Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Муковисцидоз - причина возникновения, схема патогенеза 10
1.2. Особенности воспаления при MB 16
1.2. 1. Нейтрофилы 16
1.2. 2. Эластаза нейтрофилов 18
1.2.3. а 1-антитрипсин или осі-ингибитор протеиназ 19
1.3. Дисбаланс в системе протеазы-антипротеазы у больных муковисцидозом 20
1.4. Нейтрофилы и антимикробная защита у больных муковисцидозом
1.4.1. Лактоферрин (LF) 23
1.4.2. Миелопероксидаза (МРО) 24
1.5. Цитокины 28
1.5.1. Провоспалительные цитокины 29
1.5.2. Противовоспалительные цитокины 33
1.6. Цитокины у больных муковисцидозом 35
Глава 2. Материалы и методы 38
2.1. Характеристика обследованных больных 38
2.2. Материал исследования 41
2.3. Методы исследования 41
2.4. Статистический анализ 48
Глава 3. Результаты исследования 50
Глава 4. Обсуждение результатов 83
Выводы ПО
Практические рекомендации 112
Список использованной литературы 1
Эластаза нейтрофилов
Нейтрофилы рассматриваются как основные эффекторные клетки при воспалительном процессе и им принадлежит критическая роль в развитии повреждения тканей. В отсутствии воспалительного процесса нейтрофилы в основном находятся в кровеносном русле. Однако в ответ на воспалительный стимул происходит быстрое перераспределение нейтрофилов в поврежденные ткани. Воспаление при MB характеризуется значительным притоком нейтрофилов в легкие (Connett G., 2000; Hoiby N., 2001), и по мере прогрессирования заболевания доля нейтрофилов в бронхоальвеолярном пространстве нарастает. Исследования бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) больных MB показало, что доминирующим типом клеток являются нейтрофилы, доля которых составляет более 50% от общего числа клеток ЖБАЛ и превышает число нейтрофилов у здоровых людей в 15-20 раз. Воспаление в дыхательных путях у больных MB начинается очень рано, даже без наличия клинических симптомов (Connett G., 2000). По данным некоторых авторов (Konstan М. and Berger М.,1997; Hoiby N., 2001) у больных MB без симптоматического заболевания легких имеется эндобронхиальная бактериальная инфекция, ассоциированная с воспалением, сопровождающимся притоком большого количества нейтрофилов в очаг воспаления (Пухальский А.Л., Шмарина Г.В., Капранов Н.И., 2002). Нарушение функции трансмембранного регуляторного белка (CFTR) приводит к: 1) изменению структуры гликопротеинов мукоцилиарного клиренса, 2) нарушению функций рЧдефенсинов-1, 3) усилению адгезии Pseudomonas aeruginosa к эпителиальным клеткам (Pier G.B.,Grout М., Zaidi T.S., 1997; Hoiby N., 2001). Все эти факты обеспечивают благоприятные условия для колонизации грам-отрицательных бактерий, и прежде всего Pseudomonas aeruginosa (Капранов Н., Рачинский С, 1995; Konstan М, and Berger М., 1997; Hoiby N., 2001; Scheid P., Kempster L., et al., 2001). Исследование ЖБАЛ больных MB показало, что независимо от наличия Ps. aeruginosa, Haemophilus influenzae и Klebsiella pneumoniae было обнаружено стойкое присутствие большого количества нейтрофилов (Konstan М. and Berger М., 1997; Hoiby N., 2001). В литературе остается открытым вопрос: является ли воспаление результатом бактериальной инфекции или наоборот, воспаление способствует бактериальной колонизации? По данным ряда авторов (Adams D., Lloyd А., 1997; Konstan М. and Berger М., 1997; 1999) антибактериальная терапия не оказывала влияние на содержание нейтрофилов в очаге воспаления, но воспалительный процесс при MB характеризовался нарушением равновесия про - и противовоспалительных цитокинов, прежде всего IL-8 (Muhlebach M.S., Stewart P.W., et al., 1999) и IL-10 (Bonfield T.L., Konstan M.W., et al., 1995), усилением синтеза хемоаттрактантов нейтрофилов и количеством адгезионных молекул. Эти данные свидетельствуют в пользу возникновения воспаления до бактериальной инфекции. С другой стороны Hoiby и Scheid (Hoiby N., 2001; Scheid P.,Kempster L., et al., 2001) утверждают, что микробное инфицирование является триггером воспаления.
