Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
Радиационная патология, вызванная ионизирующим излучением .
Молекулярно-клеточные механизмы поражения организма при внешнем облучении .
Радиационная патология, вызванная внутренним облучением (радиотоксикология)
Биологическое действие радиоактивного цезия на организм (токсикология 137Cs) .
Сочетанное воздействие на организм внешнего и внутреннего облучения .
Методы и средства терапии при сочетанном внешнем и внутреннем радиационном поражении организма .
Собственные исследования
Материалы и методы исследований .
Материалы .
Методы исследований
Результаты собственных исследований .
Теоретическое обоснование возможности получения лечебно-декорпорирующего монопрепарата для лечения животных при сочетанном внешнем и внутреннем поражении
Получение препаратов иммуноглобулинов в качестве одного из основных компонентов композиционного лечебно – декорпорирующего средства
Оценка радиозащитной активности полученных иммуноглобулинов в in-vitro тест-системе
Получение и подготовка технологического сырья для изготовления сорбентов радиоцезия .
Изучение сорбционной активности отобранных препаратов в отношении к цезию -в in vitro тест системе .
Конструирование экспериментального образца полифункционального лечебно-декорпорирующего биорадиопротектора
Оценка безвредности и токсичности препарата «Ледеком» на лабораторных животных
Изучение фармако-терапевтической и декорпарирующей активности экспери-ментального образца препарата «Ледеком»
Оценка радиозащитной активности препарата «Ледеком» на белых мышах
Изучение декорпорирующей активности препарата «Ледеком» и его компонентов при инкорпорации в организм белых мышей .
Оценка лечебно-декорпорирующей способности препарата «Ледеком» при сочетанном внешнем и инкорпорированном облучении организма животных
Модификация сочетанного радиационного поражения на фоне применения препарата «Ледеком» .
Заключение .
Список использованной литературы .
Приложение
- Молекулярно-клеточные механизмы поражения организма при внешнем облучении
- Сочетанное воздействие на организм внешнего и внутреннего облучения
- Получение препаратов иммуноглобулинов в качестве одного из основных компонентов композиционного лечебно – декорпорирующего средства
- Изучение сорбционной активности отобранных препаратов в отношении к цезию -в in vitro тест системе
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В реальных условиях животные и человек могут подвергаться не только изолированному внешнему или внутреннему облучению, но и сочетанному воздействию обоих факторов (Москалев Ю.И., Егорова Г.М., Шишкин В.Ф., Биологическое действие при сочетанном действии -лучей 60Co и 131I // Сб. работ под редакцией проф. Л.А. Ильина, Ю.И. Москалева – М.: Медицина, 1970. С.173-177.). Предполагается, что внешнее и внутреннее облучение во всех случаях суммируются (Корнеев Н.А., Сироткин А.Н., Основы радиоэкологии сельско-хозяйственных животных. – М.: Энергоатомиздат, 1987. – 208 с.). Вместе с тем, в литературе имеется ряд сообщений о взаимоослабляющем действии общего гамма-облучения и местного облучения щитовидной железы радиоактивным йодом (Козлова А.В. Последствия взрывов атомных бомб в Херосиме и Нагасаки и водородной бомбы в Бикини. – М.: Медгиз, 1957. 230 с.). Однако другие данные об особенностях биологического действия ионизирующей радиации при сочетанном воздействии общего гамма-облучения и дополнительного изолированного облучения организма инкорпорированными радионуклидами опровергают это положение. По данным японских и отечественных исследователей в случае сочетанного внешнего и внутреннего облучения лучевое поражение протекает тяжелее, чем при общем облучении. При этом поражение желудочно-кишечного тракта и системы иммуногемопоэза несет более выраженный характер, сопровождающийся возникновением острого лучевого синдрома, обусловленного, главным образом, внешним облучением (Василенко И.Я., Классовский Ю.А., Малахов Н.Ф. и др. Особенности течения острой лучевой болезни при общем влиянии -облучения в сочетании с местным облучением щитовидной железы радиоактивным йодом. // Распределение, кинетика обмена и биологическое действие радиоактивных изотопов йода: Сб. работ под ред. проф. Л.А. Ильина, Ю.И.Москалева – М.: Медицина, 1970. С.227-231.; Калистратова В.С., Оксентюк Г.С., Крюк В.Ф. К вопросу о биологическом действии 131I и сочетанных формах их поражения // Распределение, кинетика обмена и биологическое действие радиоактивных изотопов йода. – М.: Медицина, 1970. С.190-196.).
Полиорганная и полисистемная радиационная патология, вызванная сочетанным действием на организм животных внешнего и инкорпориро-ванного облучения создает существенные трудности для терапии таких поражений, что диктует необходимость изыскания более эффективных методов и средств противорадиационной защиты.
Степень разработанности проблемы. В результате целенаправленных исследований по изысканию средств противорадиационной защиты сотруд-никами ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» в последние годы разработана технология изготовления радиозащитных средств на основе веществ зоогенного (сыворотка крови, лимфа, глобулины), микробного (радиозащитный полиантиген), апифитогенного (Вита-Форце) и детоксико-десорбирующих веществ (высокодисперсные фракции бентонита) (Иванов А.В., Низамов Р.Н., Конюхов Г.В. и др. Способ получения препарата для профилактики и лечения радиационных поражений организма: Патент РФ № 2338546 от 10.09.2006 г.; Иванов А.В., Низамов Р.Н., Конюхов Г.В. и др. Натуральная биологически активная кормовая добавка «Вита-Форце» // Патент РФ № 2324361 от 20 мая 2008 г.).
