Введение к работе
Актуальность темы. Развитие методов биохимии, молекулярной биологии и генетической инженерии позволяет подходить к оценке таких явлений как пострадиационный мутационный процесс и радиационно-индуцированная нестабильность генома с точки зрения оценки изменения молекулярно-генетических показателей. В последние годы постоянно увеличивается количество работ, посвященных анализу вариабельности маркеров полиморфизма ДНК у потомства облученных родителей. Маркеры полиморфизма ДНК имеют ряд характеристик, которые делают их удобными для изучения радиационно-генетических эффектов [Алтухов, Салменкова, Курбатова и др., 2004]. Наибольший интерес исследователей в области изучения генетических эффектов радиации представляют мини (МНС) - и микросателлитные (МКС) локусы. Использование МКС и МНС для изучения генетических последствий облучения дает целый ряд преимуществ перед традиционными методами. Например, за счет повышенной частоты спонтанных мутаций, для исследований не требуется значительного числа животных в экспериментальных группах. Большая часть исследований в этой области посвящена изучению генетических последствий облучения в малых дозах, то есть до 0,2 Гр [UNSCEAR, 1999]. В то же время диапазон доз от 0,5 до 1 Гр и выше охвачен молекулярно-генетическими исследованиями в значительно меньшей степени. Вопрос о закономерностях радиационной индукции полиморфизма ДНК при воздействиях средних и больших доз ионизирующих излучений и связи такой индукции с нестабильностью генома остается открытым. Boyd и соавторы, изучая зависимость «доза-эффект» для частоты мутаций в мини- и микросателлитных локусах в клетках линии UVW, показали, что при воздействии у - излучения в дозах 1 - 3 Гр наблюдается достоверное увеличение частоты мутаций с увеличением дозы облучения [Boyd, Livingstone, Wilson et al., 2000].
Помимо анализа изменчивости сателлитных локусов, довольно широкое распространение получил метод оценки генетической вариабельности с помощью полиморфной ДНК, амплифицированной с серией случайных праймеров (random amplified polymorphic DNA, RAPD, или arbi-
I РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ
БИБЛИОТЕКА і
С.-Петербург
0Э 200^акт5^3
trary primed DNA, AP-PCR). Данный метод дает возможность быстрого сканирования генома за счет получения фингерпринтов («отпечатков пальцев») ДНК и может быть использован для оценки изменений, произошедших в нем под воздействием каких-либо факторов. Набор фрагментов ДНК, получаемых при амплификации со случайными праймерами, обладает генотип-специфичностью и может служить критерием при изучении генетических различий между близкородственными видами, линиями, сортами, породами и штаммами. В основе метода RAPD лежит модификация полимеразной цепной реакции (ПЦР), в которой вместо пары праймеров (прямой и обратный), фланкирующих определенную последовательность, используется серия одиночных случайных праймеров, не имеющих специфичности к данному геному. Также иногда используется смесь из 2 - 4 таких праймеров, (semi-RAPD) [Матвеева и др., 2005].
Анализ вариабельности полиморфной ДНК применяется в радиа-ционно-генетических исследованиях как на модельных объектах, так и для мониторинга популяций человека. Безлепкин с соавторами [Безлеп-кин и др., 2000] с помощью метода AP-PCR показали увеличение генетической вариабельности у потомков мышей линии BALB/c, хронически облученных гамма-излучением в дозах 0,1 - 0,5 Гр. Примером использования данной технологии в радиционно-генетическом мониторинге может служить работа Weinberg с соавторами, которые показали увеличение частоты мутаций с помощью RAPD у детей ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС [Weinberg et al., 2001]. Существует множество других примеров использования полиморфной ДНК для оценки генетической вариабельности, возникающей у потомков облученных родителей. Но значительная часть таких исследований посвящена эффектам малых доз, тогда как информации о генетической вариабельности, возникающей при воздействии доз ионизирующего излучения от 0,5 Гр и выше, явно недостаточно. Изучение молекулярно-генетических эффектов средних и больших доз радиации позволит получить более полное представление о механизмах воздействия ионизирующего излучения на геном. Таким образом, актуальность настоящей работы состоит в изучении вариабельности ДНК, возникающей в потомстве мышей, облученых в диапазоне до от 1 до 3 Гр.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в изучении молекулярно-генетических эффектов радиационного воздействия у мышей линий BALB/c и СВАЛас и их потомков в условиях однократного и хронического облучения в различных дозах. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
-
Изучить индукцию генетической вариабельности на пре - и по-стмейотической стадиях сперматогенеза при облучении в дозах от 1 до 3 Гр с помощью полиморфной ДНК, амплифицированной со случайными праймерами.