Таким образом, воспаление при MB начинается на очень ранних этапах течения заболевания, сопровождается массивным притоком и активацией нейтрофилов в очаге пораоїсения, а также инфекцией дыхательных путей, чаще всего вызванной Ps. aeruginosa.
Активация нейтрофилов приводит к высвобождению целого ряда биологически активных белков, в том числе эластазы. 1.2.2. Эластаза иейтрофилов (NE) является 29 kDa сериновой протеазой и накапливается в первичных азурофильных гранулах. Концентрация ее в полиморфноядерных клетках довольно высока, у человека это значение составляет более 10"5М (McElvaney N. G., Crystal R. G., 1997), таким образом, ее количества в непосредственной близости от нейтрофилов также должны быть высоки (Skold, С. М., Liu X.D., Umino Т., et al., 1999). Как следует из названия этого фермента, NE разрушает эластин и коллаген типов I, II, III, IV, гликопротеины (фибронектин и протеогликаны). NE также обладает выраженным воздействием на большинство компонентов клеточного окружения. Этот фермент способен разрушать многие белки межклеточного матрикса, а также иммуноглобулины, факторы свертывания крови и компоненты системы комплемента (Skold,C.M., Liu X.D., Umino Т., et al., 1999). Нейтрофильная эластаза, выделяемая активированными нейтрофилами в межклеточное пространство, способна повреждать практически все соединительнотканные структуры легочной ткани (Bieth J., 1986), приводя, в конечном счете, к формированию эмфиземы легкого (Janoff A., 1985;StockleyR., 1999).
Известно, что период рециркуляции нейтрофилов составляет 1 — 2 дня (Ярилин А.А., 1999), нейтрофилы активно рекрутируются в ткани при множестве патологических процессов, поэтому высокие уровни активности NE регистрируются при хроническом воспалении, как в тканях, так и в сыворотке крови (Nakamura Н., et al, 1992; Sibille Y., Marchandise F.-X., 1993; Ginzberg H.H., et al, 2001).
Миелопероксидаза (МРО)
Больные муковисцидозом подлежали госпитализации в период обострения заболевания и для динамического наблюдения - в период относительной клинической ремиссии - минимальной активности воспаления. Период обострения муковисцидоза характеризовался максимальной выраженностью клинических проявлений: усилением кашля, увеличением и изменением характера мокроты, затруднением дыхания, повышением температуры тела, сопровождающихся повышением острофазовых показателей крови, ухудшением функции внешнего дыхания и усилением воспалительных изменений бронхиальной слизистой. Периодом минимальной активности воспалительного процесса считали период наименьшего проявления респираторных симптомов, когда преобладающая часть наблюдаемых больных не предъявляли жалоб и вели активный образ жизни. В зависимости от конкретного варианта заболевания, каждый больной был обследован 2-5 раз в год. Забор материала для исследований осуществлялся в первые дни госпитализации и при выписке из стационара.
Материалом для исследования служили сыворотка и плазма периферической крови, мокрота и жидкость, полученная в результате бронхоальвеолярного лаважа в процессе бронхоскопического исследования. Во всех группах обследованных больных исследование проводилось под местной анестезией 2% раствора лидокаина. При проведении фибробронхоскопии не отмечалось каких-либо осложнений в исследуемых группах. В нашем исследовании были взяты II и III порции жидкости брохоальвеолярного лаважа, поскольку I порция ввиду присутствия большого количества слизи, бронхиального эпителия и клеточного детрита, в основном, использовалась для бактериологического исследования.
