГ-КоА-редуктазой, но обладал нефротоксичностью, что исключало его использование в качестве лекарства. В 1980 году, испытания компактина были приостановлены по неизвестным причинам (предположительно, это было связано с серьезной токсичностью для животных). Из-за близкого структурного сходства между компактином и ловастатином, клинические исследования ловастатина также были приостановлены.
Растворы правастатина
Насекомые-фитофаги не умеют синтезировать предшественников гормонов линьки, но способны конвертировать растительные стерины в холестерин и другие стероиды, причем отдельные реакции таких превращений очень специфичны для разных видов. В природных условиях источниками незаменимых для насекомых стеринов служат растения, грибы, животные и другие организмы, которые умеют синтезировать необходимые стерины, входящие в состав их клеточных мембран и служащие предшественниками стероидных гормонов. Таким образом, существование насекомых находится в зависимости от окружающих их организмов, оно обусловлено надежным функционированием последовательных звеньев пищевой цепи продуцент - потребитель стеринов (Инге-Вечтомов 1997). Было показано, что изменение стеринового состава пищи приводило к негативному воздействию на развитие и размножение фитостерин-зависимых насекомых. К примеру, отсутствие фитостеринов в пшенице (Triticum sativum), было причиной нарушения развития репродуктивных органов у самок саранчи Locusta migratoria, что приводило к смертности эмбрионов (Ходжайова и др., 2000).
Мутационное изменение в синтезе стеринов у обычных хлебопекарных дрожжей (Гальцева, 1980) (Saccharomyces cerevisiae), позволяет регулировать развитие и плодовитость мухи Drosophila melanogaster, а следовательно, регулировать численность вида потребителя без тотального уничтожения. В связи с этим ингибиторы биосинтеза фитостеринов могут рассматриваться как потенциальные средства защиты растений от стеринзависимых паразитов (Инге-Вечтомов, 1997).
В лаборатории молекулярной биологии ВНИИ фитопатологии в 2002 году было выдвинуто предположение, что изменение состава фитостеринов под влиянием статинов (ловастатина и компактина) уменьшает сигнальные функции корневых выделений, которые являются индукторами иотрождения личинок паразитической нематоды Globodera rostohiensis из цист. Для подтверждения этого предположения через 2 недели после всходов растения картофеля подвергались обработке растворами статинов. Для получения корневых диффузатов через 7 дней после обработке по вегетации статинами у растений отделялись корни. Данный эксперимент показал, что применение 0,1% водных растворов компактина и ловастатина снижало активность отрождения личинок на 30 и 40% соответственно, в концентрации 0,01% на 22 и 14% ниже чем в контроле. На основании этих данным был сделан вывод, что применение водных растворов статинов снижало сигнальную функцию корневых выделений у обработанных растений, что ингибировало отраждение личинок нематоды из цист.
Так же паралельно были проведены исследования влияния обработок растений картофеля компактином против возбудителя фитофтороза пасленовых Phytophtora infestans. Опыт проводили в фазу бутонизации растений в лаборатории с использованием экспресс-метода оценки фитофторустойчивости сортов картофеля. Данный эксперимент показал, что листья опытных растений при искусственном заражении конидиями Ph. infestans в меньшей степени поражались патогенов, чем контрольные. Такие выводы были сделаны по двум параментрам инфекционного цикла. Заражение листьев обработанных растений было достоверно на 61,7% ниже чем в контроле, а диаметры разрастания некрозов ниже достоверно на 24%. (Приданников и др., 2003; Romanenko et al., 2002).
Многие виды фитопатогенных грибов вырабатывают биологически важный пигмент меланин. Меланин в грибах часто обеспечивает защитную роль, к примеру, защиту от ультрафиолетового излучения. Существует множество вопросов относительно химической структуры меланина, это связано с тем, что он нерастворим. Биосинтез меланина коррелирует с патогенностью некоторых фитопатогеных грибов. Так же пигмент может усиливать их резистентность к вредным воздействиям окружающей среды. Например, радиационно-стойкие меланизированные грибки могут выживать в суровых климатических условиях, включая Антарктиду и ядерные реакторы (Rosa et al., 2010; Zhdanova et al., 2000). Было обнаружено, что меланинсодержащие грибы могут выживать в посудомоечных машинах, где они выдерживают высокую температуру и моющие средства (Zalar et al, 2011). Основная причина интереса исследователей к изучению меланиновых пигментов в грибах обусловлена их способностью влиять на патогенность микроорганизмов.
Меланин в некоторых случаях играет ключевую роль в проникновении патогенов в растение-хозяина. Некоторые грибы образуют апрессории – структуры, проникающие в растительные ткани хозяина, что приводит к инфицированию патогенами растения. Меланин в клеточных стенках этих структур обеспечивает механическую прочность апрессорий, что и помогает проникновению в растительные ткани. Например, ингибирование синтеза меланина в Colletotrichum kahawae – возбудителя антракноза кофейного дерева, снижает давление тургора апрессории, а следовательно, вирулентность гриба (Chen et al., 2004). Блокирование биосинтеза меланина у возбудителя пирикуляриоза риса - Pyricularia oryzae Broome et Cavara (Magnaporthe oryzae), который локализован в клеточной стенке гриба, приводит к снижению проростаемости конидий, блокированию внедрения инфекционных гиф через кутикулу листа в эпидермис и разрастания мицелия в тканях растения-хозяина (Джавахия и др. 1990г). Меланизация апрессорий играет важную роль в вирулентности патогенов растений, что было показано на примере возбудителя пирикуляриоза риса - Pyricularia oryzae (Howard, Valent, 1996), а так же возбудителя черной пятнистояти роз - Diplocarpon rosae (Gachomo et al., 2010).
