Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Современное состояние метода клонального микроразмножения растений
1.1.1. Направления развития техники in vitro и метод, наиболее пригодный для массового производства посадочного материала 6
1.1.2. Пролиферация побегов in vitro, укоренение микрочеренков и возможность депонирования материала на этих этапах 9
1.1.3. Адаптация растений к нестерильным условиям и проблемы, связанные с ростом и развитием растений после культуры тканей 14
1.2. Покой как биологическое явление и его роль в годичном цикле развития растений
1.2.1. Фазы покоя и их связь с зимостойкостью растений 16
1.2.2. Теоретическое обоснование явлений начала и окончания периода покоя 20
1.2.3. Температурный и световой режим как факторы, обуславливающие период и состояние покоя 26
1.2.4. Диагностика покоя, методы его искусственного преодоления и способы управления этим процессом 33
Глава 2. Цель, задачи, методика и условия проведения экспериментов
2.1. Цель изадачи исследований 38
2.2. Характеристика места и объектов исследований 38
2.3. Методика проведения экспериментов 43
2.4. Элементы учётов и методы статистической обработки результатов исследований 51
Глава 3. Результаты исследований
3.1. Введение в культуру и пролиферация побегов 52
3.2. Укоренение микрочеренков и адаптация микрорастений 56
3.3. Рост и развитие растений в процессе доращивания 68
Глава 4. Экономические аспекты применения метода клонального микроразмножения 94
Глава 5. Обсуждение результатов исследований 96
Выводы 105
Глава 6. Рекомендации производству 107
Список использованной литературы 108
Приложение 127
- Пролиферация побегов in vitro, укоренение микрочеренков и возможность депонирования материала на этих этапах
- Адаптация растений к нестерильным условиям и проблемы, связанные с ростом и развитием растений после культуры тканей
- Элементы учётов и методы статистической обработки результатов исследований
- Экономические аспекты применения метода клонального микроразмножения
Введение к работе
В настоящее время основным способом размножения садовых культур является прививка, однако корнесобственная культура (в основном зелёное черенкование легкоукореняемых сортов и форм) также имеет широкое распространение. Эти методы наиболее отработанны и гарантируют относительно стабильный выход посадочного материала.
Одной актуальной задачей на сегодняшний день является разработка новых технологий, позволяющих в необходимом количестве получать оздоровленный посадочный материал, особенно древесных плодовых культур. Перспективным методом, реально позволяющим решить эту проблему, является культура in vitro.
В ряде стран (Великобритания, Германия, США, Италия) уже невозможно представить систему питомниководства без широкого использования методов культуры тканей. Уже в 1980 году в США около 3 тыс. питомников использовали этот метод для производства рассады и саженцев многих культур, в том числе вишни, сливы, абрикоса и других культур. К настоящему времени число видов, которые можно клонировать in vitro, составляет уже более тысячи (В.А. Высоцкий, 1995). Так, ежегодный выпуск только подвоев с использованием этого метода в мире достигает до 57 млн. шт. в год.
Метод клонального микроразмножения взят на вооружение в ряде известных зарубежных фирм, таких как «Мелоу Лейк» в США, «Агромиллора Каталана» в Испании. В России к настоящему времени метод культуры in vitro применяется в основном при размножении редких и уникальных форм и сортов растений, в селекции и т.д. Причины такого редкого применения в производстве довольно перспективного метода: высокие требования относительно начальных капиталовложений, а также слабая отработка или отсутствие технологий получения посадочного материала многих растений.
Если на начальных этапах практически не возникает сложностей в применении технологии in vitro, то, начиная с получения микрорастений, проблемы имеют место.
Недостаточно чётко решён вопрос перевода пробирочных растений в нестерильные условия. Ещё большей проблемой представляется слабый и недружный рост адаптированных микрорастений после высадки. Известно, что для нормального развития растениям умеренного пояса требуется воздействие на них низких температур осенне-зимнего периода.
