Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Основные характеристики мезенхимальных стволовых клеток человека и области их применения в клеточной терапии 12
1.2 Роль и место двунитевых разрывов среди повреждений ДНК 18
1.3 Основные механизмы репарации двунитевых разрывов ДНК и их роль в судьбе клетки 19
1.4 Особенности воздействия ионизирующего излучения в малых дозах на мезенхимальные стволовые клетки 26
1.4.1 Репарация двунитевых разрывов ДНК 26
1.4.2 Пролиферация 32
1.4.3 Старение 33
1.4.4 Радиационно-индуцированная нестабильность генома 37
1.4.5 Канцерогенез 39
Глава 2. Материалы и методы 45
2.1 Выделение и культивирование мезенхимальных стволовых клеток слизистой десны 45
2.2 Выделение и культивирование мезенхимальных стволовых клеток костного мозга 46
2.3 Иммунофенотипическая характеристика выделенных мезенхимальных стволовых клеток 47
2.4 Облучение 47
2.5 Иммуноцитохимические исследования 48
2.6 Анализ количества - галактозидаза положительных клеток 49
2.7 Статистический анализ 49
Глава 3. Результаты и обсуждение 51
3.1 Анализ накопления спонтанных двунитевых разрывов ДНК в длительно культивируемых мезенхимальных стволовых клетках человека 51
3.2 Ранние радиационные эффекты 58
3.2.1 Оценка изменений числа и колокализации фокусов H2AX и рATМ в ядрах мезенхимальных стволовых клеток, облученных рентгеновским излучением в малых дозах 58
3.2.2 Сравнительные исследования изменений числа и колокализации фокусов H2AX и рATМ в ядрах мезенхимальных стволовых клеток, облученных в дозах 80 и 1000 мГр 72
3.2.3 Анализ изменения числа фокусов H2AX в пролиферирующих и покоящихся клетках 76
3.3 Отдаленные эффекты облучения 79
3.3.1 Количественный анализ фокусов H2AX в потомстве облученных клеток 79
3.3.2 Оценка пролиферативной активности в потомстве облученных клеток 81
3.3.3 Оценка клеточного старения в потомстве облученных клеток 82
Заключение 85
Выводы 90
Список сокращений 91
Библиографический список 93
Благодарности 122
- Основные характеристики мезенхимальных стволовых клеток человека и области их применения в клеточной терапии
- Канцерогенез
- Оценка изменений числа и колокализации фокусов H2AX и рATМ в ядрах мезенхимальных стволовых клеток, облученных рентгеновским излучением в малых дозах
- Оценка клеточного старения в потомстве облученных клеток
Введение к работе
Актуальность темы. Механизмы формирования эффектов облучения в малых дозах (10-100 мГр) являются одной из наиболее дискутируемых и спорных проблем в современной молекулярной и клеточной радиационной биологии. Особый интерес вызывают исследования эффектов облучения в малых дозах в стволовых клетках, в частности, в мультипотентных мезенхимальных стволовых клетках (MCК), что связано с их высоким пролиферативным потенциалом и возможностью накопления нарушений и мутаций с последующей передачей более высокодифференцированным клеточным потомкам.
МСК являются наиболее хорошо исследованным и охарактеризованным типом клеток, используемым в регенеративной медицине. В то же время в клинической практике клеточная терапия нередко сопровождается различными рентгеновскими диагностическими процедурами, во время которых происходит облучение тканей в малых дозах. Отклик МСК на данное воздействие практически не изучен. Существуют лишь отдельные и крайне противоречивые работы на данную тему. Так, с одной стороны, показано, что облучение в малых дозах (40 мГр) индуцирует клеточное старение и нарушает процессы аутофагии в МСК костного мозга человека [Alessio N., 2015], а, с другой стороны, есть данные о том, что воздействие рентгеновского излучения в дозах 50 и 75 мГр стимулирует пролиферацию МСК костного мозга крыс посредством активации MAPK/ERK сигнальных путей [Liang X., 2011].
Ионизирующее излучение (ИИ) может влиять на генетическую стабильность МСК, однако до сих пор не выяснено, влияет ли воздействие ИИ в малых дозах на трансформацию стволовых клеток в опухолевые. В последнее время появилось довольно много эпидемиологических работ, свидетельствующих об увеличении рисков возникновения злокачественных новообразований у детей и подростков после проведения компьютерных томографий, где кумулятивная доза достигает 50-60 мГр [Pearce M.S., 2012].
Известно, что воздействие ИИ на живые клетки приводит к образованию целого спектра разнообразных повреждений ДНК, среди которых наиболее критическими для дальнейшей судьбы клетки являются двунитевые разрывы (ДР) [Kotenko K.V., 2013]. Клеточный ответ на воздействие ИИ напрямую зависит от числа накопленных ДР ДНК и может включать такие процессы, как остановка клеточного цикла, активация процессов репарации ДНК, индукция клеточного старения и запуск программ клеточной гибели по механизмам апоптоза или аутофагии [Rodriguez-Rocha H., 2011; Taleei R., 2015].