Методика выявления защитного действия правастатина против вируса табачной мозаики (ВТМ)
Для изучения защитного действия правастатина против коричневой пятнистости табака (возб. Alternaria longipes) использовали отделенные листья табака (Nicotiana tabacum) сорта Xanthi (NN). Табак размножали черенкованием in vitro, для чего помещали узел растения на модифицированную среду А5 (1/2 МS-солей; 20 г/л сахароза; 3 г/л фитогель). Полученные побеги срезали и помещали на ту же среду для укоренения. Хорошо укоренившиеся растения, имеющие по 2-3 листа, переносили в горшки (400 мл) с почвой. Растения табака выращивали при 16 часовой длине дня и температуре 22 0С днем и 20 0С ночью в климатической камере в горшках с почвой. Выращивали по пять растений табака до стадии 5-6 листьев. Для каждого из вариантов опыта отбирали по 5 листьев с разных растений.
Растворы правастатина готовили путем разведения культуральной жидкости S. xanthochromogenes.
Колонии патогенного гиба А. longipes обоеполые. Конидиеносцы в группах, но могут быть и одиночные, в основном бледного коричневого цвета. Длина до 80 мкм с толщиной до 5 мкм. Конидии могут содержать в себе от 3 до 7 септ, из низ 5-6 поперечных и одна или больше продольная или косая. Для получения спороносящей культуры патогена, гриб А. longipes выращивали на среде PCA [морковь – 20 г/л, картофель – 20 г/л, агар 15 г/л, стерилизация при 1 атмосфере в течение 1 часа, (Dhingra and Sinclair, 1986)] в стеклянных чашках Петри при постоянном освещении ультрафиолетовым светом в течение 14 дней при 20С. Левую половину листа обрабатывали натиранием 30 мкл смеси с карборундом, содержащей раствор правастатина в различных концентрациях. Правую половину листа обрабатывали 30 мкл смеси воды с карборундом. Сразу после нанесения растворов правастатина листья табака равномерно опрыскивали 50 мM раствором глюкозы, содержащей споровую суспензию A. longipes в концентрации 1 х 104 спор в 1 мл (De Bolle et al., 1996). Инокулированные листья инкубировали во влажной камере при 22 0С. Через 7 дней подсчитывали количество образовавшихся некрозов.
Лабораторную оценку действия правастатина против B. sorokiniana на проростках ярового ячменя сорта Зазерский 85 проводили с использованием метода анализа развития болезней в рулонах фильтровальной бумаги (Рис. 6) (ГОСТ 12044-93). Семена промывали стерильной дистиллированной водой (СДВ) и инкубировали в растворах с различной концентрацией правастатина в СДВ или в СДВ без добавления статина (контроль) в течение 16-18 часов (из расчета 50 мл/200 семян). После этого семена раскладывали в линию на полоски фильтровальной бумаги и равномерно наносили на семена суспензию спор патогена (103 спор/мл). Учитывали число проростков с пораженной корневой системой (распространенность заболевания) и интенсивность проявления симптомов заболевания (степень развития болезни), определяя балл развития болезни по 4-балльной шкале (Рис. 7) (ГОСТ 12044-93). Биологическую эффективность обработок рассчитывали по формуле Эббота (Abbott WS., 1925). Рисунок 6. Гельминтоспориозная корневая гниль, возбудитель Bipolaris sorokiniana
Полевую оценку действия правастатина против B. sorokiniana на яровом ячмене сорта Зазерский 85 проводили с использованием мелкоделяночного полевого эксперимента (Доспехов, 1985) на опытном поле ВНИИФ (Московская область) в период с мая по сентябрь 2009 г. и 2013 г. на естественном инфекционном фоне (Рис. 8). Предшественник – картофель. Семена ярового ячменя без поверхностного обеззараживания замачивали в растворах правастатина в различных концентрациях в течение суток. Учитывая, что источниками инфекции корневых гнилей являются не только больные семена, но и почва с растительными остатками, оценку осуществляли без дополнительного внесения патогенов. Контрольные и обработанные семена были высеяны на делянки площадью 1 м2 по 550 штук на каждую (повторность вариантов опыта четырехкратная, размещение делянок рендомизированное). Рисунок 8. Мелкоделяночный полевой эксперимент на опытном поле ВНИИФ (Московская область)
Учет полевой всхожести проводили в фазе 11-13 путем подсчета всходов на всей площади делянок (Zadoks, 1979), а учеты гельминтоспориозной корневой гнили - в фазы: конец кущения (ф. 29), молочно-восковой (ф.83). Учетную точку фиксировали с помощью рамки с ребром 0,5 погонных метра, т.е. в каждом варианте растения отбирали с 1,5 погонных метров (Рис. 9) (Гришечкина, 2004). Образцы доставляли в лабораторию, отмывали от почвы и анализировали, после чего рассчитывали показатели распространенности (процент пораженных растений) и степени развития болезни. Интенсивность поражения корневой гнилью определяли для каждого растения по 4-х балльной шкале ВИЗР (Рис. 7) (Пересыпкин и др., 1992). Рисунок 9. Отбор проб с помощью рамки 0.5 погонных метра
Средний показатель степени развития болези (R, %) рассчитывали по формуле R(%) = (nb)/4N100, где n - число растений с одним и тем же баллом, b – балл по шкале ВИЗР (от 0 до 4) (Рис. 7), N – число проанализированных растений, 4 – максимальный балл поражения. В сомнительных случаях визуально установленный диагноз проверяли микроскопическим методом, просматривая соскобы с инфицированной ткани сразу или после инкубирования ее фрагментов в течение 3 дней во влажной камере на фильтровальной бумаге или на 1.5% картофельно-глюкозном агаре.