Мокроту собирали в стерильные флаконы, измеряли ее объем и разводили 0,9% физиологическим раствором в соотношении 1:3, гомогенизировали, затем центрифугировали 30 минут при 20 000 g и t +4С. Образцы супернатантов хранили при -20С.
Жидкость, полученную в результате бронхоальвеолярного лаважа в процессе фибробронхоскопии, центрифугировали 10 минут при 1500 об/мин (400g) при 4С. Надосадочную жидкость (далее в тексте обозначается как ЖБАЛ) разливали на аликвоты и хранили при -20С для дальнейшего исследования. 2.3. Методы исследования
Концентрацию белка в мокроте и ЖБАЛ определяли по методу Лоури в модификации Shakir F.K. с соавторами (1994). Все полученные результаты исследований образцов мокроты и ЖБАЛ выражали в пересчете на 1 мг белка. Уровень иммуноглобулинов A, G, М, Е определяли в сыворотке периферической крови, мокроте и ЖБАЛ непрямым методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем фирмы «Полигност» (Санкт-Петербург). Показатели оптической плотности образцов измеряли на фотометре «ELM - 3000» фирмы «DRG» (США) при длине волны 492 нм. Чувствительность метода - 15-25 пкг/мл и выражали в [г/л] и [МЕ/мл].
Уровень провоспалителъных цитокинов интерлейкина — 1(5, интерлейкина - 8, тумор-некротизирующего фактора — a (TNF-a) и интерферона - у определяли в сыворотке периферической крови, мокроте и ЖБАЛ с помощью «сэндвич» - метода твердофазного иммуноферментного анализа (Котов А.Ю., 1993) с использованием коммерческих тест-систем ТОО «Цитокин» (Санкт-Петербург). Показатели оптической плотности образцов измеряли на фотометре «ELM - 3000» фирмы «DRG» (США) при длине волны 492 нм. Чувствительность метода- 15-20 пкг/мл и выражали в [пкг/мл].
Уровень 1L-4 определяли в сыворотке периферической крови, мокроте и ЖБАЛ «сэндвич» - методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческой тест-системы фирмы "Протеиновый контур" (Санкт-Петербург). Показатели оптической плотности образцов измеряли на фотометре «ELM - 3000» фирмы «DRG» (США) при длине волны 450 нм. Чувствительность метода- 15-25 пкг/мл и выражали в [пкг/мл]. Определение миелопероксидазы и лактоферрина Уровень миелопероксидазы (МРО) и лактоферрина (LF) определяли в сыворотке периферической крови, мокроте и ЖБАЛ с помощью «сэндвич» - метода твердофазного иммуноферментного анализа с использованием кроличьих антител против миелопероксидазы и лактоферрина сыворотки человека в концентрации 4 нг/мл, которые разводили в 0,01 М Na-карбонатном буфере рН 9,5 и инкубировали 18 часов при 4С. Для определения МРО образцы сыворотки крови разводили 0,01 М фосфатном буфере рН 7,3 в 20 раз, мокроту в 5 раз. Для определения LF сыворотку крови разводили в том же буфере в 100 раз, мокроту в 20 раз. Исследуемые образцы вносили на плашку для ИФА в объеме 100 мкл. В первые 6 лунок вносили стандартные растворы МРО и LF в концентрациях от 0 до 80 нг/мл. Пробы инкубировали 18 часов при 4 С. После 3-4 кратной промывки добавляли конъюгат, меченый пероксидазой хрена и инкубировали 1,5 часа при 37С. Цветную реакцию останавливали 50мкл 1М серной кислоты. Показатели оптической плотности образцов измеряли на фотометре «ELM - 3000» фирмы «DRG» (США) при длине волны 492 нм. Чувствительность метода - 2-5 нг/мл. Уровень МРО и LF выражали в [нг/мл].
Подсчет результатов иммуноферментного анализа производился на совмещенном с фотометром компьютере Pentium 166 ММХ с помощью прикладной компьютерной программы «Wregdrg», устанавливающей зависимость оптической плотности от концентрации стандартного образца и позволяющей определять концентрацию вещества в исследуемых образцах.
