Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Методологические аспекты моделирования биологических явлений
1.1. Моделирование как метод научного познания 15
1.2. Специфика моделирования в биологии 22
1.3. Математическое моделирование в молекулярной генетике 28
1.4. Теория эволюции и кибернетика 33
1.5. Математические методы в теоретической биологии и опыт теоретической физики
1.6. Заключение 47
Глава 2. Моделирование конъюгации бактерий 49
2.1. Основные этапы конъюгации и их количественные 49
закономерности
2.2. Образование кроссовых агрегатов 55
2.3. Кинетика переноса хромосомы 59
2.4. Моделирование рекомбинации
2.5. Действие физических и химических факторов на рекомбинацию
2.6. Роль систем рестрикции-модификации в образовании градиента передачи
2.7. Заключение 90
Глава 3. Действие электромагнитных полей на насекомых: физическая модель, физиологические эффекты, генетические последствия
3.1. Генетические и физиологические эффекты электромагнитных полей
3.2. Экспериментальные основы, для построения модели физиологических эффектов СНЧ на насекомых
3.3. Физическая модель 98
3.4. Эффекты сверхнизкочастотного электрического поля 103
3.5. Заключение 107
Глава 4. Формальные статистические модели. применение ЭВМ
4.1. Биометрия, планирование эксперимента и полиномиальные модели
4.2. Вычисление параметров аппроксимирующего полинома 113
4.3. Принцип попадания и пост-чернобыльские генетические эффекты
4.4. Биометрические модели в генетике и их реализация на ЭВМ 120
4.5. Заключение 128
Глава 5. Теоретико-информационные принципы в анализе радиационно-генетических процессов
5.1. Статистический подход и эколого-генетические данные 130
5.2. Теоретико-информационная мера оценки неопределенности 132
5.3. Теоретико-информационные основы моделирования 135
генетических и радиобиологических процессов на ЭВМ
5.4. Создание программного обеспечения для ИЛоП 138
5.5. Апробация ИЛоП 140
5.6. Применение теории информации в генетике и радиобиологии и перспективы дальнейшего развития ИЛоП
5.7. Заключение 150
Заключение 151
Выводы 157
Список литературы
- Математическое моделирование в молекулярной генетике
- Роль систем рестрикции-модификации в образовании градиента передачи
- Экспериментальные основы, для построения модели физиологических эффектов СНЧ на насекомых
- Принцип попадания и пост-чернобыльские генетические эффекты
Введение к работе
Актуальность темы. Радиобиология и генетика являются наиболее математизированными отраслями современной биологии, широко использующими математическое моделирование в теоретических исследованиях и прикладных разработках на молекулярном, организменном, популяционном и экоценотическом уровнях.
В то же время до сих пор не решен ряд существенных вопросов теоретического и методологического характера, в том числе при моделировании генетических эффектов ионизирующей радиации на микроорганизмах, эколого-генетических эффектов малых доз хронического облучения (послечернобыльская ситуация) и т.д..
Так, математическая теория генетического картирования, заложенная работами Н.Бейли (Bailey, 1961), далеко не всегда может использоваться для моделирования рекомбинации у бактерий, поскольку не способна учесть наблюдаемые радиационные эффекты. Более поздние по времени модели имеют скорее эскизный характер и также не выполняют своего прогностического предназначения
В литературе отсутствует математическое описание конъюгации бактерий, хотя давно имеется как тщательная экспериментальная проработка ее закономерностей (Жакоб, Вольман, 1962; Хэйс, 1965), так и описание модификации отдельных стадий этого процесса под влиянием радиации (Троицкий и др., 1978). Между тем сопоставление ряда экспериментальных фактов, касающихся отдельных стадий конъюгации и полученных разными экспериментальными методами, приводит к противоречиям (оценка количества перенесенной донорской ДНК с помощью радиоактивной метки и методами генетического анализа и т.п.). Разрешить эти противоречия возможно только на пути теоретического анализа и математического моделирования.
Имеются также существенные пробелы в разработке методов моделирования генетических и физиологических эффектов физических факторов (электромагнитные излучения, ионизирующая радиация). Существующие модели являются в значительной степени формально-феноменологическими и базируются в первую очередь на принципе попадания (Тимофеев-Ресовский, Иванов, Корогодин, 1968), который вряд ли применим для анализа низкочастотных электромагнитных воздействий.
Классическая генетика, как и радиобиология, опирается в основном на теорию вероятностей и математическую статистику (Рокицкий, 1978; Тимофеев-Ресовский, Яблоков, Глотов, 1973; Хуг, Келлерер, 1969). Между тем в ряде случаев возникает сомнение в самой возможности применения указанной методологии (Алимов, 1978; Андреев, 1987). Это имеет место, в частности, при анализе эколого-генетических или радиобиологических данных, когда приходится сталкиваться с принципиальной невоспроиэводимостью результатов, их резко выраженной нелинейностью или малым объемом выборки. В связи с этим встает проблема поиска адекватного математического аппарата, способного моделировать поведение изучаемых систем при таком характере исходных данных.
Наконец, нельзя забывать о прикладных аспектах всякого моделирования. Для того чтобы успешно пользоваться моделью, исследователь-радиобиолог или
генетик должен обладать глубоким знанием математического аппарата, что реализуется достаточно редко. В то же время логика научных исследований в сочетании с широким применением современной вычислительной техники выдвигают на первый план потребность в разработке таких методологических подходов, оборудования и математического обеспечения, которые позволили бы заниматься вопросами моделирования не только профессиональным математикам, но также и биологам, недостаточно владеющим математическими методами. В связи с этим встает задача разработки программного обеспечения для компьютерного моделирования генетических и радиобиологических (радиационно-генетических) процессов.