В настоящее время наиболее чувствительным методом для оценки ДР ДНК является иммуноцитохимический анализ фокусов белков репарации ДНК, среди которых наиболее широкое использование получил анализ фосфорилированного корового гистона Н2АХ (Н2АХ) [Kuo L.J., 2008]. Фосфорилирование Н2АХ в регионах хроматина, прилегающих к концам образовавшегося разрыва, происходит в течение нескольких минут и осуществляется преимущественно киназами АТМ, ATR и DNA-PKcs [Marechal A., 2013]. При этом АТМ является
одной из основных киназ, фосфорилирующих Н2АХ в ответ на образование радиационно-индуцированных ДР [Zhao J., 2017].
Таким образом, исследование эффектов воздействия ИИ в МСК может внести вклад в понимание биологических процессов, происходящих в этих клетках в ответ на облучение, и помочь оценить эффекты, получаемые в результате облучения в малых дозах, в том числе и при прохождении медицинских диагностических процедур.
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы является изучение ранних (до 24 ч) и отдаленных (до 11 пассажа) эффектов воздействия ИИ в малых дозах в МСК человека.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
-
провести исследования закономерностей репарации ДР ДНК в культивируемых МСК человека, подвергшихся воздействию рентгеновского излучения в малых дозах в ранние сроки после облучения (до 24 ч);
-
изучить особенности изменений количества ДР ДНК в отдаленные сроки (до 11 клеточных пассажей) после облучения МСК человека в малой дозе рентгеновского излучения;
-
провести анализ изменений, ассоциированных с клеточным старением и нестабильностью генома в отдаленные сроки (до 11 клеточных пассажей) после облучения МСК в малой дозе рентгеновского излучения.
Научная новизна. Впервые были получены оригинальные данные о характере изменений количества и колокализации фокусов Н2АХ и фокусов активной, фосфорилированной киназы АТМ (рАТМ) в МСК человека, подвергшихся воздействию рентгеновского излучения в малых (20, 40, 80 мГр) и средних дозах (160, 250 и 1000 мГр) в ранние временные сроки после облучения (0,5 ч, 4 ч, 24 ч).
Впервые проведена дифференцированная оценка количества фокусов Н2АХ в пролиферирующих и покоящихся длительно культивируемых необлученных МСК при использовании маркера клеточной пролиферации - белка Ki67. Впервые на МСК человека была оценена биологическая значимость остаточных фокусов Н2АХ, позволяющая опровергнуть гипотезу, связывающую их повышенное содержание в клетках после облучения в малых дозах с неэффективной репарацией или индуцибельным характером репарации ДР ДНК. Было показано, что этот феномен обусловлен образованием новых фокусов Н2АХ в результате репликативного стресса, вызванного стимуляцией клеточной пролиферации. Результаты исследований, полученные на клетках, культивируемых вплоть до 11 пассажа после облучения, свидетельствуют о том, что облучение МСК человека в малых дозах не приводит к эффектам, связанным с преждевременным старением и нестабильностью генома.
Теоретическая и практическая значимость работы. Изучение закономерностей формирования ранних и отдаленных последствий воздействия ИИ в малых дозах представляет собой актуальную, имеющую общебиологическое значение задачу, а ее решение позволит получить новые научные знания, имеющие фундаментальное значение для радиационной биологии и медицины.
Полученные данные вносят важный вклад в понимание биологических процессов, проходящих в длительно-культивируемых МСК и могут быть использованы в клинической практике для оптимизации протоколов экспансии стволовых клеток, необходимых для клеточной терапии. Результаты исследований чрезвычайно важны для адекватной оценки опасности облучения в малых дозах. Использование количественного анализа фокусов Н2АХ в биодозиметрии может приводить к значительной переоценке доз и риска облучения и требует дополнительных исследований.
Методология и методы исследования. Работа выполнена на базе Федерального государственного бюджетного учреждения «Государственный научный центр Российской Федерации - Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна» и Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук.
Теоретической и методологической основой диссертационной работы являются разработки отечественных и зарубежных ученых в области радиобиологии, молекулярной и клеточной биологии и биофизики. Информационную базу составляют статьи в периодических рецензируемых изданиях, материалы научных конференций, объекты интеллектуальной собственности, публикации в научных сборниках по исследуемой проблеме.
При проведении исследований были использованы: методы культивирования МСК; рентгеновская установка для облучения культуры клеток; иммунофлуоресцентные методы детекции белков, участвующих в репарации повреждений ДНК в облученных МСК; иммунофлуоресцентный метод анализа пролиферативной активности клеток; цитохимический метод оценки стареющих клеток; статистические методы обработки полученных данных.
Положения, выносимые на защиту:
-
кинетика образования и деградации фокусов белков репарации ДР ДНК в МСК человека, облученных в малых и средних дозах рентгеновского излучения, имеет существенные различия;
-
механизм длительного поддержания повышенного количества фокусов H2AХ в облученных в малых дозах рентгеновского излучения МСК человека является АТМ-независимым;
-
воздействие рентгеновского излучения в малых дозах не приводит к отдаленным последствиям облучения, ассоциированным с накоплением ДР ДНК и клеточным старением.