Учитывая, что разработанные в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» препараты обладают высоким радиотерапевтическим эффектом при изолированном внешнем облучении (противорадиационный иммуноглобулин, апифитопре-парат «Вита-Форце»), а минеральный сорбент (бентонит) – декорпори-рующим действием было выдвинута научная идея, что сочетанное применение этих препаратов может оказывать лечебное действие при комбинированном радиационном поражении, сотрудниками ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» проведены исследования по изучению лечебного действия этих препаратов при сочетанном применении их на фоне комбинированного радиационно-токсического (Фатерахманов Л.Р. Комбинированное поражение животных гамма-радиацией и кадмием и применение средств терапии: Автореф. дисс… канд. биол. наук. - Казань, 2008 - 21с.), и радиационно-биологического (Гайзатуллин Р.Р. Иммунологические подходы к разработке средств экстраиммунной терапии при многофакторной экопатологии. Афтореф. дисс. д-ра биол. наук - Казань, 2012 - 35с.) поражений.
При этом важным, с точки зрения создания многофункционального монопрепарата, является то, что радиотерапевтический эффект противо-радиационного лечебно-профилактического иммуноглобулина усиливается при комбинации его с фито («Эра-Н», «Эраконд») - и апипрепаратами («Вита-Форце»), а сочетание его с природным сорбентом - бентонитом, придает ему совершенно иное - сорбционно-детоксикационное (декорпори-рующее) свойство, усиливая не только радиотерапевтическое, но и декор-порирующее свойство (Иванов А.В. Низамов Р.Н. Конюхов Г.В. и др. Способ лечения радиационно-кадмиевого поражения и способ получения препарата для лечения радиационно-кадмиевого поражения // Патент РФ № 2484830 от 20 июня 2013 г.).
С учетом отсутствия в литературе сведений о терапии сочетанных радиационных поражений, вызванных одновременно воздействием на организм внешнего (гамма-излучение) и инкорпорированного (цезий -137) облучения и в связи с актуальностью данной проблемы и, с учетом установленной сотрудниками ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» принципиальной возможности конструирования полифункционального лечебно-диагностичес-кого композиционного препарата, были проведены настоящие исследования.
Цели и задачи. Целью работы является разработка технологии получения полифункционального лечебно-декорпорирующего композицион-ного препарата для лечения внешнего и инкорпорированного радиационного поражения организма.
Исходя из вышесказанного на решения были поставлены следующие задачи:
1. Теоретически обосновать возможность получения композиционного лечебно-декорпорирующего препарата при сочетанном воздействии на организм внешнего (-лучи) и инкорпорированного (цезий–137) облучения.
2. Изготовить сыворотку и тканевые глобулины.
3. Получить высокодисперсную фракцию природного сорбента-бенто-нита.
4. Изготовить композиционный сорбент на основе глобулинов и бенто-нита.
5. Оценить безопасность применения препарата «Ледеком», включая токсичность при подкожном, пероральном применении и отдаленные последствия (эмбриотоксичность, тератогенность, постнатальное развитие и др.) на лабораторных животных по принятым критериям.
5. Провести оценку иммуно-фармакологического лечебно-декорпори-рующего действия препарата в in-vitro и in-vivo тест-системе.
Научная новизна. На основании изучения биологической совместимости препаратов глобулинов, апипродуктов и сорбционно-декор-порирующего агента впервые сконструирован лечебно-декорпорирующий композиционный препарат «Ледеком» (глобулин+аписоген+бентонит) для лечения поражений внешним (-лучи) и инкорпорированным (цезий-137) облучением животных; в модельных (культивируемые клетки крови и контаминированные пробы воды) и в опытах in-vivo (лабораторные животные) установлена высокая радиотерапевтическая и декорпорирующая активности препарата как при изолированном, так и сочетанном действии на организм электромагнитного (-лучи) и корпускулярного излучений; показано, что радио-фармакологическое действие разработанного препарата на пораженных внешним и инкорпорированным облучением животных реализуется посредством гемопротекторного, детоксицирующего, иммуно-протекторного действий глобулинов, антиоксидантного и антибактериаль-ного действий апипродуктов, сорбционно-детоксикационного и декорпори-рующего действий микрочастиц природного минерала – бентонита.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные указывают на фундаментальность концепции радиационной фармакологии о том, что многокомпонентные смеси на основе веществ различных классов соединений (фито-, зоо- и минерального происхождения) обладают полифункциональными свойствами, значительно расширяя спектр биологического действия отдельных компонентов радиозащитных средств. Выбранная модель конструирования лечебно-декорпорирующего препарата может быть использована для направленного поиска радиозащитных средств из различных классов и создания многофункциональных монопрепаратов.
Практическая значимость работы заключается в том, что для лечения подвергнутых сочетанному внешнему и инкорпорированному облучению животных предложено композиционное лечебно-декорпорирующее средство «Ледеком», оказывающее как радиотерапевтическое, так и декорпорирующее действие на пораженный двумя видами ионизирующего излучения организм.
Получение и применение радио-фармакологического препарата регла-ментируется разработанной нормативно-методической документацией, утвержденной в установленном порядке.
Методология и методы исследований. Исследования выполнены в 2010-2013 гг. в лаборатории радиационной иммунологии ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» г. Казань, в соответствии с планом НИР (№ государственной регистрации – 01200202604). Методологической основой проведенных исследований являлось обоснование возможности конструирования монопрепарата, сочетающего в себе свойства отдельных компонентов, приводящих не только к аддитивному, но и потенцирующему действию составляющих его компонентов (веществ).
Исследования проводились на 120 белых мышей живой массой 18-20 г., 78 белых крыс живой массой 180-200 г., 10 кроликов. Животных подбирали по принципу аналогов с учетом породы, возраста, пола и массы. Условия проведения опытов, схемы, вид и количество используемых животных, дозировки, кратность применения препарата приведены в соответствующих разделах. Кормление животных осуществляли с общепринятыми нормами с учетом технологических особенностей для разных видов животных
Моделирование внешнего облучения, вызывающего острую лучевую болезнь легкой, средней и тяжелой степени осуществляли путем облучения лабораторных животных в дозах соответственно: 6,0-8,0 Гр (белые мыши), 7,0-9,0 Гр (белые крысы). Моделирование внутреннего облучения осуществлялось путем подкожного введения водного раствора цезия-137 с удельной активностью 10 кБк/мг животным в дозе: 0,2 мл белым мышам (30 Бк/г) и 0,5 мл (50 Бк/г) белым крысам, что соответствует 0,01 ЛД50 данного изотопа. Моделирование сочетанного внешнего и внутреннего облучения осуществлялось путем облучения белых мышей и белых крыс на гамма-установке «Пума» в дозах 6,0-8,0 Гр и 7,0-9,0 Гр соответственно и после этого животным подкожно вводили водный раствор цезия-137 в дозах 30 Бк (0,2 мг/гол белым мышам) и 50 Бк (0,5 мг/гол белым крысам).