В связи с этим целью наших исследований было изучение возможности регулирования роста растений путём подбора оптимальных температурно-временных составляющих режима подготовки адаптированных микрорастений к пересадке, а также определение наиболее эффективных сочетаний элементов фотопериода для роста растений перед подготовкой при низких положительных температурах.
Научная новизна исследований заключается в том, что в качестве объектов исследований взяты адаптированные микрорастения, материал генетически однородный, не изучавшийся ранее в связи с периодом покоя. Было установлено, что развитие растений, получивших охлаждение при температуре +3-6С в искусственных условиях, происходит аналогично с растениями, проходившими период покоя в естественных условиях. Установлено, что растения с закрытой корневой системой и извлечённые из контейнеров перед предпосадочной подготовкой при температуре +3-6С, после высадки растут одинаково. Активизация роста подготовленных таким образом растений наступает на 3-5 день после пересадки в закрытый или открытый грунт. На основании исследований была разработана усовершенствованная технология доращивания адаптированных микрорастений, включающая подготовку к пересадке в искусственных условиях в качестве обязательного элемента, что позволяет на 1-2 года сократить доращивание материала.
Пролиферация побегов in vitro, укоренение микрочеренков и возможность депонирования материала на этих этапах
При изучении органогенеза в культурах тканей и регенерации на отрезках корней и изолированных листьях было установлено, что направление этих процессов зависит от соотношения между ауксинами и цитокининами. Преобладание цитокининов приводит к закладке почек, тогда как преобладание ауксинов способствует образованию корней. При промежуточном их соотношении происходит размножение недифференцированных клеток.
Одно из основных преимуществ клонального микроразмножения над традиционным — высокий коэффициент размножения (число мериклонов или растений от одного экспланта). Проявление морфогенных потенций растений и их характер зависит от ряда факторов: происхождения материала; генотипической принадлежности растения-донора и его физиологического состояния (Silveira Conceicao Eneida, Cottignies Alian, 1994); светового режима выращивания культур и гормонального состава питательных сред (Г.П. Бутова, Л.Л. Скробова, 1988; К.А. Хмара, Н.В. Катаева, 1993); уровня стабильности процесса размножения при субкультивировании образовавшихся микрорастений; соблюдения асептичеких условий выращивания с особым вниманием к хронической инфекции, вызываемой медленно растущими патогенами (Pseudomonas, Erwinia, Bacillus).
Наиболее часто на этапах введения экспланта в культуру и пролиферации побегов, в течение которой происходит стимуляции развития всех пазушных почек в результате подавления апикального доминирования, используют среду по прописи Мурасиге и Скуга. Изменяя состав и сочетание стимуляторов роста в зависимости от объекта, можно контролировать этот процесс. Основную роль на этапе введения и пролиферации играют цитокинины. Наиболее часто используют 6-бензиламинопурин (6-БАП), зеатин, кинетин в различных концентрациях. Почти каждый новый объект требует корректировки количеств этих веществ. Некоторые эффекты гетероциклических соединений, таких как ИУК, ИМК и цитокинины, связаны с образованием свободных радикалов. Цитокинины играют важную роль в предотвращении старения клеток (О.Н. Кунаева, 1973; С.А. Острейко, 2002). Они действуют или посредством прямого связывания свободных радикалов, или предотвращают их образование (В. Gunse, E.F. Elstner, 1992). Отмечено, что натуральные цитокинины (зеатин, зеатинрибозид, дигидрозеатин, дигидрозеатинрибозид) более эффективны в задержке старения, чем синтетические (6-БАП и кинетин) (S. Singh, D.S. Letham, 1994).
