Введение к работе
Актуальность исследования
Настоящее исследование направлено на решение двух актуальных проблем радиобиологии – изыскание новых противолучевых средств на основе изучения роли эндогенного оксида азота и модификаторов его синтеза в радиобиологических процессах, развивающихся в организме млекопитающих при воздействии ионизирующей радиации, и проблемы особенностей структуры химических веществ со свойствами ингибиторов синтеза оксида азота в проявлении ими противолучевых и иных физиологических свойств, обеспечивающих предотвращение формирования у млекопитающих некоторых форм патологии (различные по генезу формы шока, комбинированное радиационно-термическое поражение).
Более 60 лет прошло со времени открытия Патом с сотрудниками эффекта защиты животных от действия ионизирующей радиации химическим агентом – цистеином [Patt H.M. et al., 1949]. Открытие возможности увеличения радиоустойчивости биологических объектов с помощью химических соединений стимулировало во всем мире большое число исследований, направленных на отыскание наиболее эффективных радиозащитных средств. Помимо прямой защиты от летального воздействия высоких доз радиации при ядерных инцидентах, это и другие соединения могли бы найти применение для сохранения важных функций организма у людей, занятых в таких областях человеческой деятельности как космические полеты, горнодобывающая промышленность, химические и энергетические радиационные производства, ядерная медицина, лучевая противоопухолевая терапия. В последнем случае, так как этой процедуре подвергается примерно половина заболевших, по-прежнему актуальной остается проблема защиты нормальных тканей, лежащих рядом с опухолью, из-за невозможности избежать их облучения. Таким образом, проблема создания эффективных радиопротекторов по-прежнему остается актуальной [Владимиров В.Г. и соавт., 1989; Maisin J.R., 1998; Lindegaard J.C., Grau C., 2000; Flynn D.F., Goans RE., 2006; Greenberger J.S., 2009].
Хотя в радиобиологии оксид азота (NO) известен уже более 50 лет как гипоксический радиосенсибилизатор [Howard-Flanders, 1957], его признание как важнейшего биомедиатора в сердечно-сосудистой, нервной, иммунной и других системах организма позволило открыть новые направления в исследованиях механизмов радиобиологических реакций и создало основу для разработки эффективных подходов к модификации радиочувствительности и радиотерапии злокачественных новообразований [Ванин А.Ф., 1997; Недоспасов А.А., 1999; Проскуряков С.Я. и соавт., 2000; Проскуряков С.Я. и соавт., 2001].
Первые радиобиологические исследования NO, которые были проведены на бактериальной культуре, показали, что эта газообразная субстанция, как экзогенный агент, обладает радиосенсибилизирующим действием [Howard-Flanders P., 1957]. Последующие эксперименты на культурах клеток млекопитающих и на животных подтвердили радиомодифицирующие свойства этой молекулы, а именно, радиочувствительность исследуемого объекта зависела от содержания NO в клетке или организме, которое можно было увеличивать либо с помощью введения доноров NO, или уменьшать применением ингибиторов его синтеза [Mitchell J.B. et al., 1993; Liebmann J. et al., 1994].
Изучение источников литературы показало, что ряд субстанций, относящихся к различным группам высокоэффективных радиопротекторов, таких как меркаптоэтилгуанидин, этилизотиомочевина и другие, ингибируют in vitro активность фермента, синтезирующего NO (NO-синтаза, NOS) [Проскуряков С.Я. и соавт., 2003; Southan, G.J., Szabo S.C., 1996]. Существенной особенностью подобных веществ было наличие в их молекуле структурного фрагмента, подобного (изостеричного) гуанидиновой группе L-аргинина, субстрата NOS (фермента, синтезирующего оксид азота), поскольку именно эта часть L-аргинина связывается с каталитическим центром NOS и является источником NO [см. обзор: Проскуряков С.Я. и соавт., 2005а]. Этот анализ и явился одной из причин развития наших исследований взаимосвязи химической структуры, NOS-ингибирующей активности, радиомодифицирующего и физиологического действия соединений одного из малоизученных классов, а именно, относящихся к производным изотиомочевины (R1–NH–C(SR2)=NH).