Накопление, распределение и выведение радиоцезия из организма у контрольных и подверженных воздействию потенциальных лечебно-декорпорирующих композиций осуществляли путем радиометрирования проб из органов и тканей убитых животных в различные сроки после облучения, затравки изотопом и применения исследуемых препаратов животных с использованием гамма-счетчика «Компьюгамма».
Получение сывороток и антисывороток от подвергнутых различному физико-биологическому воздействию (иммунизация, облучение, лечение) животных-доноров, а так же выделение глобулинов из сывороток осуществляли в соответствии с общепринятыми в иммунологии методами (Кэбот Е., Мейер М.,1968)
Для получения тканевых глобулинов (гистоглобулинов) использовали методы гомогенизации и элюирования гемогенатов с последующим осаждением глобулинов сульфатом аммония и фракционированием, которые осуществлялись в соответствии с методическими указаниями Н.Н. Клемпарской (1972) в модификации Г.Фримеля (1987).
При изучении возможности усиления терапевтической эффективности испытуемых средств, с целью составления многокомпонентных смесей и композиций на основе веществ фито-зоо-аписогенного и минерального происхождения, определяли их совместимость, безвредность, токсичность, раздражающие свойства, эмбриотоксичность и тератогенность в соответствии с общепринятыми в токсикологии, иммунологии, вакцинно-сывороточном деле сертифицированными методами.
Лечебно-декорпорирующее действие испытуемого средства оценивали по степени коррекции клинико-иммунологических показателей, интегральному показателю – 30 суточной выживаемости и их декорпорирующей активности.
Коррекция клинического статуса поражений двумя видами ионизирующих излучений и леченных испытуемыми средствами животных, оценивали по степени модификации течения лучевой болезни, гемопротекторному (ингибирование панцитопении, эритро-, тромбоцито-, лейкопении), иммунорегуляторному индексу (Th/Ts), по И.П. Кондрахину (2004), состояние гуморального, синтез иммуноглобулинов, бласт-трансформации лимфоцитов оценивали по Д.К. Новикову (1993), состояние клеточного иммунитета- по уровню Т- и В – лимфоцитов, субпопуляции Т-лимфоцитов по Г.Фримелю (1987), уровень липидных радиотоксинов (МДА)- по М.С.Гончаренко и А.М Латиновой (1985), хиноидных радиотоксинов – в РБФ тест-системе – по Р.Р. Гайнуллину (2009), содержание общего белка рефрактометрическим методом, фракции белков и глобулинов - турбодиметрическим, состояние факторов неспецифической резистентности: лизоцимной активности сывороток крови – по В.Г.Дорофейчуку(1968), бактерицидной активности сывороток крови в отношении E.coli шт.18 – нефелометрически по О.В.Бухарину (1979), фагоцитарную активность крови - по Е.А.Кост и М.И. Стенко (1975), состояние прооксидантно-антиоксидантной системы (ПАОС) – по уровню супероксидазных радикалов (ТБК – активного соединения, МДА и хиноидного радиотоксинов) и уровня антирадикальных ферментов (супероксиддисмутазы – СОД и каталазы – КАТ) по М.А.Королюк (1988)., уровню декорпорации 137Cs-радиометрически по общепринятой в радиобиологии методике (Москалев Ю.И.,1970)
Полученный в ходе экспериментов цифровой материал подвергали статистической обработке с использованием общепринятых математических методов, степень достоверности различий между сравнительными показателями определяли по критерию Стьюдента с применением программ «Microsoft Word 2007», «Microsoft Excel 2007».
Для проведения исследований использовались следующие сыворотки и глобулины: антисыворотка к радиозащитному микробному полиантигену (МПАГ), антисыворотка к лучевому антигену (радиотоксину), сыворотка животных - реконвалесцентов, выживших после облучения в полулетальных дозах, сыворотка животных, выживших после облучения в летальной дозе, сыворотка выживших животных, после летального облучения и лечения противорадиационным лечебно-профилактическим глобулином, сыворотка животных, подвергнутых двукратному облучению в сублетальной и летальной дозах животных, элюенты из органов и тканей (печени, почек, селезенки, лимфатических узлов, кожи, мышц, толстого и тонкого отдела кишечника, яичников, семенников, костного мозга), взятые от животных доноров сывороток и антисывороток вышеперечисленных животных; глобулины, выделенные из вышеперечисленных сывороток и глобулинов, выделенных из элюентов органов и тканей животных – доноров вышеперечисленных сывороток и антисывороток.
В качестве лечебно-профилактических средств были использованы средства фитогенного и микробного происхождения: апифитопрепараты «Вита-Форце», «Вита-Форце М», «Эра-Н», «Эраконд», противорадиационный лечебно-профилактический иммуноглобулин (ПЛПИ), экспериментальная серия лечебно-декорпорирующей композиции ПЛПИ + бентонит, ПЛПИ + «Вита-Форце» + бентонит.
В качестве потенциальных сорбентов использовались: ХЖ-90, «Бифеж», цеолит, хитозан, апизан, бентонит, метаболиты B.subtilis, травяная, тыквенная, хвойная мука, пчелиный подмор, чага, прополис, воск, восковая моль, маточное молочко, трутневый и пчелиный расплод, обножка, перга, 17 вариантов композиций на основе веществ растительного, животного, микробного и минерального происхождения.