Одной из основных проблем на этапах введения экспланта в культуру и последующей пролиферации побегов является возможность ингибирования ростовых процессов экспланта токсическими веществами, выделяемыми им в среду. В результате травмы, полученной эксплантом при изолировании, активируются ферменты, окисляющие фенолы растений, различные фенолазы. Продукты окисления фенолов обычно ингибируют деление и рост клеток экспланта. Улучшить ситуацию можно добавлением антиоксидантов (аскорбиновая кислота, глютатион, дитиотриэтол, поливинилпирролидон) в питательную среду. Рекомендуется также первые 4-5 дней после эксплантирования держать культуры в темноте и только затем переносить их на свет.
С неблагоприятным газовым составом (накопление СОг и этилена) связывают такое нежелательное явление, как витрификация пробирочных растений. При этом из-за сильного оводнения и изменения структуры листья и побеги кажутся прозрачными, меняют форму. Такие растения подлежат выбраковке. Причинами этого могут быть также длительное культивирование эксплантов, высокая температура воздуха в помещении. Предотвратить витрификацию можно путём подбора оптимального состава сред, своевременного пассирования материала и оптимизации условий культивирования.
По гипотезе Kevers et al. (1984) витрификация - это ответ на стресс, за который отвечают NH+, цитокинины и этилен, присутствующие в избытке. Витрификацию, по мнению этого автора, можно преодолеть улучшением газообмена в сосудах и применением циркулирующих жидких питательных сред, в которых контролируются уровень NH/ и цитокининов.
Важной задачей является получение высококачественного растительного материала, пригодного для дальнейшего размножения, укоренения и адаптации. Для укоренения микрочеренков древесных растений многие исследователи (Г.П. Бутова, Л.Л. Скробова, 1988; В.М. Тюленев, 1996; S.Sriskanda-rajan et al., 1990; J.J. Varga Hernandez, R.H. Gonzalez, 1991; R. Blok, 1993) рекомендуют использовать питательные среды, содержащие половинную концентрацию минеральных солей основного состава прописи, но этот вопрос спорен (CD. De Mello et al., 1994). В целях получения укоренённого материала как из одревесневших и зелёных черенков, так и из микрочеренков, для стимуляции ризогенеза применяют ауксины, в садоводстве обычно ИМК, НУК или ИУК.
Для плодовых растений обычно более 70% побегов укореняются в течение 4-6 недель после переноса на среду для ризогенеза. Более того, побеги некоторых видов после погружения в раствор с ауксином укоренялись прямо в компосте во влажных теплицах. Однако необходимо отметить, что не все виды поддаются такому способу размножения, например, Citrus spp., где все попытки получить растения из верхушек побегов потерпели неудачу (J. Button, J. Kochba, 1977).
Адаптация растений к нестерильным условиям и проблемы, связанные с ростом и развитием растений после культуры тканей
Одной из нерешённых проблем биотехнологии остаётся перевод пробирочных растений в нестерильные условия и связанные с этим проблемы (О.С. Broome, R.N. Zimmermann, 1978; P.M. Hasegawa, 1979; R.M. Skirvin, M.S. Shy, 1979). Перенос пробирочных растений в нестерильные условия представляет собой важнейший этап, способный, в случае неудачи, перечеркнуть всю предшествующую работу. Объясняется это влиянием на процесс адаптации большого количества внешних и внутренних факторов (A. Fabbri et al., 1986), среди которых выделяют следующие: 1. Пребывание в стерильных условиях, при постоянной температуре и высокой влажности ослабляют защитные свойства растений; 2. Изменение анатомо-морфологической структуры листьев. Листья становятся тонкими, имеют 1-2 слоя мелких, плохо сформированных клеток паренхимы, в то время как полевые растения имеют паренхиму из 3-4 слоев клеток (К.Е. Brainerd, L.H. Fuchigami, 1982; N. Noe, 1994). У листьев отсутствует или имеется в сниженном количестве кутикулярный воск, что приводит к чрезмерной потере воды (N.C. Lindsey, J.C. Antony, 1984; Ivana Gribaudo et. al, 2001), устьица широко открыты (H.B. Катаева, 1987; J.M. Santamaria, G. Kerstein, 1994). 3. Физиолого-биохимический, отражающий пониженную способность к фотосинтезу (W. Barz,, W. Husemann, 1982; DJ. Donnelly et al., 1984), вследствие их фотогетеротрофности при культивировании на средах, содержащих углеводы. 4.
