Содержание к диссертации
стр.
ВВЕДЕНИЕ 4
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
2.1. Цитогенетический анализ культур лимфоцитов периферической
крови как метод биологической индикации дозы 12
2.2. Элиминация радиационно-индуцированных нестабильных
хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови
с течением времени после облучения и возможности их
использования для ретроспективной оценки дозы 23
2.3. Методы учёта стабильных перестроек хромосом и их применение
при реконструкции поглощенных доз у пострадавших после воздействия
ионизирующих излучений 29
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 40
Характеристика обследованных групп 40
Методики культивирования лимфоцитов периферической крови
и приготовления препаратов хромосом классическим методом 56
Статистическая обработка результатов 59
Компьютерный метод ретроспективной оценки дозы 60
4. РЕЗУЛЬТАТЫ 61
4.1. Изучение элиминации аберраций хромосом у лиц,
пострадавших при аварии на Чернобыльской АЭС 61
4.2. Ретроспективная оценка дозы радиационного воздействия
с помощью компьютерного метода у лиц, пострадавших
при аварии на Чернобыльской АЭС 94
4.3. Изучение элиминации аберраций хромосом у лиц,
пострадавших при различных радиационных инцидентах,
за исключением аварии на Чернобыльской АЭС 106
4.4. Сравнение частот хроматидных аберраций с
показателями периферической крови у пациентов
в отдалённые сроки после облучения 118
5. ОБСУЖДЕНИЕ 128
Изменение уровней аберраций хромосом с течением времени после облучения у лиц, пострадавших при аварии на Чернобыльской АЭС 128
Частоты хроматидных аберраций в отдаленные сроки после облучения у лиц, пострадавших при различных радиационных ситуациях 143
Ретроспективная оценка дозы с помощью компьютерного
метода у лиц, пострадавших при различных радиационных авариях 148
ВЫВОДЫ 161
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 163
Введение к работе
Актуальность темы
Атомная энергетика начала создаваться в СССР параллельно с развитием ядерно-оружейного комплекса с 1954 г. после пуска в г. Обнинске первой в мире атомной электростанции и развивалась впоследствии в направлении строительства других атомных электростанций и конструирования транспортных энергетических установок для подводных лодок и ледоколов под руководством таких великих ученых, как И.В.Курчатов, Е.П.Славский, А.Ф.Иоффе, П.Л.Капица, Ю.Б.Харитон, М.Г.Первухин, В.И.Вернадский, Б.Л.Ванников, Л.А.Арцимович, А.Д.Сахаров, В.Л.Гинзбург и многих других [2, 39, 45, 51, 52, 99].
Изменилась политическая жизнь страны, поменялись приоритеты, более лояльными стали и международные отношения со странами Европы и Америки. Но проблема укрепления ядерного щита нашей страны и развития атомной промышленности с использованием научных достижений для их реализации в мирных целях и сейчас остается актуальной и первостепенной задачей, которую надо решать современным ученым. Вопреки сложившимся трудностям наука продолжает свое движение вперед, и первостепенными задачами на современном этапе ее развития являются разработка и внедрение на практике основного принципа - обеспечение безопасности мирного населения и всего живого на нашей планете, снижение риска возникновения ядерных катастроф и аварий до минимума, совершенствование методов диагностики и лечения людей, подвергшихся действию ионизирующего излучения.
На каждом этапе создания и развития ядерно-оружейного комплекса персонал, работавший в непосредственном контакте с источниками ионизирующих излучений, подвергался их реальному воздействию, и всегда существовал, как он существует и сейчас, риск возникновения радиационных аварий.
В начальные периоды становления атомной промышленности имелся недостаток детальных знаний о механизмах действия ионизирующих излучений и последствиях их воздействия на организм человека и все живое на Земле.
Целями стремительно развивающейся атомной промышленности были не только совершенствование оборонной мощи и развитие энергетики, но и решение
5 задач, направленных на защиту человека от действия радиации. В результате большое внимание было уделено научному развитию биологии и медицины, их тесному сотрудничеству в решении поставленных вопросов. В результате проведения теоретических и экспериментальных работ, осуществления клинических наблюдений стало известно, что последствием действия рентгеновского, гамма-, гамма-бета- и гамма-нейтронного излучений в соответствующих дозах [28] является развитие острой лучевой болезни (ОЛБ) [23, 29]. Появилась необходимость и своевременного прогнозирования ОЛБ, точного определения степени её тяжести и осуществления адекватной терапии. За весь этот, более чем 50-летний период, был накоплен колоссальный опыт по диагностике, лечению и прогнозированию различных форм ОЛБ и её осложнений и последствий.
