Введение к работе
Актуальность темы
Одной из фундаментальных проблем современной клеточной биофизики в области нейробиопогии является выяснение механизмов, обеспечивающих работу мозга, в основе которой лежит пластичность .центральной нервной системы (ЦНС). На морфологическом уровне пластичность ЦНС проявляется в образовании и структурной перестройке нежнейрональных связей между отростками нервных клеток (аксонами и дендритами). В этой связи в нейробиология доминирует идея, что структурные перестройки в организации синаптических связей и их число лежат в основе работы мозга и определяют его долговременные и устойчивые изменения.
В настоящее время большинство нейроморфологов считает, что реорганизация синаптических связей является одним из путей развития и обучения мозга млекопитающих (См. последние обзоры: Horner, 1993; Jessel and Kandel, 1993; Jones et al., 1992; Lisman and Harris, 1993; Otani and Ben-Ari, 1993). Хотя идея важности изменений морфологии дендритных шипиков в развитии и обучении, как и в сииаптической передаче имеет более чей столетнюю историю, начиная с пионерских работ Гольджи (Golgi, 1873) и Кахала (Cajal, 1891), однако, только в последние годы эта идея стала получать прямые экспериментальные подтверждения. Так, например, перестройка дендритов как результат действия нейротрансмиттеров была ясно продемонстрирована в исследованиях in vitro (Brewer and Cotman, 1989; Mattson et al., 1988). Подобные изменения структур нейрональных отростков были выявлены также и в исследованиях in vivo, но, главным образом, в экстраординарных ситуациях таких как восстановление после повреждения я после судоржной активности (Caceres and Steward, 1983; Cotman and Nadler, 1978; Cotman and Nieto-Sampedro, 1984; Cragg, 1975; Crutcher, 1987; Deitch and Rubel, 1984; Geinisman et al., 1991, 1992; Greenough, 1984; Juraska et al., 1989; Keller et al., 1990; Muller, 1993; Muller et al., 1993; Nitsch and Frotscher, 1992; Turner and Greenough, 1985; Volkman and Greenough, 1972). И только небольшое число исследований in vivo продемонстрировали, что изменения в структуре синаптических контактов, включая модификацию-мембранных рецепторов и каналов, могут играть роль в экспериментально индуцированных изменениях эффективности сииаптической передачи, а именно, в таких
моделях как посттетаническая потенциация, привыкание и длительная потенциация (Иошков и др., 1977; Bailey and Chen, 1989; Chang and Greenough, 1984; Desmond and Lsavy, 1988; Keller et al., 1992; Petukhov and Popov, 1986) .
В большинстве случаев выявляемые изменения в структуре синаптических контактов интерпретируются в плане их влияния на распространение электрического ответа в постсинапсе через отвечающие на сигнал рецепторы и каналы. Однако, рассмотрение последствий таких изменений не идет дальше построения биофизических моделей распространения по.стсинаптического потенциала по дендриту. В настоящее время кожно говорить только о корреляции каких либо морфологических изменений с изменениями физиологического ответа, так как из всего многообразия структурных перестроек нейрональных связей все еще не возможно вычленить морфологических признаков синапсов, подвергнутых активации. Во многом ясна ситуация о том, что увеличение числа синаптических контактов пряко влияет на эффективность взаимодействия нейронов. В то же время практически нет ясности в вопросе о том, что и каким образом индуцирует образование новых синаптических контактов в мозге взрослых животных.
Практически все существующие работы можно свести к двум альтернативным точкам зрения, отражающим судьбу синаптических контактов:(а) при постоянном числе синаптических контактов их обновление идет тем быстрее, чем активнее они работают (Brewer and Cotman, 1989; Cotman and Nadler, 1978; Cotman and Nieto-Sampedro, 1984) и (б) раз образовавшись синаптические контакты сохраняются на всю жизнь и возножно увеличение только их числа (Greenough, 1984; Turner and Greenough, 1985). Все эти исследования свидетельствуют о ток, что прогресс в понимании механизмов работы мозга взрослых животных зависит от ответа на вопрос, что лежит в основе этих механизмов: полное ли обновление синапсов или только их преобразование за счет модификации синаптических структур.
Цели и задачи исследования. Целями настоящего исследования являются:
1) Изучение возможности исчезновения (распада) и образования
синаптических контактов в мозге взрослых животных в условиях их
врожденного стереотипного поведения;
2) Оценка связи между эффективностью синаптической передачи и
количественными изменениями в структуре пре- н постсинаптических элементов;
-
Изучение взаимосвязи между интенсивностью формирования синаптических структур и интенсивностью белкового синтеза в нервных клетках.
-
Изучение роли межнейрональкых связей в дифференцировке нейронов.