Опубликованные данные о NO-ингибирующей активности как синтезированных, так и естественных субстанций, главным образом, опирались на результаты опытов в пробирке с изолированным (выделенным с той или иной степенью очистки) ферментом, синтезирующим NO – синтазой оксида азота (NOS). В незначительной части экспериментов оценка ингибирующей активности проводилась косвенным образом на основе измерения содержания метаболитов NO (NO2– и NO3–), либо в среде культивации определенной линии клеток, либо в сыворотке экспериментальных животных [Проскуряков С.Я. и соавт., 2005а; Salerno L. et al., 2002]. При этом в ряде случаев активные in vitro субстанции были неактивны в целостном организме экспериментальных животных или слишком токсичны, что существенно осложняло интерпретацию закономерностей активность-структура с целью дизайна и синтеза более эффективных веществ. Для преодоления этих недостатков при оценке NO-ингибирующей активности синтезированных веществ нами был модифицирован и использован метод ЭПР-спектроскопии спиновой ловушки, развитый А.Ф. Ваниным и позволяющий проводить прямые измерения содержания NO в тканях организма ex vivo [Ванин А.Ф. и соавт., 1984; Коноплянников А.Г. и соавт., 1999].
Таким образом, учитывая, что NO проявляет многочисленные физиологические и биохимические свойства (фактор релаксации сосудов, антипатогенный эффектор, модулятор ангиогенеза, активатор стволовых клеток, нейтрансмиттер, регулятор редокс-гомеостаза и митохондриальной активности, танатогенный медиатор и др.) в настоящей работе нами были предприняты исследования в области решения двух актуальных проблем радиобиологии: 1) проблемы изыскания новых противолучевых средств на основе изучения роли эндогенного NO и ингибиторов его синтеза в радиобиологических процессах, развивающихся в организме млекопитающих при воздействии ионизирующей радиации, и 2) проблемы особенностей химической структуры веществ со свойствами ингибиторов синтеза NO в проявлении ими противолучевых и иных физиологических свойств, обеспечивающих предотвращение формирования у млекопитающих некоторых форм патологии (комбинированные радиационно-термические поражения, различные по генезу формы шока).
Цель и задачи исследования
Цель настоящего исследования состояла в исследовании радиобиологического и физиологического действия низкомолекулярных ингибиторов синтеза оксида азота (NO) из химического класса производных изотиомочевины.
В рамках указанной цели решались следующие основные задачи:
-
Модифицировать метод ЭПР-спектроскопии спиновой ловушки для оценки активности химических ингибиторов продукции биогенного NO in vivo.
-
Исследовать способность ряда известных радиопротекторов к ингибированию синтеза NO in vivo и выявить связь между этой активностью и их химической структурой.
-
Оценить способность к ингибированию синтеза NO ряда новых субстанций, содержащих тиоамидиновый фрагмент.
-
Выявить гипертензивную активность ингибиторов синтеза NO.
-
Исследовать действие ряда производных изотиомочевины на восстановление численности клоногенных клеток гемопоэза и кишечного эпителия у облученных животных.
-
Исследовать роль NO и модификаторов его синтеза и обмена в модели комбинированного радиационно-термического поражения.
-
На основе анализа данных о связи ингибирующая активность – структура предложить соединения с новой химической структурой в качестве ингибиторов синтеза и обмена NO и провести изучение синтезированных на этих принципах субстанций, как радиопротекторных, вазотропных и антишоковых средств.
Научная новизна исследования
Впервые исследована способность ряда известных радиопротекторов, в том числе производных изотиомочевины, к ингибированию продукции биогенного оксида азота в целостном организме экспериментальных животных и выявлены закономерности, связывающие их химическую структуру и биохимическую активность.