Связь работы с крупными научными программами, темами. Представленные в работе результаты получены в ходе выполнения плановых научно-исследовательских тем, в том числе: « Исследование повреждений хромосом малыми дозами ионизирующей
радиации (1971-1975 гг.), No ГР 71055086; і Изучение трансгеноза в бактерии (1976-1980 гг.), No ГР 76076292, « Создание экспериментальных баз данных и пакета прикладных программ для персональных ЭВМ по генетико-статистическим методам исследований (1991-1995 гг.) - Программа Приборостроение 2, тема 2.09. No ГР 019100112518 (СССР), 1995148 (РБ); Разработать и внедрить интегрированную среду информационно-логического подхода (ИЛоП) для моделирования радиоэкологических процессов (1994 г.) - Научный раздел Госпрограммы по ЧАЭС, No ГР 19942926. « Моделирование эколого-техногенного влияния на генетическую компоненту биологического разнообразия (1Э96-2000 гг.) - Программа Биологическое разнообразие, тема 38, No ГР 191)71268.
Цель и задачи исследования. Целью исследования была разработка методологии анализа и моделирования генетических эффектов радиации у срганизмов различных таксономических групп.
Исходя из сформулированной цели, были поставлены следующие задачи:
-
Проанализировать основные принципы и методы моделирования биологических процессов и выбрать среди них наиболее информативные и адекватные современным потребностям радиобиологии и генетики.
-
Разработать подходы к количественному описанию закономерностей конъюгации бактерий и ее модификации под действием ионизирующей радиации и химических факторов.
-
Исследовать возможность использования полиномиальных моделей для классификации радиационных эффектов.
-
Дать теоретическое описание радиационных (генетико-физиологических) эффектов низкочастотных электромагнитных полей у насекомых.
-
Разработать принципы компьютерного эксперимента, позволяющие заниматься построением математических моделей на персональных ЭВМ исследователям-радиобиологам и генетикам. Подготовить соответствующее программное обеспечение.
Научная новизна. Впервые получены следующие результаты, новизна которых подтверждается соответствующими публикациями:
Разработаны подходы к моделированию последовательных стадий полового процесса у бактерий и построена математическая модель, описывающая основные этапы конъюгации. Поставлены машинные эксперименты по конъюгационному переносу донорской ДНК.
Построена модель, позволяющая учитывать рекомбиногенные эффекты физических и химических факторов на бактериях, что важно для определения мутагенной активности физических факторов
Дано описание радиационных (физиологических) эффектов низкочастотного электрического поля на насекомых (Drosophila melanogaster), в рамках которого наблюдаемые эпигенетические эффекты объясняются стрессом от пребывания в поле.
« Разработаны теоретико-информационные подходы к количественной оценке эколого-генетических взаимодействий у организмов разного уровня сложности. Это позволяет анализировать нелинейные процессы в послечернобыльских условиях, а также при наличии малого количества уникальных.экспериментальных данных. Создано программное обеспечение для анализа таких процессов на ЭВМ.
Создан пакет прикладных программ для персональных ЭВМ,
позволяющий проводить статистический анализ экспериментальных данных
в генетике растений и радиационной генетике.
Теоретическое и практическое значение, реализация результатов исследования. Создана новая информационная технология моделирования биологических (радиобиологических и генетических) процессов, заключающаяся в сочетании принципа аналогии с индуктивным построением моделей и широким привлечением новых, но еще не освоенных биологии математических методов и моделей. Эта технология стала тем инструментом, с помощью которого получены следующие результаты:
і Дано единое математическое описание основных этапов конъюгации бактерий. Эвристическая ценность этой модели заключается в том, что она позволяет подойти к анализу молекулярных механизмов переноса и интеграции донорской хромосомы и их модификации под действием радиации.
Построена новая модель, которая описывает насекомое как систему взаимосвязанных конденсаторов, взаимодействующих с внешним электрическим полем. Указанный подход позволил впервые объяснить ряд радиобиологических эффектов низкочастотного электрического поля на насекомых (Drosophila melanogaster) и подойти к пониманию наблюдаемых эпигенетических эффектов.
На основе проведенных исследований создан и запатентован новый способ определения мутагенной активности физических факторов, использующий микроорганизмы в качестве тест-системы для анализа рекомбиногенных эффектов ионизирующей радиации (ас. 70188).
Создано математическое обеспечение для статистической обработки данных и компьютерного моделирования генетических и радиобиологических процессов, в котором сочетаются стандартные биометрико-статистические методы и методы математико-генетического анализа.
Способ определения мутагенной активности физических факторов внедрен в НИИ медицинской радиологии АМН СССР (Обнинск).
Разработанный пакет прикладных генетико-статистических программ в целом и отдельные программы используются в научных исследованиях и учебном процессе в Институте генетики и цитологии НАН Беларуси, Белорусском НИИ плодоводства, Белорусской зональной опытной станции по птицеводству, Гомельском государственном университете, Белорусской сельскохозяйственной академии, в ряде других учреждений.
Результаты исследований вошли в монографию "Конъюгация бактерий", включенную в список литературы, рекомендованной для дополнительной программы кандидатского экзамена по специальности 03.00.15 - генетика в Институте генетики и цитологии НАН Беларуси.
Положения, выносимые на защиту.
-
Применение принципа аналогии в сочетании с индуктивным построением моделей от простых к сложным и привлечением новых или еще мало используемых в биологии математических методов и моделей является наиболее перспективным для теоретического описания биологических (генетических и радиобиологических) процессов.
-
Основные закономерности образования кроссовых агрегатов, переноса хромосомы и рекомбинации в зиготе можно описать единой математической моделью конъюгации бактерий. Модель дает возможность оценить рекомбиногенную активность ионизирующей радиации.