В настоящей работе в качестве удобной модели для изучения ЦНС в различных функциональных состояниях был выбран гиппокамп, по крайней мере, по следующим причинам:
-
В эволюционном плане эта структура мозга представляет старую кору с хорошо развитой и упорядоченной системой межнейрональных связей и синапсами легко идентифицированной морфологии (Виноградова, 1975).
-
имеется много данных о том, что, в случае частичной деафферентации и обучения, в гиппокампе обнаружены перестройки в синаптических контактах (Horner, 1993; Greenough, 1984; Lisman and Harris, 1993; Otani and Ben-Ari, 1993).
Кроме того, возможно одной из наибольших трудностей в изучении синаптической пластичности является поиск такой популяции нейронов, в которой можно было бы провести статистически достоверный анализ изменений для конкретных пре- и постсинаптических структур. Это связано с тем, что гиппокамп содержат чрезвычайно большое разнообразие по морфологии синапсов, благодаря чему очень трудно точно выделить идентичную группу синапсов, подвергнутых экспериментальному воздействию, например, электрической стимуляции и т.д. Однако эта проблеиа была нами решена путем выбора для ультраструктурного анализа уникальных гигантских бутонов, представляющих до 5-6 уха в диаметре ' окончания немиелинизированных мшистых волокон, идущих от нейронов зубчатой фасции и локализованных в полях САЗ/СА4 гиппокакпа.
В своей работе мы использовали следующие физиологические модели ЦНС:
-
Зимняя спячка сусликов как 'врожденная форма поведения, при которой можно получить различные функциональные состояния мозга: глубокое торможение электрической активности; быстрое восстановление электрической активности и переход к обычному функционированию мозга у эутермных животных;
-
модель длительной потекциация и других функциональных состояний
пирамидных нейронов полей САЗ/СА4 в переживающих срезах гиппокампа крысы, получаемых путей электрической стимуляции определенных областей среза (мшистых волокон) и отражающих разный уровень эффективности синаптической передачи с мшистых волокон на пирамидные нейроны. Это дает возможность сопоставить уровень активности нейронов и состояние ультраструктуры этих синаптичєских контактов.
3. Регенерация нейронов обонятельной системы у золотой рыбки. Это
позволяет получить удобную модель, позволяющую исследовать in vivo
роль синаптичєских контактов на дифференцировку специализированных
нейронов обонятельной системы.
4. Интраокулярные гомотрансплантаты эмбриональной обонятельной
выстилки крысы, позволяющие исследовать в условиях близких к in
vitro влияние синаптичєских контактов на дифференцировку
обонятельных нейронов.
Нам представлялось важным ответить на следующие вопросы:
-возможен ли, а если да, то в каких условиях распад межнейрональных связей;
-связано ли новообразование синаптичєских контактов только, с обучением животного;
-влияет ли интенсивность функционирования синаптического контакта на его морфологию, а если да, то обратимы ли эти структурные изменения.
Для ответа на эти вопросы были поставлены следующие задачи:
-дать качественную и количественную оценку перестроек пре- и постсинаптических ультраструктур в гигантских синапсах полей САЗ/СА4 гиппокампа, находящегося в различных функциональных состояниях
оценить скорость структурных перестроек пре- и постсинаптических элементов в гигантских синапсах полей САЗ/СА4;
провести сравнительный анализ изменений в структуре апикальных дендритов пирамидных нейронов полей САЭ/СА4 методами световой микроскопии с использованием импрегнации нейронов по Гольджи и улыратонких срезов;
провести сравнительный анализ организации цито- и нуклеоскелетз пирамидных нейронов в зависимости от их функционального состояния;
провести сравнительный анализ обонятельного рецепторного аппарата, включая роль на его дифференцировку синаптичєских связей
первичных обонятельных нейронов с нейронами обонятельной луковицы. Основные положения, выносимые на защиту.
-
На примере пирамидных нейронов полей САЗ/СА4 гиппокампа сусликов продемонстрированы повторные и обратимые изменения дендритных шипиков и синапсов.
-
Параллельно с обратимыми изменениями в дендритных шипиках происходит повторный и обратимый распад и ресинтез de novo синаптических контактов в мозгу взрослых животных.
-
Активация рибосомального белкового синтеза как в случае электрической стимуляции с образованием длительной лотенциации в переживающих срезах гиппокампа крыс, так и в течение зимней спячки сусликов сопровождается увеличением числа синаптических контактов и возрастанием эффективности синаптической передачи.
-
В основе механизмов образования длительной потенциации в переживающих срезах гиппокампа крыс после краткой тетанической электрической стимуляции мшистых волокон лежат как пост-, так и пресинаптические перестройки, которые, по крайней мере, сопровождаются изменениями в синаптических контактах, а именно, в числе и форме постсинаптических уплотнений.
-
Полученные результаты свидетельствуют о том, что в основе механизмов синаптической пластичности в UHC взрослых животных лежит синаптогенез идущий de novo за счет обновления синапсов.