Определение циркулирующих комплексов
Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови измеряли нефелометрическим способом на фотоэлектрическом колориметре КФК - 2МП (длина волны 450 нм, светофильтр 440) по методу Haskova V. с соавторами (1977) в реакции осаждения полиэтиленгликолем (ПЭГ, м.м. 6000, «Serva», Швеция). Оптическую плотность выражали в условных единицах. Определение фагоцитарной активности моноцитов и нейтрофилов
Определение фагоцитарной активности моноцитов и нейтрофилов в сыворотке крови и ЖБАЛ проводили по методу Шмелева Е.И. с соавторами (1981) оценивая их поглотительную способность по степени захватывания частиц латекса. Для этого 0,5 мл плазмы из отстоявшейся гепаринизированной крови разводили в 2 раза средой 199 и инкубировали с частицами латекса (диаметр 1,1 мкм, в расчете 100 частиц на клетку) в стерильных пенициллиновых флаконах, на дно которых были помещены покровные стекла. Время инкубации составило 2 часа при 37С. После инкубации покровные стекла фиксировали метанолом, окрашивали по Романовскому и производили подсчет клеток на микроскопе «Jenamed 2» (Германия). Поглотительную активность фагоцитов оценивали по двум показателям: фагоцитарного числа, ФЧ -процент (%) фагоцитирующих клеток и фагоцитарный индекс, ФИ -среднее число частиц латекса, поглощенных одной клеткой.
Противовоспалительные цитокины
Принятая многими исследователями концепция, в основе которой лежит разделение цитокинов на индукторы воспаления -провоспалительные, и цитокины, подавляющие воспаление -противовоспалительные, является в настоящее время фундаментом биологии цитокинов и клинической медицины. Причиной для подобного разделения послужили свойства провоспалительных цитокинов стимулировать на ранних этапах воспаления экспрессию генов, кодирующих синтез белков, повышающих продукцию PAF, лейкотриенов, простагландинов, N0, адгезионных молекул и провоспалительных цитокинов. Экспрессия других классов генов приводит к продукции иных провоспалительных факторов - хемокинов, низкомолекулярных пептидов, способствующих привлечению различных клеток, и, в первую очередь, гранулоцитов из периферической крови в очаг воспаления.
Исследование уровней IL-8, основного хемоаттрактанта нейтрофилов, показало повышение этого цитокина в периферической крови в группе детей и взрослых больных MB в оба исследуемых периода заболевания по сравнению с контрольными значениями (табл. 5). Обострение заболевания сопровождалось увеличением содержания IL-8 в сыворотке крови относительно минимальной активности воспалительного процесса.
По литературным данным (Koller D.Y., Nething I., Otto J., et al., 1997) содержание IL-8 в мокроте в контрольной группе практически равно нулевому значению. Содержание IL-8 в мокроте больных MB было повышено в сотни раз, относительно контрольных значений литературных данных. Обострение заболевания характеризовалось более высокими значениями уровня IL-8 в мокроте в группе детей и взрослых больных MB по сравнению с периодом минимальной активности воспалительного процесса (р 0,05), причем в группе детей содержание IL-8 в мокроте было выше, чем у взрослых больных MB.
Высокие значения IL-8 у больных MB также были характерны и для ЖБАЛ. Уровень IL-8 в ЖБАЛ больных MB превышал в 30 -100 раз контрольные значения. Минимальная активность воспалительного процесса сопровождалась более низкими значениями IL-8, по сравнению с периодом обострения заболевания.
Исследование уровня IL-8, основного хематтрактанта нейтрофилов, показало, что у больных MB как в мокроте и ЖБАЛ, так и в сыворотке периферической крови выявлялась значительная концентрация этого цитокина по сравнению с контролем (табл. 5, 6, 7). Причем, в оба исследуемых периода уровень IL-8 в мокроте и ЖБАЛ больных MB был выше, чем у здоровых лиц примерно в 30-100 раз. Этот показатель более чем в 100 раз превышал аналогичные значения в сыворотке крови, что свидетельствует о преобладании локального синтеза IL-8 в очаге воспаления - в легких.