В выполнении отдельных этапов диссертационной работы принимали участие к.б.н., с.н.с. К.Т. Ишмухаметов, к.б.н. с.н.с. М.М. Шакуров., к.б.н., с.н.с. И.Р. Юнусов, которым автор выражает искреннюю благодарность за оказанную помощь и плодотворное сотрудничество.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Технология получения композитного препарата с полифункцио-нальными свойствами.
2. Радио-фармакологическое действие препарата при изолированном воздействии внешнего и внутреннего облучения.
3. Иммуно-фармакологическое действие препарата при сочетанном двухфакторном радиационном поражении.
Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности результатов проведенных исследований подтверждена комплексными исследованиями. Акт комплексных испытаний утвержден директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ». Статистическая обработка, расчеты средних арифметических значений, стандартных отклонений результатов гематологических, биохимических и радиометрических исследований, положения, выводы и практические предложения диссертационной работы аргументированно отражают содержание диссертации.
Материалы по теме диссертации доложены на ежегодных сессиях ученого совета ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по рассмотрению отчетов и НИР (Казань. 2010-2013), а также на Международном симпозиуме «Биохимия – основа наук о жизни», посвященном 150-летию кафедры биохимии КФУ (ноябрь, 2013 г., Казань).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 научных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 153 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, заключения, списка использованной литературы, приложения. Работа иллюстрирована 24 таблицами. Список литературы включает 171 литературный источник, в том числе 48 зарубежных авторов.
Молекулярно-клеточные механизмы поражения организма при внешнем облучении
Первые сведения о биологическом действии ионизирующих излучений появились после открытия Рентгеном Х-лучей и Беккерелем естественной радиоактивности. К настоящему времени определилась нозологическая единица особого заболевания - лучевая болезнь (Киршин В.А., Бобрышев К.П., Бударков В.А. и др. Радиобиологические эффекты у животных. - М.: МГАВМиБ. - 1999. – 196 с.; Ярмоненко С. П. Радиобиология человека и животных. - Изд. 2-е. - М.: Высшая школа, 1988. - 424с.).
Радиационное воздействие представляет собой сочетание прямого эффекта, произведенного излучением на вещество тканей организма, с прямым, вторичным поражением различных регуляторных механизмов, реагирующих на облучение. Именно поэтому радиобиология исследует действие излучений на молекулярном, клеточном, тканевом и организменном уровнях (Кудряшов Ю.Б., Беренфельд Б.С. Основы радиационной биофизики. - М.: Изд-воМГУ, 1982.- 302с.). Действие радиации на молекулярном уровне, в конечном счете сводится к поглощению энергии излучения облучаемой средой (структурные компоненты клеток - макромолекулы, Н2О, метаболиты), приводя к возбуждению и ионизации молекул с образованием активных форм радикалов и ионов (Уланова A.M. Выявление клеточной лучевой аутоаллергии у мышей с помощью метода ингибиции миграции лимфоцитов // Радиобиология. - 1974. –Т. 14.- Вып. 1. - С.88-91.; Ainsworth, E. Effect of microbial antigens on irradiation mortality in mice /Е.Ainsworth, Н.Chase //Proc. Soc. Exp. Biol. Med. - 1959. - V. 102. - P. 483-488.). Важную роль в развитии первичного эффекта в живой ткани играют радикальные формы воды, индуцированные в результате ее радиолиза и являющиеся сильнейшими окислителями (перекись водорода - Н2О2, гидропироксид -НО2 и высший пероксид - Н2О4), вступающими в необычные для клеток реакции с различными молекулами, формирующими компоненты клеточных структур (Кудряшов Ю.Б. Лучевое поражение "критических систем" // Лучевое поражение / Сб. под ред. Ю.Б. Кудряшова. - M: Изд-во МГУ, 1987. - С.5-72.). Результаты многочисленных фундаментальных последующих исследований свидетельствуют о том, что в основе поражающего эффекта ионизирующих излучений лежат совершенно иные механизмы типа цепных, самоповторяющихся реакций, ведущих к изменению структурно-функциональной организации биологической системы (Кудряшов Ю.Б., Киршин В.А., Бударков В.А. Ветеринарная противо-радиационная защита. – M.: Агропромиздат, 1990. - 158с.; Squire Н.М. et. al. International Conference on Radioisotopes in Scientific Research UNESCO/NSRIC 3, I957. - p.143). За стадией первичного (прямого) действия радиации на клеточные структуры, радиолизом воды и аминокислот с образованием активных форм радикалов и ионов, следует стадия непрямого (опосредованного) действия облучения, длящегося от нескольких секунд до нескольких недель и месяцев (Bond V. P., Robinson С V. A mortality determinant in nonuniform exposures of the mannual. - Schweiz. med Wschz. - 1967, Sappl., - V.7. - P.265 - 275). Начальным этапом этой стадии является формирование первичных повреждений в критических структурах или "мишенях" радиационного поражения клеток Большой фактический материал по радиочувствительности клеточных структур позволяет сделать общий вывод о главенствующей роли повреждения ядерного аппарата, а именно критических структур хроматина. По цитологическим тестам клетку считают погибшей, если в ней обнаружены конденсация или лизис ядра, которые коррелируют с необратимым прекращением синтеза ДНК в делящихся клетках с последующей остановкой синтеза РНК, одновременно с конденсацией ядра происходит активация процессов пероксидации липидов, нарушение структуры и функции плазматических мембран (Москалев Ю.И., Стрельцова В.Н. Отдаленные последствия радиационного поражения. Неопухолевые формы // Итоги науки и техники. Радиационная биология. - М.: ВИНИТИ, 1987. - Т. 5. – 214 с.). Важная роль в развитии радиационного поражения клеток отводится нарушениям процессов окислительного фосфорилирования, белкового синтеза, индукции перекисного окисления липидов, образованию радиотоксинов, изменению функционирования ферментов и систем регуляции клеточного метаболизма и нарушению структуры и функции плазматических мембран (Рыскулова С. Т. Радиационная биология плазматических мембран. - М.: Медицина, 1986. – 271 с.). В последующие годы предложена гипотеза "генетической программы" клеточной гибели (Уманский С.