-
Радиационные эффекты низкочастотного электрического поля на насекомых объясняются концентрацией на хитиновом экзоскелете электрического заряда, модифицирующего поведение отдельной особи и их группы. Модель пригодна для изучения роли стресса в развитии эпигенетических процессов.
-
Созданы оригинальные пакет прикладных генетико-статистических программ для обработки на персональных ЭВМ данных по генетике растений и радиационной генетике и система управления вводом и хранением экспериментальных данных.
5. Применение методов теории информации и математической логики
позволяет анализировать нелинейные генетические и эколого-генетические
процессы при наличии ограниченного числа данных, в том числе при
хроническом облучении в малых дозах.
Личный вклад соискателя. Лично С.Е.Дромашко созданы все математические модели и проведены компьютерные эксперименты по определению параметров этих моделей. Им обоснована возможная роль систем рестрикции-модификации в образовании градиента рекомбинантов, спланированы и проведены соответствующие эксперименты.
Соискатель разработал структуру и логическую схему пакета прикладных генетико-статистических программ и системы ввода и хранения экспериментальных данных. Им лично написан ряд программ.
С.Е.Дромашко обоснована возможность применения информационно-логического анализа в генетических исследованиях, проведена адаптация метода для послечернобыльских условий.
В выполнении исследований принимали участие под руководством автора мл. научн. сотр. Я С.Вельская и В.С.Василевский, инженер 1 категории Г.И.Френкель, инженеры 2 категории Б.О.Дубовской, О.Н.Громыко и
О М.Пятковская, инженер Е.М.Клевченя. Всем им автор выражает искреннюю признательность и благодарность.
Апробация. Основные положения работы в 1975-1999 гг. были представлены на ряде международных, всесоюзных и республиканских конференций и совещаний, в том числе:
-
Конференция "Пути повышения продуктивности животных и растений" (Рига, 1975).
-
Всесоюзная конференция "Использование нейтронов в медицине" (Обнинск, 1976).
-
III-VII съезды БелОГиС (Горки, 1976; Минск, 1981; Горки, 1986, 1992, 1997)
-
Ill и VI съезды ВОГиС (Москва, 1977; Минск, 1992).
-
XIV Международный генетический конгресс (Москва, 1978).
-
И-я радиобиологическая конференция социалистических стран (Варна, Болгария, 1978).
-
IV и V Всесоюзные симпозиумы "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1979, 1983).
-
Конференция "Чувствительность организмов к мутагенным факторам и возникновение мутаций" (Вильнюс, 1980).
-
Всесоюзная конференция "Механизмы радиационного поражения и восстановления нуклеиновых кислот" (Пущино-на-Оке, 1980)
10.1 Всесоюзный биофизический съезд (Москва, 1982).
11 Всесоюзная школа молодых ученых "Вычислительные методы и
математическое моделирование" (Минск, 1984). 12. Всесоюзный симпозиум по ориентации членистоногих и клещей (Томск, 1988). 13 I Всесоюзная конференция с международным участием "Механизм действия
магнитных и электромагнитных полей на биологические системы различных
уровней организации" (Ростов-на-Дону, 1989). 14. Международная научно-практическая конференция "Проблемы сохранения
биологического разнообразия Беларуси" (Минск, 1993). 15.1 съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994).
-
IV Международная конференция "Чернобыльская катастрофа: прогноз, профилактика, лечение и медикопсихологическая реабилитация пострадавших" (Минск, 1995).
-
Международное рабочее совещание ЧЭИС "Экологический статус загрязненных радионуклидами территорий в результате Чернобыльской катастрофы" (Минск, 1995).
-
Республиканская конференция "Современные проблемы генетики и селекции" (Минск, 1995).
19.2-й и 3-й съезды Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 1996; 1998).
-
International Conference on Radiation and Health (Beer Sheva, Israel, 1996).
-
VII Белорусская математическая конференция (Минск, 1996).
-
IFAC/IFIP Conference on Management and Control of Production and Logistics (Campinas, Brazil, 1997).
23.SSIT98 - International Conference on Systems and Signals in Intelligent
Technologies (Minsk, 1998). 24.98'ISSST - 98' International Symposium on Safety Science and Technology (Beijing,
China, 1998).
25.2-я Международная конференция "Проблемы электромагнитной безопасности человека. Фундаментальные и прикладные исследования. Нормирование ЭМП: философия, критерии и гармонизация" (Москва, 1999).
26.CAS-99 - 2nd International Scientific Conference "Computer Algebra in Fundamental and Applied Research and Education" (Minsk, 1999). Публикация материалов. Основные положения диссертации изложены в 89
публикациях, в т.ч. 2 монографиях, 2 книгах, 1 брошюре, 1 изобретении, 45
статьях, 38 тезисах докладов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, общей
Математическое моделирование в молекулярной генетике
Мысленный эксперимент представляет собой такое воображаемое сочетание условий, которое может не наблюдаться или быть практически неосуществимым. Поэтому все типичные для такого умственного эксперимента способы рассуждений должны проводиться в рамках объективно возможного, и необходимо изгнание всяческих допущений или посылок, находящихся в противоречии с объективными законами действительности. Крупнейшие теоретики естествознания, широко применяя в своей научной деятельности метод умственного моделирования, всегда строго учитывали это положение. Примером тому может служить А.Эйнштейн, любивший использовать мысленные модели для иллюстрации своих теоретических положений (Эйнштейн, 1967).
Характерной особенностью мысленного эксперимента является то обстоятельство, что в нем часто стирается различие между "внешними условиями" и "приборами", которые в конечном итоге сводятся к первым. Достигнутые этим упрощения делают структуру мысленного эксперимента такой, что она мало отличается от самой модели, т.е. в пределе понятия мысленного эксперимента и мысленной модели совпадают.