Корневая система растений, полученных in vitro, практически нежизнеспособна и после пересадки в нестерильные условия часто отмирает. 5. Одной из причин гибели растений при пересадке является и низкая степень лигнификации, тканей, что приводит к загниванию тканей при высокой влажности субстрата. Критическим периодом при адаптации пробирочных растений являются первые 2 недели после пересадки (С.А. Корнацкий, 1996), когда необходимо поддерживать 100% влажность воздуха. Для этого растения рекомендуется помещать внутрь ограниченного пространства, укрытого полиэтиленовой плёнкой, или в индивидуальные сосуды. Некоторые авторы отмечают, что большое значение для успешного проведения пересадок в нестерильные условия имеет срок высадки. Наиболее благоприятным сезоном считается конец зимы - начало лета (Э.Э. Савздарг и др., 1983; О.А. Леонтьев-Орлов, 1986; Н.И. Туровская, 1990). Адаптацию листового аппарата пробирочных растений можно начинать непосредственно в культивационных сосудах, снимая полностью или нарушая частично герметичность покрытий, а для предотвращения развития микрофлоры нанося на поверхность среды раствор системного фунгицида (С.А. Корнацкий, 1989). Имеются данные об успешном укоренении микрорастений непосредственно на стерильной почвенной смеси (почва с песком, торф с перлитом) с предварительной обработкой их стимулятором, содержащим ауксины (ИМК, а-нафталинуксусную кислоту). При этом укоренение микрочеренков рябины разных видов через 5-8 недель составляло около 75% (М. Dujiikovi et. al., 1992; Е. Avitia Garcia, A.M. Castillo Gonzalez, 1992).
Серьёзной проблемой, возникающей при получении посадочного материала древесных культур, является слабый и недружный рост адаптированных микрорастений в открытом грунте после высадки. Это отмечалось многими авторами, но до сих пор не было предложено метода преодоления этого нежелательного явления. В условиях in vitro побеги, развившиеся из спящих почек, начинают продуцировать новые почки и побеги только после 2-го пассажа (Silva Linda Lacerda da, Teixeira Silvio Lopes, 1993). Изолированные зародыши из нестратифицированных семян формируют розеточные карликовые растения (Родионов, 1950; Николаева, 1967; Ledbretter, 1959; Remi, 1961- цит. по Ц. Хашес, 1979). Можно предположить, что причиной этого является отсутствие в их жизненном цикле охлаждения во время прохождения периода покоя. Для нормального прохождения периода покоя растениям умеренного пояса требуется воздействие на них низких температур осенне-зимнего периода (Н.И. Савельев, 1976, и др.). У неохлаждённых почек древесных растений отмечали только распускание листьев, но не было роста побегов (Челядинова, 1963 — цит. по Ц. Хашес, 1974). То же происходит с растениями, полученными путём микроразмножения и не подвергшимися воздействию холода: они образуют розетку листьев, но рост побегов у них практически отсутствует.
Элементы учётов и методы статистической обработки результатов исследований
На этапе введения использовали как апикальные, так и латеральные почки с побегов вегетирующих растений. Так как не было возможности использовать апикальные почки в достаточном количестве, в основном экспланты были получены из латеральных. При благоприятном исходе эффективность такой работы может составлять до 45-50 %, в среднем - 25-30% от начального количества введённых в культуру почек, что отмечено и в наших исследованиях.