Р. Генетическая программа клеточной гибели: гипотеза и некоторые положения // Усп. совр. биол. -1982. - Т. 93. -Вып. 1. - С. 139-148) основанная на том, что клетки обладают последовательно развивающейся во времени молекулярно-генетической программой, приводящей клетку к естественной гибели, а ионизирующие излучения ускоряют эту программу. В организме животных фактически во всех типах клеток присутствуют критические радиочувствительные структуры, что послужило основанием выдвинуть концепцию о лучевом поражении "критических структур" (Кудряшов Ю.Б. Поиск и изучение механизмов действия новых природных и синтетических противолучевых средств. Москва – Пермь: Изд-во МГУ, ПГУ, 1989. С. 6-21), согласно которой в развитии и исходе отдельных лучевых синдромов главенствующую роль отводят так называемым «критическим системам», «структурам» и «пусковым радиочувствительным процессам», находящимся под контролем регуляторных систем. Как было указано выше, наиболее радиочувствительной структурой клетке считается ядро, а наименее радиорезистентной макромолекулой - ДНК (Кругликов Б.П., Васильев А.В., Шевченко А.С. Действие ионизирующих излучении на сельскохозяйственных животных // Сельскохозяйственная радиоэкология / Под ред. P.M. Алексахина, Н.А. Корнеева. - М.: Экология, 1991.-С.174-195; Wasserman R.H. et.al i- Internal radiation//. J. Radiation Biol. 1962, V.4, 3, p.229.). Основным доказательством того, что ДНК является радиобиологической мишенью в клетке, служит тот факт, что ионизирующие излучения обладает сильным мутагенным эффектом, а для мутагенного действия ДНК являете единственной мишенью. Следовательно, ДНК - это классическая критическая система клетки, играющая важнейшую роль в развитии радиобиологических реакций, приводящих к гибели клетки, возникновению генных и хромосомных мутаций (Кудряшов Ю.Б. Поиск и изучение механизмов действия новых природных и синтетических противолучевых средств. Москва – Пермь: Изд-во МГУ, ПГУ, 1989. С 6-21). Показано, что возникновение «ситуации дисбаланса» (репликация, рекомбинация, репарация, рестрикация, модификация, транскрипция, миграция и трансформация генов, резкое торможение или остановка синтеза ДНК) обуслав-ливает индукцию двухволновых разрывов ДНК в критических органах (Эйдус Л.Х. Интерфазная гибель облученных тимоцитов - результат «эффекта свидетеля» // радиобиология. - 2002. - Т. 42. - № 3. - С.284-286). Согласно структурно-метаболической теории в радиобиологии (Кузин A.M., Копылов В.А. Радиотоксины. - М.: Наука, 1983. - 173с.; Gabler, E. Der gezielte Schok als therapeutisches Mittel nach letaler Ganzkorperbestrahlung / E.Gabler, W.Stockal // Strahlentherapie. - 1967. - V. 133. - № 1. - Р. 117-125.) облучение организма ионизирующими излучениями вызывает патофизиологические и патобиохимические изменения на молекулярном, субклеточном и тканевом уровнях, которые формируют лучевое поражение целого организма, приводящее к возникновению лучевой болезни. Таким образом, лучевая болезнь - это патологический процесс, развивающийся в результате сложных химических и биохимических изменений, возникающих в организме под воздействием облучения. Конечная стадия радиационного поражения характеризуется видимыми функциональными, а затем и морфологическими изменениями, остановкой деления клеток, разрывом хромосом, гибелью клеток организма. Степень лучевого поражения организма, тяжесть, клиника, особенности течения и исход лучевой болезни зависят от многих факторов. К ним относятся: вид ионизирующих излучений, доза и ее мощность, кратность (дробность), площадь облучения, ее локализация, реактивность организма и его исходное состояние (Киршин В.А. Обеспечение радиационной безопасности с.-х. животных / Ветеринарная патология. - 2002. - № 3. - С.51-57; Ainsworth, E. Postirradiation leukocyte Patterns in mice and dogs treated with endotoxin / Е.Ainsworth, F.Mitchell // Rad. Res. - 1968. - V. 33. - № 2. - Р.325-336.).
Сочетанное воздействие на организм внешнего и внутреннего облучения
В реальных условиях в окружающей человека среде, где он живет и работает, действует сложный комплекс разнообразных факторов физической, химической и биологической природы которые могут сочетаться с ионизирующим излучением и вызывать вредные последствия для здоровья. Вопросы количественной оценки комбинированного и сочетанного факторов радиационной и нерадиационной природы рассматривают в своих работах токсикологи, радиобиологи и гигиенисты (Машковский М.Д., Лекарственные средства. Ч.1. – М.: Медгип, 1963. – С.389.).
Комбинированные радиационные поражения, обусловленные внешним и внутренним облучением, среди радиационных травм занимают особое место. Изучение таких поражений представляет не только теоретический, но и большой практический интерес, так как в большинстве случаев воздействие ионизирующих излучений носит сочетанный характер за счет внешнего -излучения и внутреннего облучения от поступивших в организм радионуклидов. Поступление в организм более или менее значительных количеств радионуклидов, очевидно, можно ожидать лишь в сочетании с внешним облучением. Возможны самые разнообразные сочетанные воздействия радиации. Наиболее опасным представляется пребывание на загрязненной местности в первые минуты и часы с момента формирования радиоактивного следа, когда отмечаются большая мощность дозы и высокая концентрация радионуклидов в воздухе. В этих условиях радиационные поражения носят, как правило, комбинированный характер. При сочетании внешнего и внутреннего облучения можно ожидать: аддитивного действия, когда результат такого облучения равен сумме их действия; проявления синергизма, когда эффект их действия больше суммы; проявления ингибирования, когда эффект их действия меньше суммы, т.е. проявляется ослабление воздействия радиации. (Ярмоненко С.П., Вайнсон А.Л., Радиобиология человека и животных: учебное пособие. - М.: Высш. шк., 2004.- 549с.).