К методам оценки дозы излучения и прогнозирования течения ОЛБ относятся физическая и биологическая дозиметрия. Целью применения методов физической дозиметрии является определение поглощенных доз облучения в отдельных органах, тканях, частях тела и во всем теле пострадавшего для оценки тяжести радиационного поражения, планирования лечения и оценки исхода аварийного облучения пациента. Перед физической дозиметрией поставлены следующие два основных вопроса.
1. Какова численная величина максимальной дозы облучения в теле
пострадавшего и где эта доза локализована?
2. Какова количественная оценка распределения доз в теле пострадавшего?
Опыт показывает, что физическая дозиметрия способна дать ответ лишь на
первый вопрос. Дать ответ на второй поставленный вопрос, к сожалению, физическая дозиметрия не может, в связи с ограничениями методов и из-за неполноты и неточности информации об истинных обстоятельствах радиационной аварии [77, 82]. Следовательно, на практике для своевременного получения данных о дозовых нагрузках на пострадавших при радиационных авариях, необходимо комплексное использование методов, как физической дозиметрии, так и биологической индикации дозы. В области использования последней к настоящему времени накоплен огромный опыт, совершенствуются прежние и появляются новые методы определения дозовых нагрузок на человека.
Тесты биологической и клинической дозиметрии получили широкое распространение на практике при оценке тяжести радиационного воздействия. Однако эти методы не являются дозиметрией в прямом смысле, а лишь оценивают биологические и клинические проявления у пострадавших и соотносят их с аналогичными при равномерном гамма-облучении при известной средней дозе и ее мощности.
Наиболее доступным и достоверным биологическим методом оценки действия ионизирующего излучения (помимо исследования ЭПР-сигнала в эмали зуба) на современном этапе является цитогенетический метод.
Анализ аберраций хромосом в культурах лимфоцитов периферической крови является общепризнанным методом биологической индикации дозы и применяется на практике в случаях радиационного поражения людей уже более 40 лет. Метод хорошо разработан для случаев внешнего острого относительно равномерного облучения при условии его использования в ближайшие сроки после радиационного воздействия. Огромную роль цитогенетический анализ сыграл в ситуации аварии на ЧАЭС, когда в начальный период он явился практически единственным источником сведений о дозовых нагрузках на пострадавших [77, 82].
Одной из проблем, всегда стоявших перед методами цитогенетической индикации дозы, была ее оценка в отдаленные сроки после радиационного поражения. Ретроспективная оценка дозы нужна для верификации факта облучения и определения тяжести радиационного поражения в целях проведения адекватной медико-социальной экспертизы, если в ближайшие сроки после облучения дозиметрическое исследование по тем или иным причинам не проводилось. Важное значение также имеет определение канцерогенного и генетического риска для людей, непосредственно подвергшихся воздействию ионизирующего излучения. Отсутствие достоверных данных о поглощенных дозах создает объективные трудности при решении этой проблемы. Определение поглощенных доз является особенно сложной, если с момента облучения прошло не одно десятилетие. Анализ, имеющихся к настоящему моменту цитогенетических методов ретроспективной оценки дозы радиационного воздействия, имеется в методических рекомендациях МАГАТЭ и обзорах ведущих специалистов [87, 88, 125, 144].
Как известно, повреждения хромосом в зависимости от того, имеют ли они тенденцию к сохранению своего числа при делении клеток или их частота в пролиферирующеи популяции по тем или иным причинам снижается, принято делить на стабильные (транслокации, инверсии, инсерции) и нестабильные (дицентрики и другие полицентрики, кольца, фрагменты). При этом именно дицентрики обычно используются для оценки средних поглощенных доз в ближайшие сроки после острого облучения. Однако закономерное снижение их общей частоты с течением времени после воздействия радиации создает естественные трудности для дозовых оценок в отдаленный период. Следовательно, существуют две основные группы оценки дозы в отдаленный период после радиационного воздействия: анализ нестабильных (использование средней частоты дицентриков и времени их «полужизни»; Dolphin- и Qdr-методы) и стабильных (метод G-дифференциального окрашивания хромосом и FISH-метод) перестроек хромосом.
