Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1 Борьба с обыкновенным паутинным клещом в системе интегрированной защиты растений 9
1.1.1 Агротехнические и биологические меры борьбы с вредителями 9
1.1.2 Принципы классификации химических средств защиты растений 10
1.2 Биология и хозяйственное значение обыкновенного паутинного клеща 14
1.3Проявление резистентности паутинного клеща к примененным акарицидам. 18
1.4 Существующие представления о генетических и биохимических механизмах резистентности к акарицидам химических классов ФОС, МЕТИ и авермектинам 22
Экспериментальная часть 31
Глава 2. Материалы и методы исследований 31
2.1 Характеристика объекта исследований 31
2.2 Акарициды и синергисты биопроб 33
2.2.1 Фосфорорганические препараты (ФОС) 33
2.2.2 МЕТИ препараты 34
2.2.3 Микробиологические препараты 35
2.2.4 Синергетический эффект 36
2.3 Дизруптивный отбор генотипов и выбор резистентности линии клещей 37
2.4 Гибридологический анализ полученных генотипов 39
2.5 Выявление молекулярного маркера гена резистентности к ФОС методом электрофореза 41
2.6 Статистический анализ 42
Глава 3. Токсикологическая характеристика генотипов с аллеями резистентности к малатиону, фенпироксимайту и аверсектину 43
3.1 Токсикологическая характеристика линий клещей, отселектированных по критериям наличия или отсутствия признака резистентности к акарициду 43
3.2 Сопоставление полученных генотипов паутинного клеща по показателю резистентности (ПР) к селектирующим акарицидам при перекрёстном тестировании 48
3.3 Проявления признаков резистентности к акарицидам тех же химических групп у полученных генотипов паутинного клеща 50
Глава 4. Гибридологический анализ наследования признака резистентности к малатиону, к фенпироксимайту и к аверсектину . 55
Глава 5. Выявление биохимических различий в генетической экспрессии признаков резистентности к малатиону, фенпироксимайту и аверсектину 60
5.1 Сопоставление полученных генотипов при селекции малатионом, фенпироксимайтом и аверсектином по наличию у самок клеща карбоксилэстеразного изозима Е3 60
5.2 Сопоставление устойчивых к малатиону, фенпироксимату и аверсектину генотипов по действию на них токсикантов с синергистами 64
Глава 6. Токсикологическое сопоставление проявления признака резистентности к действующему акарициду у гомозиготных и дигетерозиготных по аллелям резистентности генотипов 70
Заключение 80
Благодарности 83
Список сокращений 84
Список литературы 85
- Принципы классификации химических средств защиты растений
- Токсикологическая характеристика линий клещей, отселектированных по критериям наличия или отсутствия признака резистентности к акарициду
- Сопоставление полученных генотипов при селекции малатионом, фенпироксимайтом и аверсектином по наличию у самок клеща карбоксилэстеразного изозима Е3
- Токсикологическое сопоставление проявления признака резистентности к действующему акарициду у гомозиготных и дигетерозиготных по аллелям резистентности генотипов
Принципы классификации химических средств защиты растений
Химические средства защиты растений в настоящее время являются неотъемлемой частью технологий возделывания сельскохозяйственных культур во всем мире. Они широко применяются также в процессе хранения и транспортировки готовой продукции, дезинфекции помещений. При этом на рынке представлено огромное количество биологически активных соединений и микробиологических препаратов.В Федеральном законе РФ определено, что пестициды - это химические или биологические препараты, используемые для борьбы с вредителями и болезнями растений, сорными растениями, вредителями хранящейся сельскохозяйственной продукции, бытовыми вредителями и внешними паразитами животных, а также для регулирования роста растений, предуборочного удаления листьев (дефолианты), предуборочного подсушивания растений (десиканты). Для того чтобы улучшить и ускорить процессы изучения и использования пестицидов, эти вещества классифицируются по 125 объектам применения, по способам проникновения в организм, характеру и механизму действия, а также по химическому строению (Баздырев, и др., 2014).
Интегрированная защита растений включает методы профилактики заселения (заражения) агроценозов вредными организмами, в том числе карантинные и организационно-хозяйственные мероприятия, использование устойчивых сортов и гибридов растений, проведение надлежащих агротехнических обработок, применение биологических и химических средств защиты растений. Химический метод зашиты растений в этой связи рассматривается как элемент интегрированной защиты растений, надежно и быстро сокращающий численность (плотность) популяций вредных объектов до экономически приемлемого уровня, когда иначе нельзя выполнить эту задачу. Интегрированная защита растений — это многоуровневая система защиты. Она может быть разработана как борьба с одним видом или с группой доминирующих видов вредных организмов на конкретном поле. С другой стороны, она же может быть организована в пределах севооборота или крупных ландшафтных агробиосистем (Баздырев, и др., 2014).