Особенно плодотворно мысленное экспериментирование применяется с середины XX века в биологии в связи с развитием и широким внедрением ЭВМ и математических методов исследования. Распространение этого вида эксперимента при изучении живых организмов, особенно в форме машинного эксперимента, может быть объяснено их чрезвычайной сложностью, что приводит к необходимости теоретического исследования. Естественно, как и в любом другом виде мысленного эксперимента, в данном случае имеет место идеализация как самих изучаемых объектов, так и условий, в которых они находятся.
Специфика моделирования в биологии Модельные объекты и системы. Сложность явления жизни проявляется в переплетении различных уровней организации живых объектов, что приводит к определенной специфичности при моделировании биологических явлений. Как и в других отраслях естествознания, в биологии в основе моделирования лежит представление о замещении какой-либо сложной системы более простой и доступной для изучения. Часто с этой целью в качестве упрощенных материальных моделей достаточно развитых явлений используются низшие формы живых организмов (например, дрозофила, кишечная палочка и др.). Как показал Н.И.Вавилов, открытию сцепления генов наряду с коротким жизненным циклом дрозофилы содействовало наличие у нее по сравнению с более развитыми организмами небольшого количества хромосом (Вавилов, 1965). Успехам молекулярной биологии во многом способствовал удачный выбор объекта исследований (бактерий и вирусов). В практику биохимии вошло изучение отдельных биохимических реакций, воспроизводимых в культуре клеток ткани in vitro. Эти и многие другие примеры дают представление о биологическом аналоге материальной, физической модели.
В современном биологическом модельном эксперименте широко применяются физические и кибернетические методы. Это дало возможность использовать в исследовательских целях специальные конструкции, воспроизводящие отдельные функции живого организма на чуждой ему вещественной основе. В частности, некоторые саморегулирующиеся кибернетические устройства с обратной связью могут служить моделью для процесса взаимодействия организма с окружающей средой (Фролов, 1961; Lem, 1984). Другим прикером использования чуждого живой материи субстрата для моделирования поведения системы может служить применение методов трехмерной голографии, которая позволяет описать многие явления, характерные для памяти человека и даже для его психики в целом (Уваров, 1972).
Однако далеко не всегда модель биологического объекта должна быть очень сложной. Иногда важные результаты можно получить с помощью достаточно простых приспособлений, как это было с механической моделью-макетом ДНК, которая помогла Дж.Уотсону и Ф.Крику расшифровать структуру и функции этой молекулы (Уотсон, 1969).
Математизация биологии. В биологии все шире используются математические модели, базирующиеся на достижениях математики и кибернетики. При этом возникают новые направления научных исследований, такие как синергетика (Хакен, 1985), биологическая кинетика (Рубин, Пытьева, Ризниченко, 1987), математическая популяционная генетика (Свирежев, Пасеков, 1982), компьютерная биометрия (Барабашева и др., 1990) и др. В этом смысле показательна ситуация в математической генетике, которую вполне можно рассматривать, по аналогии с физикой, в качестве примера удачно развившейся теоретической дисциплины. Здесь широко используется аппарат классической математики и математической кибернетики, на основе которых строятся содержательные генетические теории (Ратнер, 1993). Наблюдается и обратное движение - от биологии к математике, где благодаря взаимопроникновению математических и генетических идей появился такой прикладной раздел как эволюционные вычисления и генетические алгоритмы (Букатова, 1996). Однако вопрос о перспективах дальнейшей математизации биологии остается по-прежнему дискуссионным, причем существенного продвижения в их понимании по сравнению с 50-60-ми годами не произошло. Как и раньше, преобладают две точки зрения. Согласно одной из них, "на путях математизации биологических наук речь должна идти не о каком то приживлении или подсадке математики к биологии извне (именно такие попытки делались и, несомненно, еще будут делаться и впредь), а о выращивании новых, биологических глав математики изнутри, из самого существа тех вопросов, которые ставятся перед науками о жизнедеятельности. Оснащенные (может быть, уже в недалеком будущем) настоящим, адекватным математическим аппаратом, биология и биокибернетика сольются тогда, как думается, в синтетическую науку, которая станет для них новой и высшей ступенью" (Бернштейн, 1965). Другая точка зрения сводится к тому, что математическая наука достаточно развита, и ее аппарат можно с успехом применять в биологических исследованиях в том виде, какой он принял в настоящее время. Поэтому, как считает Н.Рашевский (1968), следует ограничиться поисками общих утверждений, которые сумели бы объединить собой самые различные математические представления жизненных процессов.
Разнообразие биологических объектов и явлений привело к тому, что для их количественного описания с самого начала привлекались представления различных математических дисциплин (Моровиц, 1968). При этом в зависимости от характера и свойств изучаемых процессов для моделирования выбирается аппарат либо дискретной, либо непрерывной математики. На Рис. 1.2, взятом из книги (Глушков и др., 1982) и несколько модифицированном нами, представлены основные математические методы, используемые при моделировании биологических систем.
Методы дискретной математики оказались наиболее удобным и естественным средством для моделирования свойств уникальных объектов, количественные характеристики которых меняются скачкообразно, без промежуточных стадий (Дромашко, Романовский, 1984).
Традиционными дисциплинами, используемыми в этом случае, являются теория вероятностей и алгебра. Так, для описания возрастной структуры популяций применяется матричное исчисление (так называемые матрицы Лесли). Методы факторного и регрессионного анализа используются для аппроксимации экспериментальных результатов в различных областях биологии. На теоретико-вероятностном подходе покоится все здание классической генетики (Мендель, 1965; Рокицкий, 1978). В последнее время для описания самых разнообразных классов биологических закономерностей все шире применяются более молодые отрасли математики, в частности, теория конечных автоматов (Kauffman, 1969; Moulin, 1992; Huberman, Glance, 1993 и др.), теория фракталов (Borovk, Frankkamenetskii, Grosberg, 1994; Nettleton, Gariglano, 1994; Ragazzi, 1995).