Более или менее подробно элиминация аберраций хромосом с их известным исходным уровнем была изучена в основном после парциального или локального терапевтического облучения лиц со злокачественными новообразованиями и ограничивалась рамками дозового диапазона этих лечебных процедур. Насколько обнаруженные количественные закономерности можно было перенести на случаи тотального радиационного воздействия и другие диапазоны доз, оставалось не ясным. При этом ретроспективная оценка доз по нестабильным аберрациям часто базировалась на недостаточно обоснованной концепции 3-х летнего периода «полужизни» дицентриков.
При аварии на ЧАЭС большое число людей подверглось тотальному облучению в широком диапазоне доз, и у многих из них был осуществлен цитогенетический анализ культур лимфоцитов в ближайшие сроки после радиационного воздействия [77, 82]. Это привлекло внимание к данному контингенту, как к источнику сведений, пригодных для уточнения закономерностей элиминации аберраций хромосом и разработки методов ретроспективной оценки дозы. Было начато осуществление таких исследований на материале пациентов, госпитализированных в клинику (бывшего) Института биофизики Минздрава СССР (ныне — Федеральный медицинский биофизический
8 центр им. А.И.Бурназяна ФМБА России, Генеральный директор - доктор мед. наук, профессор К.В.Котенко) в острый период и затем поступавших повторно для обследования. Однако эта работа была ограничена временем не более 5 лет после облучения [60]. Судьба же аберраций хромосом в более отдаленные сроки так же представляет значительный интерес.
В попытках найти удобные способы цитогенетической оценки дозы в отдаленные периоды после облучения большое значение придавалось и придается таким методам учета стабильных аберраций хромосом (в основном транслокаций), как G- и FISH- методы окраски хромосом. Однако на практике они оказываются еще более дорогостоящими, чем стандартный метод исследования аберраций хромосом. При этом использование FISH-метода в его первоначально задекларированном виде, основанном на оценке доз непосредственно по калибровочным кривым (для транслокаций), полученным после острого облучения in vitro периферической крови здоровых доноров, ограничилось дозовыми нагрузками не более 1,5-2,0 Гр. При больших дозах уровни стабильных аберраций хромосом в отдаленные сроки после облучения оказались ниже ожидаемых, что связанно, по-видимому, с частым нахождением стабильных и нестабильных аберраций хромосом в одних и тех же клетках. В результате они подвергаются совместной элиминации. Поэтому изучение возможности использования для ретроспективной оценки дозы нестабильных аберраций хромосом остается актуальной.
Цель работы
Оценить возможность ретроспективной индикации дозы с помощью классического метода окраски хромосом по результатам исследования культур лимфоцитов периферической крови в отдалённые сроки (преимущественно больше 5 лет) после острого внешнего облучения пациентов, пострадавших при различных радиационных авариях.
Задачи
1. Провести анализ аберраций хромосом в культурах лимфоцитов периферической крови у лиц, пострадавших в результате аварии на Чернобыльской
9 АЭС, в отдаленные сроки (больше 5 лет) после облучения.
Путём сравнения полученных данных с результатами ранее выполненных (в том числе и в ближайшие сроки после аварии на Чернобыльской АЭС) исследований изучить закономерности элиминации различных типов аберраций хромосом.
Осуществить анализ аберраций хромосом в культурах лимфоцитов периферической крови у пациентов, пострадавших при различных (кроме аварии на Чернобыльской АЭС) радиационных инцидентах.
Использовать специальную компьютерную программу, разработанную доктором биол. наук И.В.Филюшкиным, для восстановления величины полученной дозы из распределений клеток по числу содержащихся в них аберраций хромосом в отдалённые сроки у лиц, пострадавших в результате различных радиационных аварий.
На основании полученных результатов оценить возможность ретроспективной оценки дозы при применении классического метода анализа аберраций хромосом, используя имеющиеся сведения о первоначальных оценках дозы.