Применение химических средства защиты растений связано с возможным появлением экологических и токсикологических проблем, возникновением резистентных форм среди вредных организмов. Эти средства используются только после исчерпания профилактических мер борьбы с вредителями сельскохозяйственного производства по мере крайней необходимости и с большой ответственностью. Химические средства защиты растений различают: по целевому их использованию – фунгициды; бактерициды; антивирусные препараты; инсектициды; акарициды; родентициды; гербициды, а также по месту их применения (в открытом или в защищенном грунте). В зависимости от специфичности действия химических средств различают профилактические, стимулирующие продуктивность сельскохозяйственных культур и истребительные средства защиты растений(Шпаар, и др. 2004).
Необходимым условием интегрированной защита растений является постоянное совершенствование касающееся как самих средств, так и технологий их применения. По механизму действия и распределению на поверхности или внутри обработанного растения различают инсектициды контактного исистемного действия. Первые попадают на поверхность членистоногих и они должны по возможности равномерно распределены по поверхности растений, чтобы вредители могли с ними контактировать. В зависимости от этого различают инсектоакарициды с контактным, кишечным действием. Неспецифическое инсектицидное и акарицидное действие минеральных и растительных масел используется в борьбе против сосущих вредителей. Их применяют главным образом в овощеводстве и плодоводстве. Покрытие масляной пленкой яиц вредных членистоногих и их подвижных стадий прекращает доступ к ним влаги и кислорода, что приводит их к гибели (Шпаар, и др. 2004).
Важной составной частью интегрированной системы защиты растений является борьба с проявлением резистентности вредных членистоногих к применяемым химическим средствам. Это вызывает необходимость проведения специальных химических, агротехнических, биологических и биотехнологических мероприятий для предотвращения её возникновения (Рославцева, 2003).
В современном понимании интегрированная защита растений - это регуляция популяций вредных организмов на основе знания конкретной фитосанитарной обстановки (мониторинга) и прогноза вредоносности, использующая факторы устойчивости растения и природные регулирующие факторы, при необходимости проводимая активными средствами и методами защиты растений с учетом экономических порогов вредоносности и одновременно удовлетворяющая экологическим и экономическим требованиям.
Под интегрированной защитой понимают комбинацию биологических, агротехнических, химических, физических и других методов против комплекса болезней в конкретной эколого-географической зоне на определенной культуре. Ее назначение - регулирование численности вредных видов до хозяйственно неощутимых размеров при сохранении деятельности природных полезных организмов. Интегрированная защита основана на следующих взаимосвязанных элементах:высокий уровень агротехники, обеспечивающий полноценное развитие растений, обладающих устойчивостью к возбудителям болезней, а также профилактика или подавление отдельных видов вредных организмов; выращивание сортов, устойчивых к болезням; использование эффективных приемов подавления численности вредных организмов (биологических, химических, физических и др.) на основе прогноза развития болезни. Активные средства защиты рекомендуется применять с учетом экономического порога вредоносности, т.е. такой плотности популяции вредного вида, при которой их применение экономически оправдано. Пороги вредоносности зависят от эколого-географических особенностей зоны и культуры. Интегрированная защита в большей мере, чем отдельные защитные мероприятия, способствует достижению высоких экономических показателей при наиболее полном соблюдении экологических требований и минимальном отрицательном воздействии на окружающую среду(Баздырев,и др., 2014).
Токсикологическая характеристика линий клещей, отселектированных по критериям наличия или отсутствия признака резистентности к акарициду
Популяционный генофонд паутинных клещей представляет собой огромный набор комбинационного генетического разнообразия, способного обеспечить проявление резистентности к воздействию любых, используемых в сельскохозяйственной практике пестицидов.
Дизруптивный отбор самок паутинного клеща по крайним значениям признака – устойчивости или чувствительности к акарициду определённой химической группы, позволяет получить относительно идентичные генотипы по проявлению признака резистентности к используемому токсиканту. При дизруптивном отборе из отдельной семьи, показавшей наименьший процент смертности (до 10%) при обработке самок диагностической концентрацией акарицида, на отдельные листовые плотики отсаживались самки. Полученные от них семьи дочерних поколений вновь тестировались с последующей дифференциацией семей по такому же принципу.Линии не проявляющих признака резистентности к акарициду клещей получали сибселекцией от сестёр самок из семей со 100% смертностью части взятых из семьи для тестирования особей после их обработки диагностической концентрацией токсиканта. Вариации процента смертности самок в семьях дочерних поколений при дизруптивномм отборе клещей на проявление признака резистентности к малатиону, фенпироксимайту и аверсектину представлены в таблицах 2, 3 и4.