Достоверность результатов работы обеспечивается проведением большого количества экспериментов с достаточной воспроизводимостью; статистической обработкой полученных данных с заданной вероятностью и необходимым количеством повторных исследований; сопоставлением результатов, полученных разными методами, а также сравнением с аналогичными результатами, полученными другими авторами.
Апробация работы проведена на расширенном заседании секции №1 Ученого совета ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России. Основные
положения и результаты диссертационной работы представлялись и докладывались на следующих научно-практических конференциях: 23-ей Международной конференции по вопросам радиации и здравоохранения (CRH), г. Ваиколоа-Виллидж, Гавайи, США, 2016 г.; Международном научно-практическом форуме «Ядерные технологии на страже здоровья», Москва, 2016 г.; XXII и XXIII ежегодной научной конференции Института химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, секция Динамика химических и биологических процессов. Москва, 2017 и 2018 гг.; 42-м конгрессе Федерации европейских биохимических обществ (FEBS), г. Иерусалим, Израиль, 2017 г.; школе-конференции "Ильинские чтения", Москва, 2018 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 3x глав, заключения, выводов, списка использованных источников и благодарностей. Содержит 122 страницы машинописного текста, в том числе 18 рисунков. Библиография включает 212 наименований, из них в зарубежных изданиях - 199 .
Основные характеристики мезенхимальных стволовых клеток человека и области их применения в клеточной терапии
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), так же называемые мезенхимальными стромальными клетками, это тип мультипотентных стволовых клеток, которые характеризуются высоким пролиферативным потенциалом, способностью к самообновлению, а также дифференцировкой в остео-, хондро- и адипогенном направлениях. При определенных условиях МСК способны дифференцироваться во многие другие типы клеток мезодермального, эктодермального и энтодермального происхождения [Ullah I., 2015], включая эндотелиальные клетки [Konno M., 2010], кардиомиоциты, гепатоциты [Wang I., 2016] и нейральные клетки [Morikawa S., 2009]. Помимо костного мозга и жировой ткани, МСК были обнаружены во многих органах и тканях, включая скелетные мышцы [Chan C.K., 2015]. и печень [Wang Y., 2016] (Рисунок 1.1). МСК играют важную роль в восстановлении различных повреждений органов и тканей взрослого организма.
Согласно выработанным Международным обществом клеточной терапии критериям (ISCT, Ванкувер, Канада), МСК должны обладать следующими свойствами: прикрепляться к пластику при культивировании в стандартных условиях; экспрессировать на поверхности маркерные антигены CD105, CD73 и CD90, но при этом не содержать CD45, CD34, CD14 или CD11b, CD79 или CD19 и HLA-DR, а также дифференцироваться в остеоциты, хондроциты и адипоциты in vitro [Lee H.K., 2014]. Рисунок 1.1 Пластичность мезенхимальных стволовых клеток [Kumar R., 2010].
Способность дифференцироваться в различных направлениях, сильные иммуномодулирующие свойства, а также секреция противовоспалительных молекул позволяют МСК быть эффективным инструментом для лечения различных патологий, в том числе и для устранения последствий лучевой терапии. Так, была показана эффективность использования МСК для лечения радиационно-индуцированных повреждений кожи [Еремин П.С., 2014], сердца [Gao S., 2017], кишечника [Gong W., 2016] и легких [Perez J.R., 2017]. При этом трансплантируемые МСК способны не только замещать поврежденные клетки, но и изменять клеточное микроокружение путем секреции различных факторов. Паракринные функции МСК осуществляются путем секреции растворимых факторов и высвобождения внеклеточных везикул, таких как экзосомы и микровезикулы (эктосомы). Внеклеточные везикулы представляют собой бислойные липосомы и содержат различные микро-РНК, мРНК и белки, которые переносятся от секретирующих клеток в клетки-реципиенты (Рисунок 1.2) [Пантелеев М.А. , 2017]. Было обнаружено, что внеклеточные везикулы, секретируемые МСК, могут иметь терапевтический эффект в большом количестве моделей болезней животных. Следовательно, внеклеточные везикулы, полученные из МСК, могут быть использованы в качестве альтернативной терапии в регенеративной медицине на основе МСК [Keshtkar S., 2018].
МСК служат важнейшим источником факторов роста и цитокинов, принимающих участие в регуляции регенерации тканей. Так, в костном мозге именно МСК продуцируют факторы, необходимые для самоподдержания гемопоэтических стволовых клеток и удержания их в нише, включая SDF-1a (фактор стромы-1а), SCF (фактор стволовых клеток), ангиопоэтин-1 и интерлейкин-7. МСК продуцируют ангиогенные и нейротрофические факторы роста, включая VEGF (фактор роста сосудистого эндотелия), bFGF (основной фактор роста фибробластов), HGF (фактор роста гепатоцитов), ангиопоэтин, NGF (фактор роста нервов), BDNF (нейротрофический фактор головного мозга) и GDNF (нейротрофический фактор глиальных клеток) [Калинина Н.И., 2011]. Существует предположение, что через секрецию различных факторов МСК также способны увеличивать эффективность репарации ДР ДНК [Gao S., 2017]. Рисунок 1.2 Схематическое представление биогенеза микровезикул (эктосом) и экзосом [Abreu S.C., 2016].