Исследование патогенеза и дозо-временных зависимостей проявления патофизиологических нарушений при комбинированных поражениях необходимо для прогноза потерь, рациональной профилактики и лечения таких поражений. Между тем, в литературе имеются лишь единичные публикации, посвященные комбинированным поражениям ПЯД. Отсутствие достаточных сведений о развитии патологических процессов при таких поражениях требует всестороннего изучения этой сложной проблемы (Василенко И.Я. Токсикология продуктов ядерного деления - М.: Медицина, 1999.-200 с.).
В. Л. Шведов (Шведов В.Л. Некоторые закономерности развития у крыс остеосарком, индуцированных стронцием-90 при многократном и хроническом введении // Биологические эффекты малых доз радиации / Под ред. проф. Ю.И. Москалева. М.: Институт биофизики МЗ СССР, 1983.-216с.) приводит данные по изменению средней продолжитель-ности жизни крыс при комбинированном воздействии ионизирующего излучения. Крысы-самцы получали 147Рm в дозах от 1,85105 до 1,85107 Бк/сут. 131I и 89Sr вводили в дозах от 1,85103 до 1,85106 Бк/сут. Внешнее -облучение от источника 137Cs при поглощенной мощности дозы - 0,015 Гр/сут. Доза облучения животных составляла 0,5; 1,2 и 4 Гр на крысу.
При комбинированном внешнем и внутреннем облучении радионуклидами различной тропности ведущими в формировании эффекта по критерию средней продолжительности жизни являются внешнее -излучение и остеотропные -излучатели. Комбинированное радиационное поражение не сопровождается суммированием эффекта, если доза не превышает 2-3 Гр. При более высоких дозах сочетанного внешнего и внутреннего облучения эффект может быть оценен как более чем аддитивный.
Л. А. Булдаков, В.И. Карпова (Булдаков Л. А., Карпова В. Н. Продол-жительность жизни крыс при сочетанном внешнем (137Cs) и внутреннем (237Np) облучении // Радиобиология, 1984. Т.24. Вып.3. С.373-375.) проанализировали данные по отдаленным последствиям комбинированного действия внешнего -облучения и инкорпорированных радионуклидов (237Np, 238Pu, 239Pu и 241Am). Радиоуклиды крысам вводили однократно по 18,5 Бк/кг. Доза -облучения от 137Cs была от 6,45 до 103,2 мКл/кг. Было показано, что по показателю средней продолжительности жизни при комбинированном действии наблюдается эффект суммирования. Отмечается также увеличение числа случаев развития лейкозов до 7,7-13,4 %, против 0,7 % в интактном контроле.
В опытах на собаках, подвергнутых комбинированному внешнему (60Со) и внутреннему (239Pu), 17-22 кБк/г, 103 и 51,6 мКи/кг, З.И. Калмыкова (Калмыкова 3. И., Булдаков Л. А. Влияние внешнего -излучения на сокращение продол-жительности жизни и темпы формирования поглощенных доз у собак от инкорпорированного 39Pu // Радиобиология, 1988.-Т. 28.- Вып. 4. - С.51), показала, что при комбинированном воздействии наблюдаются более глубокие поражения. Отмечается по некоторым показателям (масса тела) тенденция к превышению аддитивности при сочетанном воздействии, в случае кумуляции высоких уровней доз. Как правило, чем больше сила воздействия, тем значительнее может оказаться степень превышения аддитивности. При этом для каждого из показателей возможны свои границы перехода аддитивности в сверхаддитивность. В опытах на подвергнутых комбинированному внешнему (-лучи 60Со) и внутреннему (239 Pu) воздействию крыс показано, что совместное воздействие 239 Pu и -излучения приводит к большим сдвигам активности аминотрансфераз и щелочной фосфатазы чем при раздельном их действии. Л.А. Булдаков, Т.И. Левдик (Булдаков Л. А., Левдик Т. И. Отдаленные последствия сочетанного воздействия внешнего Y-облучения 137Cs и инкорпорированного 239Pu // Радио биология. 1984.- Т.24.- Вып.5.- С.668-671.) считают, что при комбинированном воздействии наблюдается суммация эффекта двух видов ионизирующих излучений. Также изучались отдаленные эффекты при комбинированном действии некоторых радионуклидов (137Cs, 131I, 90Sr, 45Ca). Было показано, что комбинированное введение 45Са и 131I усиливает общий мутагенный эффект. При комбинированном действии радионуклидов происходит изменение репаративных процессов в отдельных системах, которое приводит к неадекватному суммарному эффекту.
При сочетанном действии -излучения и 239Pu нестохастические эффекты могут прогнозироваться с учетом их возможной суммации. После инкорпорации плутония характерно развитие остеосарком, после –облучения - лейкозов и других опухолей мягких тканей. По бластомогенному действию ОБЭ -излучения плутония составляет 19,1, что соответствует коэффициенту качества, равному 20 для -излучающих радионуклидов. Следовательно, при сочетанных воздействиях указанных доз - и -излучений частота выхода злокачественных опухолей в целом, в том числе и остеосарком, обусловлена простой суммацией эффектов. В литературе имеются и другие данные, когда комбинированное действие радионуклидов и внешнего -облучения не вызывает усиления или суммации биологического эффекта, а наоборот, уменьшает частоту злокачественных новообразований (Распределение, кинетика обмена и биологическое действие радиоактивных изотопов йода / Под ред. Л. А. Ильина и Ю. И. Москалева. М.: Медицина, 1970.- С.124-330.).