Селекция обыкновенного паутинного клеща на устойчивость или чувствительность к малатиону, фенпироксимату и аверсектинувыявил сходный характер изменчивости в выражении признака устойчивости в селектируемых поколениях. Семьи самок, которые показывали высокий уровень устойчивости к акарицидам, производили новые семьи с различным числом особей, выживших после воздействия диагностической концентрацией каждого из этих акарицидов.
В семьях, полученных от резистентной родительской самки, присутствовали чувствительные к селектирующемутоксиканту особи. Около 30% дочерних самок не проявляли признака резистентности к токсиканту. А в дочерних семьях, полученных от самок из семей 100%-но чувствительных к акарициду, были самки, выживающие при действии диагностической концентрации токсиканта. В поколении, полученном от самки из семьи, не проявляющей признака резистентности к селектирующим акарицидам, могло выживать до 15% дочерних самок при действии диагностической концентрации токсиканта.
При отсутствии различий в действующих внешних факторах фенотипические модификации количественного выражения признака резистентности у самок из инбредно развивающихся семей, могли быть только следствием генотипических вариаций аллелей резистентности в потомстве дочерних самок. Гетерозиготные по признаку резистентности самки производят самцов с аллелями резистентности к действующему акарициду и без них, а самки у паутинного клеща могут копулировать с несколькими самцами (Oku, 2010; Oku, Beukenvan, 2017). Материнские самки, от которых получали анализируемое по фенотипическому проявлению признака резистентности дочернее потомство новых семей, могли иметь в семяприемнике сперматозоиды с аллелями от резистентных и от чувствительных самцов. Получаемые дизруптивным отбором линии клещей без гена резистентности к токсиканту, гипотетически, могли оказывать влияние на проявление его токсического действия другие гены, набор которых у разных особей вариабелен. Однако основной причиной проявление признака резистентности при селекции клещей чувствительной к токсиканту линии могли находиться у материнской самки в семяприемнике сперматозоиды от резистентного к токсиканту самца.
Сопоставление полученных генотипов при селекции малатионом, фенпироксимайтом и аверсектином по наличию у самок клеща карбоксилэстеразного изозима Е3
Проявление резистестентности членистоногих к фосфорорганическим инсектоакарицидам, по современным представлениям, связывают с увеличением активности эстераз в их организме. Один из изозимов комплекса этих ферментов, относящийся по систематической принадлежности к карбоксилэстеразе (гидролазе эфиров карбоновых кислот КФ 3.1.1.1.), участвует в регулировании работы транспортных систем плазматической мембраны клеток. Эти системы обеспечивают экстракцию в цитоплазму клетки из наружной среды субстратов энергетического и пластического обмена – электролитов, сахаров, аминокислот, липидов, биологически активных веществ и выведение из цитоплазмы ненужных веществ. Система транспорта плазматической мембраны регулирует также в узких пределах колебаний ионный состав цитоплазмы и внутриклеточное значение рН, необходимое для функционирования клеточных ферментов (Ahmad, 1976; Oakeshott,et. al, 2005). У резистентных к фосфорорганическим инсектоакарицидам членистоногих происходит увеличение количества этой множественной молекулярной формы карбоксилэстеразы вследствие умножение локусов ДНК, осуществляющих её синтез (Bass, Field, 2011; Devonshire, Field, 1991).
При электрофоретическом разделении и выявлении в полиакриламидных гелях эстеразных фракций в качестве одного из гидролизуемых ими субстратов использовался в инкубационной среде – 1-нафтилацетат (Maurer, 1968; ula,Weyda, 1983). В гомогенатах единичных самок резистентных к малатиону клещей в проводившихся экспериментах стабильно выявлялась более высокая, по сравнению с самками из чувствительной к этому токсиканту семей, активность фракции карбоксилэстеразного изозима Е3, (Рисунок 7 а, б).
При использовании другого эстеразного субстрата – s-бутирилтиохолин иодида (Karnovsky, Roots, 1964) в гомогенате из 20 самок одной семьи резистентной к малатиону линии клещей также выявлялась высокоактивная карбоксилэстеразная фракция Е3 и слабо активная ацетилхолиэстеразная фракция (Рисунок 7 в).
В гомогенате самок чувствительной к малатиону линии клещей при использовании этого субстрата активность фракции Е3 или не выявлялась, или была значительно более низкой, чем у самок клещей резистентной линии (Рисунок 7 г).
Для ацетилхолинэстеразной фракции более предпочтительными субстратами, чем s-бутирилтихолин иодид, являлись ацетилтиохолин иодид или пропионилтиохолин иодид (Сундуков, 2012), но эти субстраты карбоксилэстеразный изозим Е3 не гидролизовал (Рисунок7 д,е).