Тем не менее, несмотря на все положительные стороны использования МСК, полноценная клеточная терапия ограничена рядом нерешенных вопросов. Одним из них является недостаточное количество МСК, получаемое от донора, что требует их экспансии in vitro. В то же время длительное культивирование МСК приводит к старению клеток, ухудшению клеточной дифференцировки, фокальной адгезии, дисфункции митохондрий [Geissler S., 2012], хромосомным аберрациям и увеличению риска злокачественной трансформации [Barkholt L., 2013].
Другим ограничением является необходимость выяснения последствий облучения МСК ионизирующим излучением (ИИ) в малых дозах. В настоящее время накоплен большой багаж знаний об эффектах радиационного воздействия в больших дозах, таких как повреждение и репарация ДНК, цитогенетические нарушения, клеточная гибель. Однако до сих пор ведутся активные дискуссии о последствиях воздействия облучения в малых дозах [Morgan W.F., 2013]. В то же время ИИ успешно применяется в медицине для различных диагностических процедур, включая маммографию и компьютерную томографию. Используемые в данных процедурах малые дозы ИИ (10-100 мГр) необходимы для того, чтобы собрать данные о текущем заболевании без побочных эффектов. Тем не менее, до сих пор ведутся споры об увеличении рисков возникновения злокачественных новообразований даже при облучении в малых дозах. Возможность облучения МСК при воздействии ИИ во время лучевой терапии, где тотальная доза для немишенных органов может достигать 298 ± 194 мЗв [Uselmann A.J., 2015], также требует выяснения вопросов точности репарации ДНК после воздействия облучения в малых дозах. Существует большой риск возникновения вторичных опухолей, которые могут проявить себя спустя годы после прекращения терапии. Известно, что МСК обладают тропностью в отношении опухолей. На различных моделях было показано, что МСК могут как стимулировать рост и метастазирование опухоли за счет супрессии иммунного ответа, усиления васкулогенеза и активации эпителиально-мезенхимального перехода, так и, наоборот, оказывать ингибирующее воздействие за счет секреции факторов, вызывающих гибель опухолевых клеток [Калмыкова Н.В., 2016].
Принимая во внимание то, что МСК способны дифференцироваться в остеогенном направлении, некоторые исследователи предполагают, что в результате лучевой терапии увеличивается риск развития остеосаркомы [Alessio N., 2017]. Так у детей, подвергающихся лучевой терапии, остеосаркомы являются одним из наиболее распространенных типов вторичных опухолей [Taran S.J., 2017]. Остеосаркома связана с мутацией гена Rb1 и других генов онкосупрессоров [Chen X., 2014]. Выключение этого гена приводило к накоплению повреждений ДНК, снижению пролиферации и индукции старения в МСК, облученных малыми дозами рентгеновского излучения [Alessio N., 2017]. В отсутствие должной элиминации выжившие поврежденные клетки являются основным источником мутаций, приводящих к их трансформации. С другой стороны есть работы, свидетельствующие о том, что МСК в стрессовых условиях увеличивают миграцию и резистентность к апоптозу клеток остеосаркомы [Vallabhaneni K.C., 2016].
Последствия воздействия ИИ в малых дозах с точки зрения возможных благоприятного, нейтрального или неблагоприятного исхода должны занимать значительное место в поле зрения будущих исследований. Особого внимания требует исследование механизмов немишенных эффектов в необлученных клетках, которые получают сигналы от облученных (эффект свидетеля), а также эффектов, наблюдаемых в потомстве облученных клеток (радиационно-индуцированная нестабильность генома) [Morgan W.F., 2013; Пелевина И.И., 2011]. В то же время стабильность генома определяется способностью клетки эффективно осуществлять ответ на повреждения ДНК, возникающие как в результате эндогенных процессов (например, при ошибках репликации), так и при воздействии внешних стрессовых факторов, в т. ч. радиационного.
Поскольку МСК самообновляются на протяжении всей жизни, они способны накапливать генетические повреждения, которые подвергают риску генетическую стабильность [Tsvetkova A., 2017]. Генетическая нестабильность тесно ассоциирована со злокачественной трансформацией. Стволовые клетки способны избежать генетической нестабильности путем массивной элиминации поврежденных клеток, что может привести к ухудшению функциональности клеточного пула. С другой стороны, устойчивость к облучению, приводящая к выживанию клеток с повреждениями ДНК, приводит к накоплению генетических нарушений. Таким образом, облученным клеточным популяциям приходится постоянно балансировать между поддержанием тканевого гомеостаза и генетической стабильностью [Harfouche G., 2010].