-
Дяфференцировка первичных обонятельных нейронов прямо не зависит от установления синаптических связей этих клеток с нейронами обонятельной луковицы.
Научная новизна работы.
На примере естественной модели зимней спячки сусликов экспериментально доказано, что в основе механизмов синаптической пластичности в ШІС нормальных взрослых животных лежит обновление синапсов.
Используя два альтернативных функциональных состояния сусликов: холодовое оцепенение и нормотермию, а также 2,5 ч искусственное пробуждение из состояния оцепенения впервые эксперименатально показано, что быстрые, повторные и обратимые изменения в дендритных шипиках и синаптических контактах указывают на циклический процесс деиннервации и реиннервации гиппокампальных
нейронов мшистыми волокнами в течение врожденного, стереотипного поведения.
Результаты качественного и количественного ультраструктурного анализа переживающих срезов гиппокампа крыс с параллельной регистрацией спайковых разрядов пирамидных нейронов полей САЗ/СА4 после различных процедур электрической стимуляции мшистых волокон зубчатой фасции показали, что в образовании феномена длительной потекциации наряду с постсинаптическики перестройками важную роль играют и изменения в пресинапсе, по крайней мере, в числе и размерах пресинаптических везикул.
Результаты ультраструктурного анализа обонятельных нейронов позвоночных как при гомотрансллантации в переднюю камеру глаза крысы эмбриональной выстилки, так и состояния обонятельной выстилки золотой рыбки после аксотомии свидетельствуют о том, что наличие прямых синаптических связей между первичными обонятельными нейронами и нейронами ЦНС (обонятельных луковиц) не является необходимый условием дифференцировки обонятельных нейронов, что связано с образованием обонятельных сенсорных цилий.
Практическое значение.
Полученные результаты свидетельствуют о высокой лабильности синаптических связей в ЦНС млекопитающих, показывая, что даже в случае врожденного поведения имеет место быть образование de novo новых синаптических контактов, наряду с альтернативным процессом ретракции шипиков и дендритных отростков. Эти результаты позволяют глубже понять механизмы синаптогенеза и функционирования нейронов ЦНС, демонстрируя высокую лабильность межнейрональных сетей. В конечном итоге, эти данные могут найти применение в разработке фармакологических препаратов, воздействующих на пре- и постсннаптические элементы синапсов, с целью лечения различных патологий в ЦНС.
Исследования факторов и условий, вызывающих гибернацию у животных, могут иметь важное значение в нейрохирургии при проведении длительных операций на мозге путем создания гипотермии у человека.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Всесоюзных конференциях по криогенным методам в электронной микроскопии
(1974; 1977; 1985; 1989) в г. Пущине; IX, X, XI, XII, XIV Всесоюзных конференций по электронной микроскопии (г. Тбилиси, г. Ташкент, г. Таллин, г. Сумы, г.Черноголовка); I Всесоюзном Биофизическом Конгрессе (г. Москва, 1982); Конференция по электронной микроскопии (г. Дрезден, ГДР, 1977); Европейская международная конференция по замораживанию-травлению (г. йена, ГДР, 1979); УІІІ Всесоюзном Симпозиуме Биофизика и биохимия биологической подвижности (Тбилиси, 1987); У Советско-Швейцарский Симпозиум : "Biological membranes: structure and function (Рига, 1988); X Международный Симпозиум : "Olfaction and Taste X" (Осло, Норвегия, 1989); Международный Конгресс: "Molecular changes by microwaves" {Вена, Австрия, 1990); Международный Симпозиум: "Химическая сигнализация и коммуникация" (Москва, 1992); IX Всесоюзный Симпозиум : "Структура и функция клеточного ядра"
(Черноголовкаб 1987); Международный Симпозиум: "Molecular organization of biological structures" (Москва, 1989); Всесоюзный Симпозиум: "Механизмы зимней спячки" (Пушино, 1987); Международный Симпозиум: "Signal Molecules and Behaviour" (Пущиио, 1989) X Международный Биофизический конгресс (Ванкувер, Канада, 1990);3 Международный конгресс по сравнительной физиологии и биохимии(г. Токио, Япония, 1991); IX Конгресс Европейского общества по хеморецепции (г. Мюнхен, ФРГ, 1992); на семинарах Института физиологии Геттингенского университета (г. Геттинген, ФРГ), в отделе биоинженерии Университета штата Вашингтон (г. Сиэтл, США) и в Университете Военно-Морских Сил США (г.Бетезда, США). Публикация работ. Основные материалы диссертации отражены в 41 публикации, включая статьи и тезисы докладов. Кроне того, автором опубликовано дополнительно более 60 статей и тезисов, включая 4 авторских свидетельства, которые содержат материалы пряно не связанные с темой настоящего автореферата.
Основные результаты, выпоенные на защиту, и их обсуждение-