Наблюдения за развитием сетчатой (Рис. 10), темно-бурой (Рис. 11) и полосатой пятнистостями листьев (Рис. 12) проводили в поле с фазы 29 по 75, а учет распространенности гельминтоспориоза колоса - в фазу мягкой восковой спелости зерна (ф. 85). В зависимости от фазы вегетации просматривали от одного до четырех ярусов листьев и листовых влагалищ основного побега, растущих рядом не менее 20 растений в случайно выбранном рядке каждой повторности.
Влияние различных количеств растворенного кислорода (рО2) на продуктивность культуры
Результаты изучения защитного действия правастатина против септориоза на изолированных листьях пшеницы свидетельствовали о способности правастатина подавлять развитие септориоза на изолированных листьях пшеницы, при концентрации правастатина в суспензии спор St. nodorum от 0,025% до 0,1% на 5 и 10 сутки (Рис. 24 и 25 соответственно). Так же было отмечено, что правастатин в исследуемых концентрациях не обладал фитотоксичностью. Концентрации ниже 0,025% не оказывали существенного влияния на развитие септориоза. Опыт проводили дважды в 3-х кратной повторности. 876673
Действие правастатина на развитие септориоза на листьях пшеницы, при совместном нанесении спор St. nodorum и правастатина (учет на 5-и сутки) Контроль Правастатин 0,025% Правастатин 0,05% Правастатин 0,075% Правастатин 0,1% Рисунок 25. Действие правастатина на развитие септориоза на листьях пшеницы, при совместном нанесении спор St. nodorum и правастатина (учет на 10-е сутки)
Результаты изучения защитного действия правастатина против темно бурого гельминтоспориоза на изолированных листьях ячменя свидетельствовали о его способности подавлять развитие патогена, при концентрации правастатина в суспензии спор В. sorokiniana 0,025%, 0,05%, и 0,1% на 7 сутки (рис. 26). Так же было отмечено, что правастатин в исследуемых концентрациях не обладал фитотоксичностью. Концентрации ниже 0,025% не оказывали влияния на развитие темно-бурого гельминтоспориоза. Опыт проводили дважды в 3-х кратной повторности. Контроль Правастатин 0,025%;
Анализ результатов исследования влияния обработок листьев табака, показал, что половинки листьев табака, обработанные раствором правастатина в концентрации 0,3% обладали повышенной устойчивостью к возбудителю альтернариоза, так как на них образовывалось меньше некрозов, чем на половинках листьев контрольных растений. Половинка листа, обработанная раствором правастатина в концентрации 0,5%, была менее всего поражена альтернариозом. Таким образом, обработка листьев табака растворами правастатина в концентрациях 0,3% и 0,5% визуально обладала защитным действием против патогенного гриба A. longipes. Результаты опыта представлены на рисунке 27.
Лабораторную оценку действия правастатина против B. sorokiniana на проростках ярового ячменя проводили с использованием метода анализа развития болезней в рулонах фильтровальной бумаги. (ГОСТ 12044-93).
Семена ячменя промывали дистиллированной водой и замачивали в растворах с различной концентрацией правастатина в течение 16-18 часов (из расчета 50 мл/200 семян). После этого семена раскладывали в линию на полоски фильтровальной бумаги и равномерно наносили на семена суспензию спор патогена (103 спор/мл).
Обработка семян ячменя правастатином в концентрации 0,05% не оказывала влияния на распространенность возбудителя гельминтоспориозной корневой гнили и степень развития болезни, поскольку различия между опытом и контролем в этом варианте были не достоверны (Табл. 4). Применение данного статина в более высокой концентрации (0,075%) сопровождалось достоверным снижением числа пораженных проростков, при этом биологическая эффективность была на уровне 27%. Пред-инокуляционная обработка семян правастатином в концентрации 0,1% с высокой достоверностью приводила к значительному подавлению степени развития болезни (Табл. 4).