Роль систем рестрикции-модификации в образовании градиента передачи
Поскольку синапсис полового фактора может осуществляться с любой из двух нитей хромосомной ДНК, этот ген может включаться в ориентации как "по часовой стрелке" так и "против часовой стрелки". Это определяет порядок и направление переноса хромосомных генов при конъюгации (Jacob, Wollman, 1957).
Для объяснения механизма переноса ДНК при конъюгации Ф.Жакоб, С.Бреннер и Ф.Кузен выдвинули гипотезу о том, что перенос вызывается и сопровождается репликацией ДНК в донорской клетке (Jacob, Brenner, 1963; Jacob, Brenner, Cuzin, 1963). В настоящее время установлено, что при конъюгации переносится одна нить донорской ДНК, а комплементарная ей синтезируется в клетке реципиента (Gross, Саго, 1966; Ohki, Tomizawa, 1968). В целом согласно модели репликона после никирования ДНК в сайте OriT F-плазмиды начинает конъюгационная репликация, причем в реципиекнтную клетку переносится 5 нить, ковалентно связанная с плазмидныи трансфер-специфичным белком Tral. Не существует принципиальных биохимических различий между преносом плазмиды (F) и плазмид-хромосомного ко-интеграта (Hfr), не считая их размера (Kornberg, Baker, 1992).
О кинетике переноса хромосомы судят по результатам опытов с прерыванием конъюгации (Жакоб, Вольман, 1962). В этом случае конъюгацию прерывают через определенные промежутки времени (либо путем механического встряхивания кроссовой смеси, либо добавления в нее культуры фага, лизирующего клетки донора) и подсчитывают число рекомбинантов по тому или иному хромосомному гену. Поскольку гены передаются в линейном порядке, по числу рекомбинантов можно судить о начале и скорости переноса хромосомы во всей скрещиваемой популяции.
В начале 1960-х гг., когда активно исследовался механизм последовательных стадий конъюгации, была разработана математическая модель Н.Саймондса (Symonds, 1962), построенная на основе экспериментальных данных (de Haan, Gross, 1962). Эта модель учитывала обнаруженный П.Г. де Хааном и Дж.Д.Гроссом эффект так называемого "выдергивания" переносимой хромосомы, наблюдавшийся при скрещивании в жидкой минимальной среде. Для количественного описания этого явления в модели (Symonds, 1962) были введены параметры b - вероятность того, что разделение конъюгирующих пар сопровождается выдергиванием хромосомы, и с - вероятность того, что при выдергивании хромосома разрывается и фрагмент ее остается в реципиентной клетке, а также р - дРоля пар, начинающих перенос в интервале времени X = 5 мин, в течение которого в указанных экспериментах допускалось образование кроссовых агрегатов. Поскольку по условиям проведения эксперимента число образованных (сохранившихся) пар N(t) со времени только уменьшалось со скоростью N(t) = N(0)EXP{-(b+c)t}, (2.2) Н.Саймондс пришел к системе дифференциальных уравнений, описывающей функции f(t,T) - число пар, в которых произошел перенос маркера Т, g(t,T) и h(ti,T) - число пар, в которых этот маркер включился в реципиентную хромосому. Две последние функции описывают разные способы прерывания скрещивания: g(t,T) характеризует опыты со встряхиванием на блендере, когда разрыв пары сопровождается разрывом хромосомы, a h(ti,T) описывает случай "убийства" донора с помощью фага Т6, когда перенос хромосомы прекращается, но остается определенная вероятность выдергивания хромосомы за счет спонтанного разделения пар.
Решения этих уравнений зависят от исследуемого интервала времени. Так, для f(t,T) справедлива формула [О, . t T f(t,T)= \ pN(0)(t)EXP{-(b+c)t}, Т t T+?i (2.3) lN(0)EXP{-(b+c)t), t T+X выражения для g(t,T) и h(ti,T) оказываются еще более громоздкими и с математической точки зрения не вполне корректными. Тем не менее модель достаточно хорошо описывает наблюдаемые в специфических условиях опытов П.Г. де Хаана и Дж.Д.Гросса закономерности. В то же время для объяснения отсутствия видимого эффекта "выдергивания" хромосомы в модели делается допущение о том, что величина с при скрещивании в бульоне много меньше, чем в минимальной среде. Это довольно смелое допущение, поскольку вряд ли механические свойства этих двух сред различаются столь сильно. Скорее речь может идти об их разном энергетическом качестве. Аналогичные эффекты позднее наблюдали Р.Кэртис и Л.Дж.Карамелла при голодании реципиента (Curtiss, Charamella, 1966).
Имеются данные, что в зависимости от условий постановки опыта в скрещивании как со стороны донора, так и со стороны реципиента могут участвовать два и более нуклеоидов, т.е. возможна конъюгация сразу между несколькими клетками (Curtiss, Charamella, 1966; Curtiss et al., 1968; Kunicki-Goldfinger, 1968). Эти эффекты также требуют своего количественного осмысления. Рекомбинация в зиготе. Последняя стадия конъюгации -рекомбинация. Для проксимальных генов она начинается еще во время переноса хромосомы. Чем дальше от начала хромосомы расположен данный ген, тем позже он попадает в реципиентную клетку и вступает в рекомбинацию. Поэтому кинетика переноса сказывается сильнее всего на дистальных маркерах (Жакоб, Вольман, 1962; Троицкий, Дромашко, Яковенко, 1978). Это обстоятельство требует соответствующей корректировки традиционных моделей рекомбинации, которые не учитывают молекулярные особенности этого процесса и базируются на классических представлениях о реципрокном кроссинговере (Bailey, 1961; Verhoef, de Haan, 1966; de Haan, Verhoef, 1966; Wu, 1967; de Haan et al., 1968 и др.).