Канцерогенез
В последнее время появилось большое количество исследований, посвященных изучению возможного влияния облучения в малых дозах в результате проведения компьютерной томографии (КТ) у детей и подростков на риски возникновения злокачественных новообразований [Krille L., 2012; Gibson D.A., 2014]. В исследовании Пирс с соавт. была обнаружена дозо-зависимая корреляция между риском возникновения лейкемии и опухоли головного мозга и орган-специфичным воздействием ИИ (костный и головной мозг) во время проведения КТ у детей [Pearce M.S., 2012]. Данное исследование было подвергнуто сомнению, поскольку не исключена возможность, что на результаты повлияла обратная причинно-следственная связь, то есть процедура КТ была проведена для диагностики уже существующей болезни и, следовательно, не является ее причиной. При повторном исследовании, в котором были исключены индивидуумы с возможными признаками рака до прохождения процедуры, а время между прохождением КТ и диагностикой рака составляло 2 года для лейкемии и 5 лет для опухоли головного мозга, снижение избыточного радиационного риска составило 15% для лейкемии и 30% для опухоли головного мозга [Berrington de Gonzalez A., 2016]. Авторы полагают, что полученные данные свидетельствуют о повышенном риске развития рака после облучения в малых дозах в результате прохождения молодыми пациентами КТ. С другой стороны, появились данные, напротив, свидетельствующие о положительных эффектах компьютерных томографий: уменьшение смертности от рака у людей [Ostrowski M., 2018] и экспериментальных животных [Lemon J.A., 2017; Lemon J.A., 2017]. Известно, что МСК способны мигрировать в «очаги» опухолей [Kidd S., 2009] и оказывать стимулирующий [Beckermann B.M., 2008] или ингибирующий эффект на опухолевый рост, инвазивность и метастазирование через прямые или непрямые взаимодействия с опухолевыми клетками [Nomoto-Kojima N., 2011]. Опухолевое микроокружение обладает молекулярными характеристиками «незаживающей раны», постоянно секретируя различные цитокины и другие медиаторы, которые устанавливают в ткани состояние воспаления [Feng H., 2018]. Эти сигналы обладают способностью притягивать различные типы клеток, в том числе МСК. Миграция и внедрение МСК в микроокружение первичных опухолей или метастазов наблюдалась для различных типов рака, в том числе рака легких [Loebinger M.R., 2009], рака головного мозга [Sasportas L.S., 2009], рака молочной железы [Patel S.A., 2010], рака толстой кишки [Menon L.G., 2007], рака поджелудочной железы [Zischek C., 2009] и др. Миграция стволовых клеток в места повреждения регулируется взаимодействием большого числа пар хемокин/рецептор, включая SCF/c-Kit [Sun L., 2004], VEGF/VEGFR [Schmidt N.O., 2009], HCP/c-Met [Garzotto D., 2008], SDF-1/CXCR4 [Carbajal K.S., 2010], молекул адгезии -интегрина-1 и -2, а также L-селектина [Son B.R., 2006]. Миграцию МСК также стимулируют такие воспалительные цитокины, ангиогенные факторы и факторы роста, как IL-8, нейротрофин-3, PDGF, EGF, TGF- , IL-1 и TNF- [Abarbanell A.M., 2009. Опухоли продуцируют и высвобождают большинство этих хемокинов и цитокинов, которые могут служить лигандами для связывания с рецептороми МСК [Dwyer R.M., 2007]. При этом функции МСК в опухолевом микроокружении не являются однозначными. С одной стороны, являясь источником растворимых факторов, МСК могут быть вовлечены во многие процессы, связанные с осуществлением иммунного надзора, индукцией апоптоза и ангиогенеза. Так, в модели остеосаркомы мышей МСК человека способствовали росту и метастазированию опухоли как in vivo, так и in vitro [Xu W.T., 2009]. С другой стороны, показано, что МСК, выделенные из жировой ткани человека, ингибировали in vitro пролиферацию клеток рака молочной железы путем секреции DKK-1, который, в свою очередь, подавляет сигнальные пути Wnt/-catenin и Nanog [Zhu Y., 2009]. При совместном культивировании клеток линии глиобластомы и МСК, полученных из пуповины человека, пролиферация клеток глиобластомы была значительно ингибирована, а цитотоксичность увеличена через подавление ингибитора апоптоза-XIAP (от англ. «X-linked inhibitor of apoptosis protein») [Dasari V.R., 2010 ].
