Содержание к диссертации
стр.
Введение 4
1. Обзор литературы 9
1.1. Вариабельность чувствительности человека к воздействию
ионизирующего излучения 9
1.2.Изменение клеточной радиочувствительности после облучения в
малых дозах 12
Индукция и репарация двунитевых разрывов ДНК 18
Роль фосфорилирования гистона Н2АХ в репарации двунитевых разрывов ДНК 28
1.5. Использование метод ДНК-комет для оценки уровня
повреждений ДНК и эффективности их репарации 33
1 .б.Фосфатидилсерин как маркер клеточной гибели по механизму
апоптоза 37
Материалы и методы исследования 44
Результаты и обсуждение 53
3.1. Уровень разрывов ДНК лимфоцитов периферической крови...53
Результаты исследования летчиков и космонавтов 53
Результаты исследования онкологических больных 58
3.2. Двунитевые разрывы ДНК, индуцированные облучением in vitro
в лимфоцитах крови и эффективность их репарации 61
3.2.1.Радиационно-ждуцированные двунитевые разрывы ДНК
лимфоцитов периферической крови при облучении in vitro 61
Результаты исследования летчиков и космонавтов 64
Результаты исследования онкологических больных 70
3.2.2.Эффективность репарации радационно-индуцированых
двунитееых разрывов ДНК 76
3.3. Анализ гибели лимфоцитов периферической крови 79
Заключение 84
Выводы 86
Список литературы 88
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время человек часто подвергается воздействию радиации (совместно с другими агентами) в малых дозах, которые могут изменить радиочувствительность организма в сторону: снижение радичувствительности (адаптивный ответ) и ее увеличение. Следует учитывать и малоизученные виды комплексного воздействия на организм - так, в последние десятилетия резко увеличилось число полетов на больших высотах, где человек подвергается воздействию целого ряда неблагоприятных факторов: космическое излучение, перегрузки, вибрация, гиподинамия, стресс и др. Результаты многочисленных медико-биологических исследований свидетельствуют о том, что подобные комплексные воздействия приводят к увеличению частоты цитогенетических нарушений (Heimers, 2000), заболеваниям опухолевого (Buja et al., 2005) и неопухолевого генеза (Grosz et al., 2007), изменениям уровня повреждений генома и чувствительности клеток к дополнительным воздействиям Эти изменения являются предпосылками для развития нестабильности генома (Zha et al., 2007). Однако, как правило, оценивается лишь принципиальная возможность возникновения генотоксических эффектов путем сравнения средних показателей исследуемых групп с контролем. Анализ вариабельности индивидуальных различий отдельных лиц в большинстве исследований не проводится, в то время как их радиочувствительность может различаться в десятки раз.
С другой стороны для лечения онкологических заболеваний человека часто используется лучевая терапия, где опухоли подвергают локальному
облучению в высоких дозах. Известно, что чувствительность опухолей одного и того же типа к облучению у различных индивидуумов существенно различается (Пелевина и др., 2006). Также резко различается последствия лучевой терапии для организма при облучении опухолей в сходных дозах (Pinar et al., 2007). Поэтому при онкологических заболеваниях также чрезвычайно важно определять индивидуальную реакцию на радиационное воздействие.
Из вышеизложенного следует, что поиск адекватных критериев оценки индивидуальной радиочувствительности человека и ее вариабельности является одной из важнейших проблем современной радиобиологии и медицины.
Так как радиочувствительность организма связана главным образом со способностью клеточных систем: 1) предотвращать возникновение повреждений ДНК; 2) репарировать индуцированные радиацией повреждения ДНК; 3) эффективно элиминировать клетки, в которых репарация повреждений ДНК невозможна (запуск апоптоза), то в настоящей работе были изучены основные компоненты, определяющие клеточную радиочувствительность.
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в оценке индивидуальной чувствительности лимфоцитов крови человека к дополнительному облучению в условиях in vitro и выявления маркеров, характеризующих вариабельность радиочувствительности и ее изменение при воздействии профессиональных факторов, развитии онкологических заболеваний и их лучевой терапии.
Были поставлены следующие задачи исследования: на лимфоцитах периферической крови контрольных доноров, летчиков, космонавтов и онкологических больных:
Оценить уровень разрывов ДІЖ и повреждаемость ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro;
Изучить эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК и ее индивидуальную вариабельность;
Сравнить динамику клеточной гибели (апоптоз, некроз);
У онкологических больных до и во время проведения курса лучевой терапии исследовать уровень разрывов ДНК, повреждаемость ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro, эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК и гибель клеток по механизмам апоптоза и некроза;
Сопоставить информативность изученных показателей для характеристики индивидуальной реакции.
Положения, выносимые на защиту:
Полеты на больших высотах приводят к увеличению повреждаемости ДНК в лимфоцитах крови при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro и возрастанию индивидуальной вариабельности радиочувствительности;
У онкологических больных (рак простаты) до лучевой терапии в лимфоцитах крови отмечается повышение уровня разрывов ДНК, увеличение повреждаемости ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro и доли гибнущих клеток. В процессе лучевой терапии рака простаты увеличивается уровень разрывов
ДНК лимфоцитов крови и частота их гибели.
3. Использованный в работе комплекс клеточно-молекулярных методов и подходов позволяет дать адекватную оценку индивидуальной радиочувствительности человека и ее вариабельности.
Научная новизна. Впервые на лимфоцитах крови контрольных доноров, летчиков, космонавтов проведено исследование исходного уровня разрывов ДНК, выхода двунитевых разрывов ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro, эффективности их репарации и динамика гибели клеток (ранний и поздний апоптоз, некроз) при инкубации в условиях in vitro.
Впервые на лимфоцитах крови больных раком простаты до и в процессе лучевой терапии изучено изменение уровня разрывов ДНК, повреждаемости ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro, эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК и динамика клеточной гибели (ранний и поздний апоптоз, некроз) при инкубации в условиях in vitro.
Впервые с применением современных клеточно-молекулярных методов дана комплексная сравнительная оценка вариабельности радиочувствительности в когортах контрольных доноров, летчиков, космонавтов и онкологических больных до и во время лечения.
Научно-практическая ценность работы. Результаты работы могут быть использованы: в радиационной биологии для определения различий в индивидуальной реакции на облучение; в медицине и космической биологии для выявления у пилотов и космонавтов ранних признаков
необходимости прекращения полетов; в медицине для прогнозирования эффективности и последствий лучевого лечения онкологических заболеваний.
Личный вклад диссертанта. Представленная работа является частью исследований, проведенных лабораторией радиационной биофизики и экологии ИХФ РАН с личным вкладом диссертанта, в получение представленных в работе материалов не менее 70 %. Автор самостоятельно осуществляла постановку и проведение исследований, первичную обработку и анализ полученных данных, формулировала положения и выводы работы.
Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на Международной конференции БИОРАД-2006 «Биологические эффекты радиации и радиоактивное загрязнение среды» (Сыктывкар, 2006); 4th International Workshop on Space Radiation Research and 17th Annual NASA Space Radiation Health Investigators' Workshop (Moscow - St. Petersburg, Russia, 2006); 35th Annual Meeting of the European Radiation Research Society and the 4th Annual Meeting of the Ukrainian Society for Radiation Biology (Kiev, Ukraine, 2006); International Free Radical Summer School 2006 (Spetses Island, Greece, 2006); III Международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (Москва-Дубна, 2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