Первая из моделей, сформулированная С.Верхофом и П.Г. де Хааном (Verhoef, de Haan, 1966), описывает случай определения частоты проксимальных неселективных маркеров в зависимости от расположения на хромосоме. Термин этот означает, что сначала проводят отбор по гену, лежащему достаточно далеко от начала хромосомы, а затем смотрят сцепленность с ним проксимальных генов, т.е. генов, лежащих ближе к началу хромосомы. В модели постулируется, что как в начале переданного фрагмента донорской хромосомы, так и в его дистальном конце за селективным маркером разрывы происходят обязательно, с вероятностью 1. Предполагается также существование дополнительных разрывов по длине переданного сегмента, распределенных по нему случайным образом в соответствии с законом Пуассона. Полученная при таких предположениях конечная формула этой модели имеет вид: F = а + (1 - а)ЕХР{-кДХ}, (2.4) где F - частота проксимальных неселективных маркеров; а-вероятность включения в рекомбинант всего фрагмента донорской хромосомы; к -частота разрывов на единицу длины хромосомы; АХ - расстояние между селективным и неселективным генами в минутах.
В соответствии с этим выражением F экспоненциально уменьшается с 1 до а при удалении от селективного гена, причем тем быстрее, чем больше к. Такая зависимость действительно наблюдается, но для маркеров, достаточно удаленных от начала хромосомы (Воронина, 1971; Миронов, Суходолец, Смирнов, 1972) или в случае слабой интеграции близких к началу хромосомы генов (Low, 1965; Glansdorff, 1967). Если же это условие не выполняется, то по мере приближения к локусу О происходит рост частоты рекомбинантов (Pittard, Walker, 1967; Торосян, Рабинкова, 1970), либо неэкспоненциальное падение ее до нуля (Суходолец, 1965). Более того, достичь F = 0, как показал Т.Т.Ву (Wu, 1967), можно только при а 0, что лишено физического смысла. Между тем, такую возможность нельзя исключать, если в каких-то условиях реализуется гипотеза В.В. Сухо дол ьца (1965) о летальном действии начала донорской хромосомы на образующиеся рекомбинанты, или если лежащий вблизи этого локуса ген используется в качестве контрселективного маркера.
Эти случаи описывает модель By (Wu, 1967), являющаяся развитием модели рекомбинации Холдейна (Haldane, 1919) для случая конъюгации бактерий. Здесь предполагается, что начало (локус О) передаваемой донорской хромосомы никогда не включается в рекомбинант. Кроме того, подразумевается, что на дистальном конце хромосомы за селективным маркером один кроссинговер происходит обязательно. Поэтому для восстановления замкнутой кольцевой структуры бактериальной хромосомы на ее проксимальном участке должно произойти нечетное число кроссиногверов. В результате частота проксимальных неселективных маркеров у By описывается формулой
Экспериментальные основы, для построения модели физиологических эффектов СНЧ на насекомых
Гипотеза полного переноса. Анализ экспериментов по переносу радиоактивной метки, а также целого ряда данных о зависимости градиента рекомбинантов от генотипа реципиента привел нас к гипотезе полного переноса (Троіцкі, Драмашка, 1977; Troitsky, Dromashko, 1981). Согласно гипотезе полного переноса при конъюгации бактерий спонтанное прерывание переноса отсутствует или, по крайней мере, не столь велико, чтобы объяснить существующий градиент рекомбинантов. Поступив в материнскую клетку, донорская ДНК становится объектом атаки ферментных систем реципиента. Возникающие в результате этого ферментативные разрывы ДНК нарушают синапс переданного конца отцовской хромосомы с материнской и лишают гены, лежащие за такими разрывами, возможности участвовать в рекомбинации. Именно этот эффект, являющийся отражением молекулярных процессов в реципиентной клетке с участием уже перенесенной донорской ДНК, и был принят в свое время за проявление градиента переноса.
Количественное обоснование гипотезы полного переноса было получено при использовании математической модели, описывающей кинетику основных стадий конъюгации (Драмашка, Троіцкі, 1977). Модель впоследствии усовершенствовалась, охватывая более широкий круг экспериментальных данных (Дромашко, 1981; Дромашко, 1984).
За годы, прошедшие после выдвижения гипотезы полного переноса, появилось много новых данных о механизмах рекомбинации. В частности, предложены новые модели рекомбинации, базирующиеся на роли chi-сайтов (Lloyd, 1978; Lloyd, Thomas, 1983; 1984; Smith, 1983; 1991; Smith et al., 1984 и др.). Однако все эти данные касаются событий, происходящих в реципиентной клетке уже после попадания в нее копии донорской молекулы ДНК. Вопрос о количестве переносимого генетического материала донора и механизмах переноса остается открытым. Подтверждением этого может служить уже цитировавшийся обзор Р.Г.Смита в журнале "Cell" (Smith, 1991), озаглавленный "Conjugational recombination in E.coli: Myths and Mechanisms". Он посвящен в основном механизмам рекомбинации, т.е. процесса, следующего за переносом отцовской ДНК в материнскую клетку. По поводу переноса хромосомы говорится следующее: «Перенос ДЕК из отцовской клетки в материнскую, по-видимому, прекращается в случайных точках. Механизм этого приостановления неизвестен; он может быть обязан ss или ds разрывам в отцовской хромосоме, которые прекращают репликацию и перенос».