В середине 90-х годов большое количество исследований привело к возникновению концепции опухолевых стволовых клеток (ОСК) [Lapidot T., 1994; Sell S., 1994]. Данная концепция предполагает, что нормальные стволовые клетки могут быть трансформированы в опухолевые, а прогениторные стволовые клетки могут быть трансформированы в ОСК. В свою очередь, ОСК способны образовывать клетки, составляющие основу опухоли [Manda K., 2014]. Данная концепция объясняет явление гетерогенности опухолевой ткани, а также признана приоритетной для многих исследований, в частности, в проблеме развития резистентности к лучевой и химиотерапии и рецидивирования новообразований. Так, присутствие ОСК в остеосаркомах может объяснить опухолевую гетерогенность, устойчивость к химиотерапии и высокую способность к метастазированию. Существует множество предположений о том, что МСК являются предшественниками остеосарком. Фактически, остеобласт, который является единственной клеткой, способной продуцировать остеоидную матрицу, происходит от МСК. Кроме того, МСК способны дифференцироваться в хондроциты и фибробласты [Cleton-Jansen A.M., 2009; Basu-Roy U., 2013] в соответствии с различными подтипами остеосарком. Таким образом, некоторые исследователи предполагают, что остеосаркомы возникают на ранней стадии дифференциации МСК в остеобласты [Xiao W., 2013]. Недавно МСК человека были успешно трансформированы в опухолевые клетки в результате сайленсинга гена ретинобластомы (pRb, антионкоген, расположенный на 13q14,2) в сочетании со сверхэкспрессией c-Myc (онкоген, расположенный на 8q24.2) [Wang J.Y., 2017]. Интересен тот факт, что экспрессия SOX2 (маркер стволовости) была повышена в этих трансформированных МСК, аналогично первичной культуре клеток, выделенной из остеосаркомы, которая при пересадке индуцировала опухоли у иммунодефицитных мышей [Skoda J., 2016].
Сильный тропизм МСК костного мозга в отношении клеток остеосарком наблюдался в работе Пьетровито с соавт. [Pietrovito L., 2018], где после контакта с клетками остеосарком МСК костного мозга трансдифференцировались в ассоциированные с раком фибробласты, одновременно внося вклад в увеличение уровней секреции MCP-1, GRO-, IL-6 и IL-8 в опухолевом микроокружении. Эти цитокины стимулируют мезенхимально-амебоидный переход (МАП), обусловленный активацией малой ГТФ-азы RhoA в клетках остеосарком. Результатом является значительное повышение агрессивности клеток остеосарком по таким показателям, как подвижность, инвазивность и трансэндотелиальная миграция. Обладая способностью к трансэндотелиальной миграции, клетки остеосарком, стимулированные МСК костного мозга, также стимулируют миграцию, инвазию и образование in vitro капиллярной сети эндотелиальных клеток. Таким образом, накопление МСК костного мозга в области опухолей и последующий индуцированный цитокинами МАП являются критическими событиями в злокачественности остеосарком.
Важным в данном случае является вопрос: какую роль играет воздействие ИИ в трансформации стволовых клеток в ОСК и может ли она быть вызвана воздействием ИИ в малых дозах? К сожалению, существующие в настоящее время литературные данные затрагивают в основном влияние средних и больших доз ИИ ( 100 мГр). Так, культивируемые в течение 6 месяцев после -облучения в дозе 2,5 Гр МСК формировали опухоли после трансплантации иммунодефицитным мышам. Также в этих клетках наблюдалось ускоренное укорачивание теломер и повышенный уровень анафазных мостиков [Christensen R., 2008].
Похожие результаты были получены в работе Москалевой [Москалева Е.Ю., 2017]. Опухоли были обнаружены у 2 из 5 мышей и у 5 из 5 мышей после трансплантации МСК костного мозга облученных в дозе 1 и 6 Гр соответственно. В последствии новообразования были охарактеризованы как многокомпонентные мезенхимомы («смесь сарком») [Москалева Е.Ю., 2017]. В то же время при подкожном введении облученных в дозе 100 мГр длительно-культивируемых МСК костного мозга и МСК головного мозга мышей линии C57BL/6, опухоли обнаружены не были. Это может быть связано со стимуляцией репарации спонтанных повреждений ДНК при этом воздействии, поскольку через 24 ч после облучения количество фокусов H2AX, свидетельствующих о присутствии ДР ДНК в этих клетках, было ниже контрольного уровня [Москалёва Е.Ю., 2017]. Облучение 40 мГр первичной культуры МСК костного мозга с инактивированным геном RB1 приводило к накоплению ДР ДНК в течение 48 ч после воздействия, при этом клетки не подвергались апоптозу или старению. Это свидетельствует о том, что данные клетки могут стать источником мутаций с последующей онкотрансформацией. Однако при анализе колониеобразования в мягком агаре данные клетки не проявляли свободный («безъякорный») рост, характерный для опухолевых клеток [Alessio N., 2017].