В июле-августе 2000 года введение в культуру эксплантов вишни дало вполне удовлетворительные результаты. Их жизнеспособность через 1 месяц культивирования составила: у клонов Памяти Еникеева (ПЕ 3/8, 1/35 и 4/30), -от 5,4% до 41,7%, у сорта Ассоль - 27,8%, у сорта Волочаевка - 12,6% (табл. 1). Введение в культуру эксплантов из латеральных почек сливы оказалось малопродуктивным, поскольку большая часть их погибла сразу после введения в культуру (за исключением сортов Занятная, Утро и Фиолетовая, где выжило соответственно 26,9, 25 и 8,6%). В связи с этим, при повторении опыта в 2001 году был изменён календарный срок введения почек в культуру (его проводили на 1 мес. раньше, в июне-июле, до наступления фазы естественного летнего покоя растений), результатом чего явилась более высокая приживаемость эксплантов по сравнению с предыдущим годом (табл. 2).
У вишни сорта Память Еникеева в 2001 году приживаемость эксплантов от дерева 3/8 составила 31,6% (почти в 6 раз больше по сравнению с 2000 г.), эксплантов от деревьев 1/35 и 4/30, напротив, выжило меньше (через 1 мес. после введения - соответственно 33,3 и 25,7%). У сорта Ассоль приживаемость была близка к результату 2000 года (26,8%), у эксплантов Волочаевки - на 10,5% больше, чем при более позднем введении в культуру. Значительно более высокие результаты по сравнению с 2000 годом дало введение эксплантов сливы. Известно, что максимальные суточные приросты у сливы домашней наблюдаются в среднем в конце мая - начале июня и полностью прекращается во второй половине августа (Н.В. Агафонов, 1994; К.Ю. Мостоловица, 1977 и др.). При введении эксплантов сливы в культуру in vitro в начале июля 2001 года у сорта Ренклод Тамбовский приживаемость их через 1 мес. была 40,5% (в 2000 году при том же периоде наблюдения вариант выпал полностью), у сортов Урожайная Бабичева и Фиолетовая — соответственно 14,3 и 17,5% (в 2000 году - 2,9 и 8,6%). Худший результат по сравнению с 2000 годом показал сорт Утро (14,7%). Приживаемость сорта Занятная незначительно отличалась от наблюдавшейся в 2000 году (20,6%).
Некоторыми авторами рекомендуется вводить в культуру покоящиеся почки в зимний период, но, возможно, это эффективно только для материала, уже прошедшего стадию летней остановки роста и подвергшегося воздействию пониженных температур в осенне-зимний период. Впоследствии была отмечена массовая гибель эксплантов в результате заражения бактериальной инфекцией (как в 2000, так и в 2001 году).
Субкультивирование проводилось в течение 6 пассажей, 5 из них на среде размножения, последний (6-й) - на среде для выгонки побегов с концентрацией 6-БАП 0,2 мг/л с целью получения максимального количества побегов, пригодных для дальнейшего размножения и укоренения. После введения начальных эксплантов стерильные культуры использовали для последующих опытов по размножению, укоренению и адаптации микрорастений к нестерильным условиям. Полученные в результате этого микрорастения были задействованы в сериях основных опытов по теме диссертации.
В 2000 году наибольший коэфициент размножения наблюдался у вишни сорта Память Еникеева клонов 3/8 А и 3/8 Б, 1/35 А и 1/35 Б (табл. 3) и смеси клонов, введённых в культуру в 1999, 1998 и 1997 тт. (особенно в варианте ПЕ 97). Стерильные культуры других лет введения in vitro не имели заметных различий по коэффициенту размножения (табл. 4).
В целом среди использованных сортов максимальный коэффициент размножения имел сорт Ассоль (3,1), наименьший - Волочаевка (2,5). Менее различались между собой по этому показателю сорта Память Еникеева разных лет введения и Молодёжная. У сливы сорта Ренклод Тамбовский средний коэффициент размножения был более чем в 2 раза больше, чем у Яичной синей, что было связано с большей степенью витрификации эксплантов сорта Яичная синяя в летние месяцы. В 2001 году учёт коэффициента размножения изучаемых растений специально не проводился, но визуально отличий от результатов, полученных в 2000 году, не было заметно.