Таким образом, полученные нами результаты согласуются с данными исследователей (Koller D.Y., Nething I., Otto J., et al., 1997; Konstan M.W., Berger M., 1997; Osika E., Cavaillon J-M., et al., 1999; Hoiby N., 2001) о наличии высоких концентраций IL-8 в сыворотке крови, мокроте и ЖБАЛ больных MB. Причем обострение заболевания сопровождается значительным увеличением IL-8 у больных MB. Непосредственно в очаге воспаления (мокрота и ЖБАЛ) наблюдается максимальное повышение этого цитокина.
Биологическая активность IL-8 заключается не только в роли хематтрактанта для нейтрофилов, IL-8 является также их активатором. С момента трансмиграции через эндотелиальный барьер и в процессе миграции нейтрофилов в дыхательные пути, IL-8 активирует их, стимулирует повышение внутриклеточного кальция, способствует высвобождению содержимого гранул и генерации активных форм кислорода, выполняя, таким образом, немаловажную роль в патогенезе бронхолегочных заболеваний, ассоциированных с нейтрофильным типом воспаления (Dallergi F., Ottonello L., 1997). IL-8 является хематтрактантом для многих типов мигрирующих клеток, включая Т-лимфоциты, NK-клетки, базофилы, эозинофилы. Кроме того, IL-8 усиливает фагоцитарную активность нейтрофилов, индуцируя продукцию IL-8, а также PAF и LTB4 (Stockley R.A., 2002).
Сильными стимуляторами синтеза и продукции IL-8 различными клетками являются провоспалительные цитокины TNF-ot и IL-lp, которые обладают широким спектром биологической активности и являются ключевыми цитокинамн в развитии ранней фазы воспалительного ответа. Однако, сверхпродукция этих цитокинов, как и недостаточность или несостоятельность противовоспалительных факторов, может привести к развитию системной воспалительной реакции и иметь патологические последствия, при которых провоспалительные цитокины будут играть уже патогенетическую роль (Dinabrello С.А., 2000).
В последние годы большое внимание уделяется изучению роли TNF-cc и IL-lp в патогенезе хронических бронхолегочных заболеваний. Так, в принятой недавно национальной программе по хроническим обструктивным заболеваниям легких у взрослых (Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease, 2000) TNF-oc указан как один из биомаркеров воспалительного процесса. TNF-a является мультифакторным медиатором воспаления и быстро образуется под влиянием различных бактерий и их токсинов, вызывает образование вторичных цитокинов, таких как IL-1, IL-6, IL-8, увеличивает проницаемость эндотелия и эпителия и образование молекул -1 межклеточной адгезии (ICAM -1).
Наше исследование уровня TNF-a в сыворотке крови, мокроте и ЖБАЛ больных MB (табл. 5, 6, 7) показало, что концентрация TNF-a в периферической крови детей и взрослых больных MB была повышена в 3 раза по сравнению с контролем в период обострения заболевания. В период минимальной активности воспалительного процесса показатели TNF-a значительно снижались, однако оставались достоверно выше контрольных значений. Максимальное увеличение содержания этого цитокина наблюдалось в мокроте больных MB в период обострения заболевания в обеих исследованных группах, относительно периода минимальной активности. В ЖБАЛ у больных MB мы наблюдали схожую картину, что и при исследовании сыворотки крови: обострение заболевания приводило к увеличению TNF-a в 3 раза, по сравнению с контролем (табл. 7) и 1,5 раза превышало значения при минимальной активности заболевания.
Статистический анализ
Таким образом, повышенное содержание ЦИК у больных муковисцидозом, не зависимое от возраста, тяжести и активности воспалительного процесса свидетельствует о хроническом воспалительном процессе. Поскольку моноцитам/макрофагам принадлежит ведущая роль в клиренсе иммунных комплексов, то, выявленное нами повышение ЦИК можно объяснить либо шеддингом Fc рецепторов с поверхности моноцитов/макрофагов, либо сниженной экспрессией FcR в результате изменения функций этих клеток при хроническом воспалении.