Получение препаратов иммуноглобулинов в качестве одного из основных компонентов композиционного лечебно – декорпорирующего средства
На первом этапе работы данного раздела, животных – доноров сывороток подвергали различному физико-биологическому воздействию. В опытах использовали кроликов, разделенных на 3 группы по 3 животных в каждой. Животных 1-й группы однократно подкожно иммунизировали радиозащитным полиантигеном в дозе 6,5 см3, 2-й группы - подвергали двукратному внешнему гамма-облучению в малой (0,1 Гр) и через 24 часа - большой (10,9 Гр) дозе. Животных 3-й группы облучали в летальной дозе (11,0 Гр) и через 24 часа лечили противорадиационным лечебно-профилактическим иммуноглобулином (ПЛПИ) путем однократного подкожного введения препарата в дозе 1,0 см3.
Через 10, 20 и 30 дней после иммунизации, облучения и лечения у животных брали пробы крови, получали сыворотку и выделяли глобулины путем высаливания насыщенным раствором (50 %) сульфата аммония. Полученные экспериментальные серии глобулинов стандартизировали по сухому веществу, доводя концентрацию глобулинов до 10 %, хранили их в холодильнике при температуре 6 ± 2 С.
Для получения тканевых глобулинов (гистоглобулинов), животных всех групп, подвергнутых вышеуказанным физико-химическим воздействиям (иммунизация, облучение, лечение), через 30 дней после 3-х факторного воздействия убивали, извлекали внутренние органы (печень, почки, селезенку, лимфатические узлы, сердце, мышцы, кожу, толстый и тонкий отдел кишечника, яичники, семенники, костный мозг).
Предварительное грубое измельчение тканей проводили в полузамороженном состоянии при помощи ножниц (оптимальный размер кусочков ткани составлял менее 5 мм в диаметре). Затем кусочки ткани гомогенизировали в гомогенизаторе с ножами («Bhler Tbingen», 13000 об/мин). Разрушения вели небольшими партиями, следя, чтобы температура гомогената не поднималась выше 10С, длительность каждого разрушения не превышала 1-2 мин. Гомогенат разводили физологическим раствором в соотношении 1:10 и после тщательного перемешивания на шуттель-аппарате, смесь центрифугировали при 1000 об/мин в течении 20 мин. Центрифугат удаляли. Супернатант подвергали диализу и концентрировали против ПЭГ 20 000 до 1/5 – 1/10 исходного объема. Диализат ресуспензировали в 0,15 М фосфатном буфере с рН 7,2 в соотношении (1:10). Из полученного диализата выделили глобулины методом осаждения сульфатом аммония. Осаждение проводили путем добавления равного объема насыщенного раствора сульфата аммония в 0,15 фосфатном буфере с рН 7,2. После перемешивания растворов смесь оставляли при 4С на 12 часов для достижения полноты осаждений. Осадок собирали центрифугированием, растворяли в ФСБ с рН 7,2 и диализовали против ФСБ. В полученном осадке определяли содержание белка, а потом осадок суспендировали в физиологическом растворе, доводя концентрацию глобулинов до 10 %. С использованием вышеописанной методики нами были приготовлены 37 вариантов тканевых глобулинов (гистоглобулинов) из органов и тканей кроликов, подверженных вышеуказанному 3-факторному физико-биологическому воздействию. Полученные тканевые глобулины хранили в холодильнике при температуре 6 ± 2С и в дальнейшем использовали в качестве одного из основных компонентов при конструировании композиционного лечебно-декорпорирующего препарата.
Таким образом, в результате проведенных в этой серии опытов нами были получены 37 вариантов сывороточных и тканевых глобулинов, источники и условия получения которых представлены в таблице 1.
Полученные на первом этапе работы сыворотки и тканевые глобулины в следующей серии опытов были испытаны на противолучевые свойства в модельной in-vitro тест системе. Выбор скрининговых исследований в модельной in-vitro системе был продиктован тем, что исследования проводили с использованием большого количества потенциальных лечебных препаратов, для оценки которых в in-vivo тест системе потребовалось бы значительное количество дорогостоящих и дефицитных лабораторных животных. Этот раздел работы проводили совместно с д.б.н. Р.Р. Гайзатуллиным с использованием лимфоцитов периферической крови кроликов.
Лимфоциты выделяли из периферической крови путем центрифугирования на градиенте плотности фикол-пака при 700g в течение 23 мин при комнатной температуре, предварительно осадив эритроциты 4,5% - ным раствором декстрана Т-300. Мононуклеары, полученные с интерфазы, дважды отмывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ), не содержащим ионы Са2+ и Mg2+.
Клетки культивировали в питательной среде, содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) с добавлением 20 мкг/мл гистамина, 2 мМоль/л глобулина до конечной концентрации 8105 кл/мл. Полученную суспензию клеток распределяли по 1 мл во флаконы для культивирования и клетки инкубировались при 37С в течении 24 ч.
Для моделирования радиационного поражения, лимфоциты подвергали облучению в различных дозах -лучей. Установлено, что полное ингибирование роста и развития клеток модельной тест-системы (лимфоцитов периферической крови) происходит при облучении их в дозе 5,0 Гр.
Перед началом опытов по оценке радиозащитной эффективности потенциальных иммунопрепаратов, предварительно изучали их влияние на жизнеспособность культивируемых клеток, определяли оптимальные концентрации глобулинов, оказывающие угнетающее действие на метаболизм клеток в условиях совместного культивирования. Для этой цели интактные лимфоциты инкубировали в присутствии различных концентраций (от 0,005 до 0,05 мг/мл или от от 5 мкг/мл до 50 тыс. мкг/мл по белку) иммуноглобулинов в течение 4, 24 и 28 ч. Оценку влияния культивируемых препаратов проводили методом окрашивания флоуресцирующим красителем - эритрозином и подсчета окрашенных (нежизнеспособных) и неокрашенных (живых) клеток.