Получены приоритетные данные о способности ряда новых соединений - производных изотиомочевины, отличающихся наличием тиоамидиновой группы в линейной или циклической форме, ингибировать синтез NO в тканях животных.
Для некоторых ингибиторов синтеза NO исследована гипертензивная активность в моделях септического и гиповолемического шока и получены патенты на изобретение новых биологически активных субстанций.
Оригинальные производные изотиомочевины, синтезированные на основе анализа структура-активность, проявили существенную радиозащитную активность в отношении восстановления численности клоногенных клеток гемопоэза и кишечного эпителия у облученных животных.
Подтверждены предположения о возможности существенного снижения летальных последствий комбинированного радиационно-термического поражения с помощью ингибиторов и модификаторов продукции биогенного NO.
Новизна полученных результатов подтверждена двумя патентами РФ.
Теоретическое значение работы
1) Получены данные о соотношении структура-активность в ряду производных изотиомочевины, ингибиторов синтеза NO в тканях целостного организма, что позволяет делать рациональное предсказание новых структур потенциальных биологически активных субстанций.
2) На основе собственных результатов и данных литературы обосновано новое направление в поиске и создании радиопротективных средств как для защиты целостного организма, так и радиочувствительных систем – костного мозга и кишечного эпителия.
Практическое значение работы
В ходе выполнения данного исследования были созданы новые вещества, обладающие свойствами, перспективными для их применения в качестве препаратов, защищающих нормальные ткани при проведении лучевой терапии онкологических заболеваний, ослабления патологических последствий комбинированного радиационно-термического поражения, а также шоковых состояний различного генеза.
Положения выносимые на защиту
-
Модифицированный метод ЭПР-спектроскопии спиновой ловушки адекватно определяет влияние производных изотиомочевины на продукцию оксида азота in vivo.
-
Соединения из класса производных изотиомочевины, обладающие радиопротекторными свойствами, являются ингибиторами синтеза биогенного оксида азота.
-
Найдены особенности химической структуры производных изотиомочевины, позволяющие создавать новые вещества с прогнозируемыми биологическими свойствами.
-
Производные изотиомочевины, синтезированные на основе дизайна их структуры, как ингибиторов продукции оксида азота in vivo, обладают радиопротективным и гипертензивным действием.
Апробация работы
Основные результаты работы представлены на следующих научных конференциях:
-
Международная конференция «Энергетика-3000» (Обнинск, 1998 г.);
-
Конфер. «Свободные радикалы и болезни человека» (Смоленск, 1999 г.);
-
Международная конференция «Проблемы биологической и экологической безопасности» (Оболенск, 2000 г.);
-
International Conference on Bacterial and Viral Virulence Factors (Smolenice, Slovakia, 2000 г.);
-
Национальная научно-практическая конференция с международным участием «Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека» (Смоленск, 2001 г.);
-
IX Российский национальный конгресс «Человек и Лекарство» (Москва, 2002 г.);
-
Национальная научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2003 г.);
-
Вторая международная конференция «Кислород- и серу-содержащие гетероциклы» (Москва, 2003 г.);
-
Конференция «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2005 г.);
-
Международная конференция по химии гетероциклических соединений,
посвященная 90-летию со дня рождения профессора А.Н. Коста
(Москва, 2005 г.); -
VII Международная конференция «Биоантиоксидант» (Москва, 2006 г.);
-
Конференция «Фундаментальная наука – Центральной России» (Тамбов, 2007 г.).
Диссертация апробирована на научной конференции Экспериментального радиологического сектора Учреждения Российской академии медицинских наук «Медицинский радиологический научный центр РАМН» 20 января 2010 года (протокол «№ 251).
Публикации По результатам диссертационной работы опубликовано 51 научная работа, из них 23 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК МОиН РФ.
Личный вклад автора
Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследований, проведении большинства экспериментов, анализе и обобщении полученных данных. В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач и их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 196 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, их обсуждения и выводов. Список литературы содержит 337 источников. Диссертация иллюстрирована 30 таблицами и 19 рисунками.