У самок резистентных к фенпироксимайту клещей, в сравнении с самками чувствительной к этому токсиканту линии, изозим Е3 не отличался по активности при выявлении его и нафтилацетатным, и тиохолиновым, c использованием s-бутирилтихолин иодида, методами (Рисунок 8 a,б,в,г).
При выявлении эстеразных фракций у самок клещей резистентностой и чувствительной к аверсектину линий также не обнаружено достоверных различий ни в активности карбоксилэстеразного изозима Е3, ни в активности каких-либо других эстразных фракций (Рисунок 9 a,б,в,г).
Известно, что у резистентностых к авермектнам клещей может выявляться несколько более высокая активность ферментов, участвующих в различных процессах метаболического обмена – монооксигеназ, глутатион-S-трансфераз и карбоксилэстераз (Stumpf, Nauen, 2002). Биохимический механизм проявляющейся у членистоногих устойчивости к отравляющему действию инсектоакарицидов связывают с увеличением активности многих ферментных систем. Это, как полагают, обеспечивает нормализацию биохимических процессов энергетического баланса и гомеостаза состава жидкостей внутренней среды, нарушаемых токсикантом. Однако эти различия могут быть выявлены лишь более чувствительными, чем электрофоретический, колориметрическими методами.
Токсикологическое сопоставление проявления признака резистентности к действующему акарициду у гомозиготных и дигетерозиготных по аллелям резистентности генотипов
Скрещиванием самцов с дейтонимфами из семей с наименьшим процентом смертности при обработках диагностическими концентрациями селектирующих акарицидов было получено поколение дигетерозиготных клещей с совмещёнными в геноме аллелями резистентности к малатиону и к фенпироксимайту а также к аверсектину и к фенпироксимайту. Половину самок из каждой семьи гибридов первого поколения тестировали диагностической концентрацией одного из акарицидов, гены резистентности к которому присутствовали в геноме, а вторую половину – другим токсикантом.
По сравнению с гомозиготными по генам резистентности родительскими самками (табл. 13) процент смертности гибридных клещей двукратно увеличивался при действии малатиона и более чем в два раза при действии фенпироксимайта (табл. 14). Процент смертности гибридных самок при действии фенпироксимайта был почти таким же, как и у клещей чувствительной к фенпироксимайту линии (табл. 13,14).
При обработке дигетерозиготных гибридов с генами резистентности к малатиону и к фенпироксимайту диагностической концентрацией малатиона основная масса выживающих самок располагалась в зоне доминантного наследования признака (Рисунок 10, 11), а при обработке диагностической концентрацией фенпироксимайта – в зоне рецессивного наследования признака. Гены резистентности проявляли свою детерминацию как в поколении F1 при гибридологическом анализе (Рисунок 4, 5).
Совсем иной характер эпистатического взаимодействия проявился между генами резистентности к фенпироксимайту и аверсектину, совмещёнными в геноме паутинных клещей. Средней уровень смертности дигетерозиготных гибридных самок при действии диагностических концентраций этих акарицидов был таким же, как и смертность чувствительных к ним самок S-линий (Табл. 15, 16).
Распределение выживающих дигетерозиготных самок при действии диагностических концентраций фенпироксимайта и аверсектина (рис. 12, 13) было таким же, как у гетерозиготных самок поколения Fi гибридологического анализа (Рисунок 5, 6), свидетельствуя о детерминации у них генов резистентности к действующим акарицидам.
При реципрокном скрещивании клещей (5х о или ох$) статистически достоверных различий в процентах смертности гибридных самок не выявляется (табл. 14 и 16),что свидетельствует об удовлетворительном методическом уровне проводившихся скрещиваний. У размножающихся по типу арренотокии тетраеиховых клещей самцы не имеют Y-хромосомы. Поэтому гибриды при реципрокном скрещивании имеют одинаковый состав аллелей.
Эпистатическое взаимодействие объединённых в геноме клещей аллелей резистентности к акарицидам различных химических классов происходит на этапе регуляции ими биохимических процессов, противодействующих развитию патогенеза отравления (Сундуков, и др. 2017).
Ген резистентности к фенпироксимайту активирует процессы электронного транспорта и окислительного фосфорилирования происходящие на мембране митохондрий (Lmmen, 2007). Осуществление этих процессов зависит от вариаций электролитного и органического состава цитоплазмы, регулируемого плазматической мембраной самой клетки с участием карбоксилэстеразного изозима Е3. Вследствие этого аллели резистентности к малатиону доминируют при совмещении их в геноме клещей с аллелями резистентности к фенпироксимайту.Биохимические процессы нормализации функций рецепторов и ионных каналов, детерминируемые генами резистентности к аверсектину, также зависят от нормальной работы плазматической мембраны клетки, поскольку являются её структурным компонентом. Однако они не зависят от биохимических процессов, происходящих на мембране митохондрий, кодируемых генами резистентности к фенпироксимайту.