Результат флоуресцентной цитометрии показал, что внесение в инкубационную среду испытуемых препаратов в концентрации от 5 мкг до 25 тыс. мкг/мл (от 0,005 до 0,025 мг/мл) токсического влияния на лимфоциты не оказывало - увеличения количества окрашенных (нежизнеспособных клеток) по сравнению с контролем не выявлено. С учетом полученных данных, концентрация вносимых в инкубационные среды испытуемых препаратов, в зависимости от источника получения (сывороточный или тканевой глобулин), составляет от 0,01 до 0,02 мг/мл.
Для проведения скрининговых исследований, в первой серии опытов данного этапа работы изучали радиозащитные свойства 37 потенциальных, перечисленных в таблице 1 иммунопротекторов. При этом, в инкубационные среды с облучением в дозе 5,0 Гр лимфоцитов с титром 5-6105 клеток /мл вносили испытуемые препараты в количестве от 0,01 до 0,02 мг/мл, затем инкубировали в течение 4, 24 и 48 часов. По истечению указанной экспозиции готовили мазки лимфоцитов с последующим окрашиванием и фотометрированием, определяли количество живых и мертвых клеток в опыте и контроле.
Изучение сорбционной активности отобранных препаратов в отношении к цезию -в in vitro тест системе
Для исследования сорбционной способности в отношении цезия-137 были использованы отобранные в предыдущем этапе работы потенциальные сорбенты растительного (люцерна, травяная, хвойная мука, препараты «Эра-Н», «Эраконд», березовый гриб – чага), животного (кровяная мука, хитозан из крабовых), аписогенного (продукты пчеловодства: прополис, перга, обножка, пчелиный расплод, маточное молочко, восковая моль, пчелиный подмор, композиция, включающая продукты пчеловодства – «Вита Форце»), микробного (порошки B.subtilis, B.bifidum) и минерального (ферроцин, бентонит), а в качестве контрольных регламентированных сорбентов использовали препараты «Бифеж» и «ХЖ-90». Из перечисленных потенциальных сорбентов готовили навески в количествах, рекомендованных для их оценки в условиях in vitro – от 0,1 до 1,0 г.
Работу проводили в соответствии с методикой, описанной в статье W.Giese (Countermeasures for reducing the transfer of radiocesium to animal derived foods // The Science of the Total Environment. 85 (1989).- Р.317-327.). Для этого навеску сорбентов согласно таблице 4 заливали 25 мл водного раствора 137Cs, встряхивали в течении 1 ч и оставляли при комнатной температуре на 12-16 ч. Затем раствор фильтровали через бумажный фильтр, осадок промывали дистиллированной водой и проводили на гамма-спектрометре «Компьюгамма» радиометрию объединенных растворов фильтрата и промывных вод.
Из представленных в таблице данных видно, что из испытанных 22 потенциальных сорбентов наиболее высокой сорбционной активностью обладает очищенная высокодисперсная фракция бентонита ОФБ (№20), препарат «Вита-Форце» (№16), пчелиный подмор (№12), хитозан из пчелиного подмора (апизан) (№9), порошок чаги (№6), порошок препаратов «Эра-Н» (№4), порошок люцерны (№1), хвойная мука (№3) и хитозан из крабовых(№8). 22 Препарат «ХЖ-90»(контроль III) 6,16 1,65 73,25 ± 0, Перечисленные прапараты по цезийсвязывающей активности образовывали следующий убывающий ряд: бентонит очищенный (77,0 %) бентонит нативный (67,01 %) препарат «Вита Форце (8,85 %) пчелиный подмор (8,11 %) хитозан из пчел (7,25 %) порошок чаги (6,79 %) порошок люцерны (6,71 %) порошок препарата «Эра-Н» (6,01 %) хвойная мука (5,93 %). Учитывая, что композиционные сорбенты обладают более высокой активностью и полифункциональными свойствами, результаты проведенных в данной серии опытов были использованы на определение возможности усиления сорбционной активности отдельных сорбентов при сочетании их друг с другом. При этом учитывали, что наиболее доступным сорбентом является природный минерал – бентонит, мы изучали возможность усиления сорбционной активности при сочетании его с препаратами растительного (порошок люцерны, порошок препарата «Эра-Н», хвойная мука, порошок чаги) и аписогенного (пчелиный подмор, хитозан из пчел – апизан, препарат «Вита-Форце») происхождения.
Таким образом, сочетание апифитопрепарата «Вита-Форце» с природным сорбентом приводит к значительному усилению сорбционной способности бентонита, достигая уровня регламентированного цезийсвязывающего сорбента «Бифеж», состоящего из древесных опилок и цианидсодержащего препарата – ферроцин. Полученные данные дают основание считать, что сочетание хитозансодержащего препарата «Вита-Форце» с природным сорбентом – бентонитом, позволяют существенно повысить цезийсвязывающую способность бентонита, которая по этому показателю не уступает композиционному ферроцинсодержащему регламентированному сорбенту – «Бифеж» и значительно превосходит таковую препарата «ХЖ-90».
Композиционный сорбент на основе апифитопрепарата «Вита-Форце» и природного минерального сорбента – бентонита, не уступая по цезийсвязывающей активности реламентированному ферроцинсодержащему сорбенту «Бифеж» и превосходя по этому показателю другого регламентированного ферроцин-бентонитосодержащего сорбента «ХЖ-90», однако по составу выгодно отличается от них по содержанию в сорбенте биологически активной натуральной кормовой добавки на основе вещества растительного (травяная, хвойная мука) и аписогенного (прополис, мед, пчелиный яд, маточное молочко, перга, обножка, пчелиный подмор, пчелиный расплод, воск, восковая моль) происхождения, обладающим широким спектром биологического действия (адаптогенное, иммуностимулирующее, иммуномодулирующее, антитоксическое, антиоксидантное, метаболизм-стимулирующее, радиозащитное), отсутствующее у известных регламентированных сорбентов («Бифеж» и «ХЖ-90»). Сказанное явилось основанием для использования композиции «Вита-Форце»+бентонит (ВФ+Б) в качестве сорбента для выведения цезия – 137 и включения его в состав потенциального лечебно-декорпорирующего средства.