Одним из важных событий естественного и адаптивного иммунитета в элиминации чужеродных антигенов из организма является фагоцитоз, осуществляемый моноцитами/макрофагами и нейтрофилами. Исследование функционального состояния альвеолярных макрофагов ЖБАЛ (табл. 4) и моноцитов крови (табл. 17) показало, что способность альвеолярных макрофагов больных MB фагоцитировать чужеродные частицы повышалась в оба исследуемых периода, по сравнению с показателями здоровых лиц. Это проявлялось как в увеличении процента фагоцитирующих клеток (ФЧ), так и фагоцитарного индекса (ФИ). При исследовании функциональной активности моноцитов периферической крови больных MB оказалось, что всех группах больных, как в период обострения заболевания, так и при минимальной активности воспалительного процесса каких-либо отличий от показателей здоровых лиц не выявлялось в числе фагоцитирующих моноцитов, а также в их фагоцитарном индексе. На основании полученных данных можно сделать вывод, что у больных муковисцидозом повышение фагоцитарной активности клеток моноцитарно-макрофагального ряда наблюдается только в очаге воспаления.
Изучение фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови (табл.17) показало, что в период обострения заболевания наблюдалось достоверное (р 0,005) повышение фагоцитарного числа и фагоцитарного индекса нейтрофилов больных MB по сравнению со здоровыми лицами. Минимальная активность воспалительного процесса характеризовалась также повышением ФЧ нейтрофилов, но достоверность была лишь в группе детей со среднетяжелым течением заболевания. Фагоцитарный индекс (ФИ) нейтрофилов был достоверно (р 0,05) повышен во всех группах больных MB относительно контрольных значений.
Исходя из вышесказанного, можно сделать вывод, что у больных MB повышенной способностью к фагоцитозу обладают нейтрофилы крови и альвеолярные макрофаги. Таким образом, в очаге воспаления у больных MB происходит значительное увеличение количества нейтрофилов, а также возрастает их функциональная активность в периферической крови.
Нейтрофилы и антимикробная защита у больных муковисцидозом В очаге воспаления нейтрофилы являются доминирующим типом клеток при MB. Они характеризуются увеличением числа вакуолей, повышением фагоцитарной активности, выделением в межклеточное пространство высоко реактивных метаболитов кислорода и протеолитических ферментов (Babior В. J.,1984; Witko-Sarsat V., Delacourt С, et al.1995; Булгакова T.B., Сесь Т.П., Суркова Е.А. и соавт., 2000), действие которых направлено не только на повреждение бактериальных клеток, но и на компоненты тканевого матрикса (эластин, коллаген), что приводит к деструктивным изменениям в легочной ткани (Range S.P., Dunster С, 1999; Булгакова Т.В., Сесь Т.П., Суркова Е.А. и др., 2000).
Активация азурофильных (МРО - содержащих) и специфических (LF - содержащих) гранул нейтрофилов обеспечивает структурную и функциональную трансформацию нейтрофилов из состояния покоя в состояние максимальной функциональной активности, характеризующее нейтрофил в очаге воспаления, в результате которой происходит выделение ряда белков нейтрофилов в околоклеточное пространство. Мы определяли концентрацию МРО и LF в трех биологических жидкостях - сыворотке крови (табл. 11), мокроте (табл. 13) и ЖБАЛ (табл. 15) у больных MB в зависимости от тяжести заболевания, активности воспалительного процесса и наличия синегнойной инфекции. Значительное возрастание содержания МРО и LF в сыворотке крови, мокроте и ЖБАЛ установили у всех обследуемых больных MB. Увеличение концентрации МРО в 2-3 раза и 10-15 -кратное увеличение LF в сыворотке крови свидетельствует о значительной активации нейтрофилов уже при минимальной активности заболевания, а обострение воспалительного процесса приводит лишь к незначительному возрастанию уровня МРО и LF. Вместе с тем, содержание LF достоверно отличалось между обострением воспалительного процесса и минимальной активностью заболевания.