Положение не изменилось и з конце 1990-х годов. Можно отметить такой факт. Согласно информации, полученной от поисковой службы PubMed в базах данных Национального центра США по биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed) имеются ссылки на ряд наших работ по конъюгации. По статье (Troitsky, Dromashko, 1981), содержащей гипотезу полного переноса, к "related subjects" отнесено около 30 публикаций 1989-1998 гг. по различным аспектам конъюгационного переноса у грам-отрицательных и грам-положительных бактерий, переносу плазмид от прокариот к эукариотам (дрожжам и растениям) и т.д. (Frost, 1992; Silverman, 1997; Rosenberg, 1998; Chen, 1996; Andrup, 1998; Lanka, Wilkins, 1995; Heinemann, Sprague, 1989; Fullner et al., 1996 и др.). Анализ этих работ приводит к выводу, что многие механизмы конъюгации остаются не выясненными до сих пор. В целом приходится согласиться с мнением Ф.М.Сильвермана, который в своем микрообзоре "Towards a structural biology of bacterial conjugation", опубликованном в журнале "Molecular Microbiology" (Silverman, 1997), отмечает: «Несмотря на почти повсеместное распространение в мире бактерий и самое непосредственное отношение к здравоохранению, конъюгационный перенос ДНК, в частности посредством F-плазмиды или ее близких родственников из числа R-факторов, остается «белым ящиком»...Ситуация заключает в себе одновременно «хорошую» и «плохую» новости. «Плохая новость» состоит в том, что нам недостает информации об этом завораживающем, широко распространенном и важном биологическом феномене. «Хорошая новость» - это то, что «плохая новость» не может быть постояннной».
Влияние систем рестрикции-модификации на рекомбинацию. После выдвижения гипотезы полного переноса на повестку дня встал вопрос о молекулярных механизмах, вызывающих градиент рекомбинантов, и способах управления им. Анализ литературных данных и собственные эксперименты привели нас к мысли, что за наблюдаемые эффекты могут отвечать системы рестрикции-модификации (R-M-системы).
В первые годы после открытия явления рестрикции в литературе обсуждался и вопрос о влиянии рестрикции-модификации на конъюгацию (см. сводку в обзорах: Arber Linn, 1969; Boyer, 1971). В частности, исследовалась роль ферментов систем рестрикции-модификации (R-M-систем) при конъюгации различных штаммов кишечной палочки (К-12 и В (Lederberg, 1965, 1966; Arber, Morse, 1965; Copeland, Bryson, 1966; Wood, 1966) и др.), псевдомонад (Holloway, 1966; Rolfe, Holloway, 1966, 1969), в межвидовых кроссах (кишечная палочка и сальмонелла (Colson, Colson, 1967; Okada, Watanabe, 1968; Okada Watanabe, Міуаке, 1968)) и др. Из этих работ следует однозначный вывод: наличие у реципиента дефектов R-M-системы значительно повышает выход рекомбинантов.
Так, рестрикция бактериальной хромосомы была показана на E.coli К-12 в скрещиваниях нелизогенного донора и реципиента, лизогенного по фагу PI (Arber, 1962). В этих кроссах частота рекомбинантов значительно понижалась по сравнению с кроссами, в которых ни один из родителей не был лизогенным. В опытах (Воуег, 1964) скрещивания между Е. coli К-12 Hfr и Е. coli В/г F" давали частоту селективных рекомбинантов в 10-15 раз более низкую, чем в случае, когда в качестве реципиента использовались бактерии Е. coli К-12. При этом наблюдалась задержка около 25 мин в появлении проксимальных маркеров, входящих обычно на 8 мин скрещивания.
Интересные результаты получены в работе (Copeland, Bryson, 1966), в которой исследовалась кинетика неселективных маркеров в скрещиваниях Е. coli К-12 х В и К-12 х К-12. Донором служил штамм АВ312 Hfr, передающий свои гены в последовательности O-arg-mtl-ile-met. Выход рекомбинантов в межштаммовом скрещивании К-12 х В был достаточно низким. Когда в качестве реципиента брался гибрид от скрещивания Е. coli К-12 АВ259 Hfr х Е. coli В BIM36 F", рекомбинация восстанавливалась до прежнего уровня. Это может быть объяснено тем, что АВ259 передает свои гены в последовательности O-pilhr-leu-pro-lac, а кластер генов рестрикции-модификации hsd расположен в 2 мин за геном thr и способен с достаточной частотой интегрироваться в ходе конъюгации в реципиентную хромосому (см. работы лаборатории И.Хубачека: Hubacek, Weiserova, 1980; Hubacek, Kossykh, 1982; Hubacek at al., 1982).
Однако в большинстве исследований донор и реципиент, как правило, обладали разными системами рестрикции (E.coli К-12 и E.coli В, E.coli и S. typhimurium и т.п.). Только в работах (Boice, Luria, 1963; Pittard, 1964; Arber, Morse, 1965; Harris, Christensen, 1966) изучалось влияние на конъюгацию одной и той же R-M-системы фага Р1, которая, в отличие от системы К и В, относится к несколько иному III типу.
Принцип попадания и пост-чернобыльские генетические эффекты
В диссертации излагается новый взгляд на проблему повышения информативности методов анализа и моделирования биологических процессов. В качестве конкретного примера реализации этого подхода дается решение ряда радиационно-генетических и эколого-генетических задач для организмов, относящихся к различным таксономическим группам (микроорганизмы, растения, насекомые), и для различных ситуаций (острое облучение, хроническое действие малых доз ионизирующей радиации, воздействие электрических полей).
Отправной точкой для этой работы послужила недостаточная информативность математической теории генетического картирования, заложенной работами Н.Бейли (Bailey, 1961). Эффективная при описании рекомбинационных эффектов у высших организмов, она далеко не всегда может использоваться для моделирования рекомбиногенных эффектов радиации у бактерий. Более поздние по времени модели конца 1960-х годов (Wu, 1967; Wood, Walmsley, 1969 и др.) также не всегда выполняют свое основное предназначение - дать прогноз отклика системы на облучение.