Оценка изменений числа и колокализации фокусов H2AX и рATМ в ядрах мезенхимальных стволовых клеток, облученных рентгеновским излучением в малых дозах
Одним из важных вопросов в радиационной биологии является вопрос зависимости наблюдаемых эффектов от дозы ионизирующего излучения. Поэтому нами был проведен детальный анализ изменений числа фокусов H2AX, фокусов фосфорилированной (активной) АТМ (рATМ) и их колокализации в ранние временные сроки (5, 10, 15, 30, 60 и 120 мин) после облучения в дозах 20, 40, 80, 160 и 250 мГр. Выбор этих временных сроков был обусловлен тем, что они (в особенности 15-30 мин) наиболее часто используется для построения зависимостей изменения числа фокусов H2AX от дозы излучения. Результаты анализа дозовых зависимостей представлены графически на рис. 3.3. Через 5 мин после облучения зависимость числа фокусов H2AX от дозы можно с высокой значимостью аппроксимации (r=0,974; p=0,001; R2=0,949) описать линейным уравнением y=(0,588±0,279) + (0,019±0,002) x, где у - среднее число фокусов в клеточном ядре, х – доза излучения в мГр (рис. 3.1). Таким образом, для МСК средний выход фокусов H2AX на единицу поглощенной дозы через 5 мин после облучения равен 19±2 фокусов на клетку/Гр. Число фокусов рАТМ от дозы излучения в эту временную точку неплохо описывается (r=0,965; p=0,002; R2=0,932) линейной функцией y=(0,813±0,110)+(0,006±0,001) x, где у - среднее число фокусов в клеточном ядре, х – доза излучения в мГр. При расчете на дозу 1 Гр получается всего 6±1 фокуса/клетку/Гр. Это свидетельствует о низкой активации АТМ через 5 мин после облучения и об АТМ-независимом характере фосфорилирования Н2AХ в ранние сроки после облучения. Увеличение времени инкубации клеток после облучения до 15 мин приводит к линейно-зависимому от дозы излучения увеличению числа фокусов H2AX и рАТМ.
Расчетное число фокусов H2AX и рАТМ на клетку/Гр через 15 мин после облучения соответствует 29±2 и 22±1, соответственно. Обращает на себя внимание тот факт, что наибольшая колокализация фокусов H2AX и рАТМ наблюдается через 30 мин после облучения. В эту временную точку зависимость числа фокусов Н2AX от дозы описывается линейным уравнением y=(1,600±0,421)+(0,033±0,003) x (r=0,980; p=0,0006; R2=0,960), а дозовая зависимость рАТМ - у=(0,931±0,334) + (0,032±0,003) x (r = 0,987; p = 0,0002; R2 = 0,974), где у - среднее число фокусов в клеточном ядре, х – доза излучения в мГр. В пересчете на 1 Гр, для H2AX получается 33±3, а для рАТМ 32±3 фокуса/клетку/Гр. То есть, количественный выход фокусов H2AX и рАТМ на единицу дозы через 30 мин после воздействия рентгеновского излучения практически совпадает. При дальнейшем увеличении времени инкубации до 60 мин количественный выход фокусов H2AX на дозу несколько увеличивается (37±3 фокуса/клетку/Гр), в то время как выход рАТМ практически не меняется (34±4 фокуса/клетку/Гр). Через 120 мин после облучения наблюдалось снижение числа фокусов как H2AX, так и pАТМ, что обычно указывает на процесс восстановления поврежденных цепей ДНК. На рисунке 3.4 представлены микрофотографии фокусов H2AX и pATM в ядрах МСК человека через 30 минут после воздействия рентгеновского излучения в дозах 20-250 мГр. На микрофотографиях ясно прослеживается тенденция к увеличению числа фокусов в клеточном ядре с увеличением дозы излучения.
Результаты исследования кинетики изменения числа фокусов H2AX, рATМ и их колокализации в культивируемых МСК человека после облучения в дозах 20, 40, 80, 160 и 250 мГр представлены на рис. 3.5. Было показано, что после облучения в дозе 250 мГр наблюдается увеличение числа фокусов H2AX с максимумом на 1 ч, после чего в течение последующих 3 ч происходит уменьшение их числа до 40 % от наблюдаемого в точке максимума (p = 0,0004). Уменьшение дозы до 160 мГр отражается на кинетике процесса: снижение числа фокусов H2AX происходит более медленно и через 4 ч после облучения остается уже 60 % фокусов (p = 0,0487). Дальнейшее снижение дозы рентгеновского излучения до 80, 40 и 20 мГр (диапазон малых доз) приводит к тому, что число фокусов H2AX статически значимо не уменьшается через 4 ч после облучения (p=0,334, p=0,232 и p=0,607 соответственно) (рис. 3.5). Похожие закономерности наблюдались ранее в первичных фибробластах человека, но при облучении в гораздо более низких дозах (2.5-10 мГр) [Grudzenski S., 2010]. Авторы объясняли этот феномен индуцибельностью репарации ДНК в клетках млекопитающих при облучении в очень малых дозах. Однако в нашем случае отмечается эффективное фосфорилирование H2AX после облучения в малых дозах, свидетельствующее о распознавании ДР и начале процессов их репарации. Логичнее объяснить наблюдаемый эффект замедленной деградацией фокусов H2AX или их возникновением de novo.