Экономические аспекты применения метода клонального микроразмножения
Культура тканей, по мнению многих исследователей, является эффективным и экономически выгодным способом размножения посадочного материала. По сравнению с традиционными методами вегетативного размножения растений микроклональное размножение растений требует больших капиталовложений и, соответственно, больших текущих расходов. Персонал должен обладать соответствующим уровнем знаний и владеть стандартными приёмами микробиологии. Однако здесь исключается тяжёлый физический труд по уходу за растениями и условия работы приближены к условиям работы на производствах высоких технологий. Среди основных преимуществ использования биотехнологических приёмов в садоводстве наиболее часто называют следующие: 1. возможность получения посадочного материала, свободного от вирусов, микоплазм, бактериальных и грибных болезней, клещей и нематод (Fihlo Figueira E.S. et al., 1995); 2. быстрое размножение ценных клонов растений; получение в большом количестве вегетативного потомства трудноразмножаемых в обычных условиях форм растений; работа в лабораторных условиях круглый год и планирование выпуска растений к определённому сроку; 3. возможность длительного хранения растительного материала без контакта с внешней средой; 4. возможность обмена материалом в международном масштабе без риска занести карантинных вредителей; 5. возможность получения форм с изменённой плоидностью, сомаклональных вариантов и трансгенных растений. Если работы по клональному микроразмножению хорошо организованы, чётко отработаны все звенья производственного процесса, в котором заняты высококвалифицированные специалисты, можно ожидать высокий уровень рентабельности производства. Расчёт экономической эффективности производства посадочного материала с использованием микроклонального размножения — по традиционной схеме и включающей применение предпосадочной подготовки адаптированных микрорастений к пересадке - показан на примере вишни сорта
Память Еникеева (табл. 30). Разработанный нами способ, предусматривающий охлаждение микрорастений при +3-6С в течение 2-2,5 мес. повышает в 3 раза выход стандартного и однородного по высоте посадочного материала за 1 год, а также позволяет более эффективно использовать производственные площади. Хранение растений значительно снижает затраты труда, практически исключает расходы электроэнергии. Применение фунгицидов незначительно сказывается на себестоимости полученных растений, т.к. расход препаратов невелик. Так как целью данных исследований являлось изучение способов регулирования роста растений косточковых культур, полученных in vitro, на примере вишни и сливы, путём подбора оптимальных сроков и условий прохождения предпосадочной подготовки и последующего доращивания, обеспечивающих максимальный выход посадочного материала, соответствующего стандартам, в итоге можно сказать следующее. Растения, полученные in vitro, для дальнейшего активного роста нуждаются в наличии в их жизненном цикле периода покоя продолжительностью не менее 2-2,5 мес, во время которого им необходимо воздействие пониженных температур. Требуемые условия можно создать в искусственных условиях при +3-6С. Растения, находящиеся во время покоя при температуре более 7-10С, обычно прекращают рост, сбрасывают листья (рис. 24), а ростовые процессы при этом не возобновляют в течение 3-7 мес.
Предпринимались попытки (G.L. Steffens, G.W. Stutte, 1986) получить эффект, адекватный проходящему в течение периода покоя в естественных условиях, для чего использовали химические вещества (тиадиазурон). Но многие химические реагенты, используемые для этих целей, являются токсичными веществами, опасными для человека. К тому же имеется сравнительно мало данных о последействии на растения таких обработок. Применение пониженных температур, имитирующих естественные погодные условия зимнего периода, во время прохождения периода покоя микроразмноженным растительным материалом, является, возможно, самым простым технически и самым экологически чистым способом подготовки их к дальнейшему доращиванию.