-
Дать сравнительную оценку чувствительности стадий сперматогенеза на основании анализа уровней вариабельности продуктов RAPD потомков мышей, облученных в диапазоне доз 1-3 Гр.
-
Изучить с помощью метода ДНК -комет изменение устойчивости клеток селезенки мышей линий BALB/c и СВАЛас к воздействию однократного облучения в диапазоне доз 1-6 Гр и пролонгированного облучения в суммарной дозе 0,36 Гр.
-
Изучить молекулярно-генетические эффекты хронического низкоинтенсивного у-излучения у мышей и их потомков с помощью методов RAPD и электрофореза индивидуальных клеток (комет- тест).
Научная новизна полученных результатов. Впервые проведен сравнительный анализ чувствительности пре - и постмейотических стадий сперматогенеза в области доз от 1 до 3 Гр с помощью анализа полиморфизма ДНК, амплифицированной с серией случайных праймеров. Для анализа полиморфизма ДНК была использована серия случайных праймеров, в которую входили как одиночные, так и смеси праймеров. Получены достоверные различия между опытной и контрольной группами для всех использованных доз облучения. Впервые исследованы генетические эффекты пролонгированного облучения в суммарной дозе 0,36 Гр, лишь в несколько раз превышающей годовую дозу от естественного радиационного фона (0,086 - 0,173 Гр/год). Новизна работы заключается и в использованных модификациях метода RAPD, позволяющих получать более воспроизводимые результаты.
Практическая значимость работы Результаты работы могут быть использованы для экстраполяции данных на человека с целью оценки
рисков как острого, так и хронического облучения. Кроме того, полученные результаты позволяют рассматривать возможность использования метода амплификации ДНК со случайными праймерами при проведения радиоционно-генетического мониторинга. При этом, воспроизводимость метода увеличивается при использовании модификации, описанной в настоящей работе, а так же при использовании серии праймеров.
Апробация работы. Результаты настоящей работы были представлены на 6-ой Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», г. Пущино 20-24 мая 2002 г; Международной конференции «Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций», Москва, 10-13 июня 2002 года.; 6-ой Международной научной конференции «Экология человека и природа», г. Плёс, 5-11 июля 2004 г.; Международной научно-практической конференции «Парадигмы современной радиобиологии. Радиационная защита персонала объектов атомной энергетики», Киев - Чернобыль, 27 сентября - 2 октября 2004 г.; 2-ой Международной конференции «Современные проблемы генетики, радиобиологии, радиоэкологии и эволюции», посвященной 105-летию со дня рождения Н.В. Тимофеева-Рессовского, Ереван, 8 -11 сентября 2005 г.; 3-ей Международной конференции «Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций», Дубна, 4 -7 октября, 2005 г; 3-ем Международном симпозиуме «Хроническое радиационное воздействие: медико-биологические эффекты», Челябинск, 25 - 28 октября 2005 г.; межлабораторном семинаре «Проблемы генетической безопасности», ИОГен РАН, 20 декабря 2005 г.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок и 14 таблиц. Диссертация имеет традиционную структуру и состоит из введения, литературного обзора, описания методов и материалов, результатов исследований, их обсуждения, выводов и списка литературы. В списке литературы 193 источника, в том числе 148 на английском языке. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