К моменту начала наших исследований выявились существенные пробелы в разработке методологии анализа и моделирования генетического и физиологического действия физических факторов окружающей среды (низкочастотные электромагнитные поля, хроническое облучение малыми дозами ионизирующей радиации).
В частности, эффекты низкочастотных электромагнитных полей (ЭМП) часто оказываются слабыми и плохо воспроизводимыми, в отличие от тех явлений, которые наблюдаются в высокочастотном диапазоне (Дромашко, Квитко, Писарчик, 1997). Это приводит к сложностям в их изучении, прежде всего на этапе отделения реально существующих закономерностей от многочисленных артефактов. Между тем низкочастотные ЭМП техногенного происхождения являются заметным экологическим фактором, вызывают ряд неблагоприятных физиологических эффектов, которые могут вести к стрессам и отражаться на самочувствии людей и поведении животных. Поэтому насущным вопросом становится разработка методологических подходов к изучению наблюдаемых реакций, поиску таких модельных систем, моделей и методов верификации данных, которые позволят получать достоверную информацию об эффектах ЭМП.
Во многом похожая картина наблюдается и в случае хронического действия малых доз ионизирующей радиации (Поликарпов, Цыцугина, 1993; 1995). Целый ряд наблюдений, сделанных после катастрофы на Чернобыльской АЭС, заставил по-новому взглянуть на применение в радиобиологии и генетике теории вероятностей и математической статистики и начать поиски математического аппарата, более адекватного экспериментальному материалу (Dromashko, Frenkel, Dubovskoy, 1995).
Говоря о моделировании, следует помнить о его прикладных аспектах, особенно на этапах анализа данных и построения прогноза (Очерки истории информатики..., 1998). Для успешного пользования моделью исследователь должен хорошо знать математику и владеть информационными технологиями, что в практике генетики и радиобиологии реализуется достаточно редко. Поэтому одной из задач нашего исследования стала разработка объектно-ориентированного программного обеспечения с дружественным интерфейсом для генетики и радиобиологии.
Анализ этих довольно разнородных задач приводит к выделению единой для всех них концептуальной проблемы методологического характера - о месте принципа аналогии в биологических науках и особенностях его реализации в решении тех или иных задач, а также о его дополнении другими принципами, актуальными на современном этапе развития биологии (Дромашко, 1999). К их числу, на наш взгляд, следует отнести принцип индуктивного построения моделей от простых к сложным, в отличие от математики с ее дедуктивным построением математических теорий. Его дополняет принцип достаточности для описания биологических закономерностей уже существующих математических и компьютерных методов и моделей - требуется только более широкое их использование, Эти три принципа составляют суть новой информационной технологии моделирования биологических процессов, излагаемой в данной диссертационной работе и подтверждаемой на примере решения ряда генетических и радиобиологических задач.
Необходимо подчеркнуть, что для успешного внедрения этой технологии в практику научных исследований необходимо также пересмотреть программы и методы подготовки биологов в высшей школе, еще на студенческой скамье знакомя их с исследовательскими и обучающими возможностями математики и информатики. В частности, перспективным представляется обучение биологов пользованию системами компьютерной математики, позволяющими переложить на ЭВМ выполнение таких в достаточной степени рутинных интеллектуальных операций, как дифференцирование, интегрирование, алгебраические преобразования и т.п.
Изначально ясно, что общие черты, свойственные всем уровням организации живого вещества, дают возможность плодотворно использовать аналогию в моделировании генетических и радиобиологических процессов. В то же время специфика, присутствующая на каждом из этих уровней, приводит к ряду нетривиальных задач. Это относится, в частности, и к такому фундаментальному процессу, как генетическая рекомбинация, имеющему свои отличительные черты у про- и эукариот. Точно так же механизмы взаимодействия излучений с живыми объектами зависят как от характеристик радиации (диапазона электромагнитных излучений, массы и заряда корпускул и др.), так и от особенностей организации облучаемых организмов, степени переплетения биохимических, генетических и физиологических процессов и т.д. На более «приземленном» в практическом плане уровне эта проблема может быть сведена к вопросу о том, что больше влияет на выбор средств моделирования: внутренние свойства изучаемого явления, внешние особенности экспериментального материала (или методов его получения) или же цели, преследуемые при использовании модели как инструмента исследования.
Когда при постановке задачи перевешивают внешние характеристики объекта, часто используется аналогия на уровне формального математического аппарата. При этом возможно установление количественных отношений между отдельными элементами систем, что позволяет не только описать поведение исследуемых систем как единого целого, но и классифицировать явления, управлять технологическими процессами и т.д. (Глушков и др., 1982). К числу таких математических средств относятся полиномиальные модели и методы дисперсионного анализа, нашедшие широкое применение в теории планирования эксперимента, радиационной и биометрической генетике. Используемый здесь аппарат математической статистики является основным средством для построения так называемых моделей данных, когда целью является поиск математической функции (полином, экспонента и др.), наиболее точно описывающей имеющийся набор экспериментальных данных (Журавлев, Ермаков, 1989). В этих случаях математическая модель может быть достаточно грубой, лишь эскизно, в общих чертах отражающей поведение изучаемого явления. Незнание механизма процесса здесь не является большим недостатком, ибо этого фактически не требует постановка задачи. Плодотворность такого подхода в нашей работе продемонстрирована на примере использования полиномиальных моделей для классификации радиационных эффектов (Дромашко, 1996). Используют его и другие исследователи при описании радиационно-генетических эффектов, наблюдаемых после Чернобыльской аварии (Гончарова и др., 1997; Goncharova et al., 1998).