Новизна исследования
Работа основана на изучении в течение длительного времени с помощью классического цитогенетического метода нестабильных аберраций хромосом в культурах лимфоцитов периферической крови у достаточно однородного контингента больных, подвергшихся облучению в сходных условиях во время аварии на Чернобыльской АЭС, у которых имеются данные исследования хромосомных аберраций в ближайшие сроки после воздействия и госпитализированных для динамического наблюдения и проведения необходимых исследований со значительной повторпостью. Это дало возможность впервые изучить закономерности элиминации аберраций хромосом в отдаленные сроки (примерно от 5 до 20 лет) после облучения и оценить перспективы их использования для ретроспективного определения дозы воздействия. Ранее подобное исследование данного контингента было осуществлено спустя не более 5 лет после облучения. Также впервые проведено цитогенетическое обследование в
10 широком диапазоне времени (до примерно 50 лет после облучения) лиц, пострадавших при других радиационных авариях. На всём этом материале был апробирован оригинальный компьютерный метод ретроспективной оценки дозы.
Теоретическое и практическое значение работы
Проведенное динамическое наблюдение на протяжении длительного времени за частотами аберраций хромосом в культурах лимфоцитов периферической крови лиц, пострадавших при аварии на Чернобыльской АЭС, для которых были известны результаты цитогенетических исследований в ближайшие сроки после облучения, позволило изучить закономерности элиминации повреждений нестабильного типа и изменения уровней выявляемых с помощью классического метода атипичных хромосом, относящихся к аберрациям стабильного типа. Эти данные также дают возможность косвенно оценивать скорость пролиферации клеток, относящихся к лимфоидной ткани. На основе полученных результатов были построены уравнения множественной регрессии, включающие, во-первых, восстановленную компьютерным методом оценку дозы и, во-вторых, время, прошедшее после облучения, или частоту атипичных хромосом в отдалённые сроки, что позволяет осуществлять ретроспективную оценку дозы на основании классического цитогеиетического анализа.
Положения, выносимые на защиту
Для элиминации нестабильных аберраций хромосом в период от 5 до 20 лет после облучения на фоне высокой индивидуальной вариабельности характерно следование экспоненциальной модели со свободным коэффициентом. При этом частоты атипичных хромосом к концу периода наблюдения в среднем снизились до примерно 30%, 50% и 90% для пациентов, у которых первоначальные оценки дозы составляли 0,7-2,3 Гр, 2,8-4,3 Гр и 4,7-9,8 Гр соответственно.
Использование линейных уравнений множественной регрессии, включающих восстановленную компьютерным методом оценку дозы и время, прошедшее после облучения, или частоту атипичных хромосом в отдалённые сроки позволяет ретроспективно оценивать поглощённые дозы после осуществления классического цитогеиетического анализа, по крайней мере, до 20
лет после облучения, хотя возрастание временного промежутка между моментами облучения и подсчёта аберраций хромосом приводит к увеличению ошибок измерения.
3. В сроки более 20 лет после облучения оценка дозы по уравнению, включающему восстановленную оценку дозы и частоту атипичных хромосом, обладает большей эффективностью, чем использование для этой цели уравнения, включающего восстановленную оценку дозы и время, прошедшее после радиационного инцидента.
Основные положения работы были представлены на III международной конференции «Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций» и семинаре «Перспективные проблемы космической радиобиологии применительно к длительным орбитальным и межпланетным пилотируемым полетам», г. Дубна 4-7 октября 2005 г.; на V съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность), г. Москва, 10-14 апреля 2006 г.; на международной научно-практической конференции «Чернобыльские чтения-2008», Беларусь, г. Гомель, 24-25 апреля 2008 г.; на 36-ом ежегодном съезде Европейского общества по радиационным исследованиям (European Radiation Research Society), Франция, г. Тур, 1-4 сентября 2008 г.
Объём и структура диссертации
Диссертация состоит из глав «Введение», «Обзор литературы», «Материал и методы исследования», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Она включает 231 источник литературы (104 на русском и 127 на иностранных языках), изложена на 184 страницах и содержит 13 таблиц и 30 рисунков.
12 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
