Введение к работе
Актуальность проблемы. Энергия видимого света, имеющего длину элны 400 - 750 нм, составляет около 45% всей энергии солнечного спектра, адающей на землю. При прохождении через атмосферу он ослабляется в еныпей степени по сравнению с ультрафиолетовым. В связи с этим видимый ієт является одним из наиболее важных экологических факторов, влияющих а живые организмы. Видимый свет является основным источником энергии пя поддержания жизни, а фоторегуляторные реакции необходимы для равильной организации физико-химических процессов, протекающих в щюклеточных и многоклеточных организмах. Наибольшую группу отобиологических процессов, которые вызывает видимый свет, составляют отоэнергетические (фотосинтез), фотоинформационные (зрение у животных), фоторегуляторные (фототропизм, фототаксис, фотопериодизм и другие) роцессы. Последние активно влияют на многие стороны жизнедеятельности рганизмов - рост, развитие, дифференциацию, биосинтез различных ерментов, пигментов и других биологически активных соединений.
Однако, видимый свет способен вызывать и деструктивные реакции, посредуемые как эндогенными так и экзогенными сенсибилизаторами, тедствием которых может стать повреждение или гибель организма. Так, ногие метаболиты, поглощающие свет видимой области спектра, помимо юих основных функций, обладают побочным фотосенсибилизирующим гйствием, вызывающим повреждения компонентов клеток - белков, липидов, уклеиновых кислот.
Интерес к проблемам фотодеструкции, изучение ее механизмов, свойств
;нсибилизаторов привело к значительным успехам в этой области
^следований, что нашло и практическое применение. В последнее время
:обенно интенсивно развивается медицинское использование процессов
отодеструкции, в частности для лечения раковых опухолей методом
фотодинамической терапии (ФДТ). В основе этого метода лежит поврежденш видимым светом клеток опухоли, способных избирательно накапливат] сенсибилизаторы порфириновой природы. В настоящее время разрабатываютсз основы и модифицированного метода ФДТ. В его основе лежит пакоплени* эндогенных порфиринов, индуцированное предшественником биосинтез; порфиринов' 5-аминолевулиновой кислотой (АЛК). Проводятся интенсивны! исследования динамики накопления экзогенных и эндогенны: сенсибилизаторов и их превращений в опухоли, однако многие количественны закономерности и молекулярно-клсточные механизмы фотодинамическог действия требуют изучения на клеточном уровне, например, на культивируемы клетках млекопитающих [Zhengwen Xiao et. al., 1998].
Кроме того, все больше исследований ведется по использованию метод ФДТ в работе с бактериальными инфекциями, в связи с проблемой высоко устойчивости микроорганизмов к антибиотикам [Malik et al., 1990]. Б микроорганизмах, особенно на дрожжах, исследуется фотодинамическа активность различных экзогенных сенсибилизаторов и пути АЛЬ индуцировашюго синтеза эндогенных сенсибилизаторов-порфиринов. Таки образом, микроорганизмы и культивируемые клетки млекопитающих можи использовать в качестве удобной модели для изучения механизмов рсгуляци биосинтеза порфиринов, изучения закономерностей и механизме фотодинамического действия эндогенных и экзогенных сенсибилизаторов отработки новых клинических методов фотодинамической инактивации клетс с их помощью.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучею закономерностей накопления, распределения и эффективност фотодинамического действия некоторых экзогенных и эндогеннь сенсибилизаторов на клеточных моделях.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
-получить зависимости фотодинамического действия различт
гсосснсибилизаторов от их концентрации, времени инкубации клеток с деятелем и от дозы светового воздействия на двух клеточных моделях: льтивируемых in vitro клетках млекопитающих и биолюминесцентной стеме in vivo - генно-инженерных штаммах Escherichia coli, с онированпыми в них lux-оперонами 3-х разных видов светящихся бактерий;
-сравнить эффективность действия различных сенсибилизаторов на пользуемые клеточные модели;
-отработать условия для создания модели быстрого отбора экзогенных нсибилизаторов путем сравнения их действия на колониеобразование льтивируемых клеток млекопитающих и на колониеобразование и юлюминесценцию светящихся бактерий.
Научная новизна работы. Впервые показано, что биолюминесцентная стема светящихся бактерий чувствительна к действию различных )тосе нсибилизаторов.
Обнаружена корреляция фотодинамического действия эндогенных ндуцированных АЛК) и экзогенных фотосенсибилизаторов на активность 'нкционирования биолтоминесцентной системы бактерий и лониеобразующую способность культивируемых клеток млекопитающих.
Изучены соотношения между накоплением в клетках и »тодинамической эффективностью фотодитазина, а также временная и нцентрационная зависимости накопления протопорфирина IX у льтивируемых клеток HeLa.
Практическая значимость работы. Обнаруженная нами корреляция
нединамического действия сенсибилизатора на интенсивность
олюминесценции светящихся бактерий и на выживаемости культуры клеток
:La, позволяет использовать клетки светящихся микроорганизмов в качестве
обной модели для быстрого и эффективного отбора экзогенных
ясибилизаторов, а так же для подбора их действующих концентраций.
Отработанные условия использования лиофильно высушенных
и регидратированных светящихся бактерий в качестве биосенсора для оценк фотодинамического действия фотосенсибилизаторов позволяют создат эталоны для биотестирования, способные храниться в течение длительног времени (до одного года), и использовать их по мере необходимости дл достаточно дешевого экспресс анализа.
Полученные данные о возможности усиления фотодинамическог повреждения клеток млекопитающих с помощью модификации процессе биосинтеза порфиринов также могут иметь не только теоретическое, но практическое значение при фотодинамической терапии опухолей, культивируемые клетки млекопитающих могут быть использованы в качеств адекватной модели для отработки действующих концентраций для ФДТ.
Корреляция фотодинамического повреждения биолюминесцентно системы и колониеобразующей способности у бактерий позволяк использовать предложенные подходы при подборе сенсибилизаторов дл фотодинамической антимикробной химиотерапии (ФАХТ).
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Международной конференции по биофизике (Каир, 1998), на II Съез; биофизиков России (Москва, 1999).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 тезисов, статья, 2. статья сданыв печать.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзор литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждена заключения, основных выводов и списка литературы. Содержание работ представлено на 97 страницах машинописного текста, иллюстрировано 2 рисунками.