Результаты анализа фокусов рАТМ и их колокализации с фокусами H2AX свидетельствуют о том, что в случае облучения в дозе 250 мГр максимум активности АТМ приходится на 30-60 мин после облучения (рис. 3.5). Как уже отмечалось ранее при анализе дозовых зависимостей, уже через 5 мин после облучения отмечается увеличение числа фокусов H2AX, неколокализованных с фокусами рАТМ, для дозы 160 и 250 мГр. Предполагается, что в клетках млекопитающих сразу после облучения (2-10 мин) происходит активация киназы DNA-PKcs, а уже позже (10-56 мин) активация АТМ [Reitsema T., 2005]. Активация АТМ является сложным многоступенчатым процессом. Первичная активация ATM происходит при участии MRN-комплекса и заключается в диссоциации неактивных димеров ATM. Такая частично активированная ATM может участвовать в фосфорилировании некоторых белков, включая гистон H2AX. Тем не менее, для полной активации ATM необходимо двухступенчатое аутофосфорилирование этой киназы [Bakkenist C. J., 2003]. Поэтому в ранние сроки после облучения (до 10 мин) мы наблюдаем процессы фосфорилирования H2AX, предположительно обусловленные DNA-PKcs, а в более поздние (15-60 мин) - АТМ. Обращает на себя внимание тот факт, что фокусы рАТМ, как правило, колокализованы с H2AX (рисунки 3.3 и 3.5). В то время как фокусы H2AX, в особенности в ранние (5-10 мин) и поздние (2-4 ч) времена после облучения часто не колокализованы с pATM (чем больше расстояние между темными и светлыми кружками на рис. 3.3, тем меньше колокализация фокусов H2AX и pATM). То есть, в этих случаях фосфорилирование H2AX происходит без участия АТМ. Через 30 мин после облучения степень колокализации фокусов H2AX и pATM является максимальной (почти перекрывающиеся темные и светлые кружки на рис. 3.3).
При сравнении накладываемых микрофотографий фокусов H2AX и pATM («Merged» на рис. 3.4 и 3.6) становится очевидным, что через 30 минут после облучения для некоторых доз только единичные фокусы H2AX (красные фокусы) не были колокализованы с фокусами pATM (зеленые фокусы). В то же время через 240 минут после облучения во всем изученном диапазоне доз число неколокализованых фокусов H2AX было существенным. Более того, становится очевидным, что степень колокализации зависит от дозы. В самом деле, для малых доз (ниже 160 мГр) степень колокализации фокусов была меньше, чем для средних.
После облучения в дозах 40 и 80 мГр максимум фокусов рАТМ наблюдался через 30 мин, после чего отмечалось снижение числа как самих фокусов рАТМ, так и фокусов рАТМ, колокализиванных с H2AX, практически до контрольных значений (рис. 3.5). В клетках, облученных в дозе 20 мГр, отмечались похожие процессы, но с максимумом фокусов рАТМ на 60 мин. Это свидетельствует о том, что механизмы поддержания высокого числа фокусов H2AX через 2-4 ч после облучения в малых дозах являются АТМ независимыми.
Мы провели корреляционный анализ, чтобы определить степень колокализации H2AX и pATM в зависимости от дозы через 15, 30 и 60 мин. после облучения (Рис. 3.7 А, Б, В). Анализ выявил статистически значимую корреляцию между степенью колокализации фокусов и дозой излучения для всех исследуемых временных точек (Рис. 3.7 А, Б, В). Однако для доз 0-80 мГр только через 30 мин (точка максимального выхода H2AX и pATM) наблюдалось дозо-зависимое увеличение степени колокализации (Рис. 3.7 Б). Подобной зависимости не наблюдалось через 15 и 60 мин после облучения (Рис. 3.7 А, В). Затем мы провели сравнительный анализ изменения степени колокализации фокусов H2AX и pATM для группы малых (20, 40 и 80 мГр) и средних (160 и 250 мГр)доз во всех исследованных временных точках.
Оценка клеточного старения в потомстве облученных клеток
Во многих работах было показано, что МСК не подвергаются программируемой клеточной гибели путем апоптоза как после облучения в малых дозах [Alessio N., 2015], так и в больших дозах порядка 20 Гр [Nicolay N.H., 2013; Cmielova J., 2012]. Клеточное старение, напротив, повышается и, судя по всему, является основным механизмом, приводящим к снижению клеточной пролиферации после образования значительных повреждений генетического материала [Nicolay N.H., 2015].
Для оценки возможного влияния облучения на процессы клеточного старения в потомках облученных клеток был проведен анализ доли клеток с высокой активностью, ассоциированной со старением (Senescence-Associated) -галактозидазы (SA--gal). Этот фермент традиционно считается классическим маркером клеточного старения, его активность резко повышена в стареющих клетках.
Результаты исследований, представленные на рис. 3.13, показывают, что в популяции контрольных клеток с увеличением числа пассажей увеличивается доля SA--gal позитивных клеток. Так на 11-м пассаже (14-м с начала культивирования) доля SA--gal позитивных клеток была в 2,1 раза выше (р=0,008) по сравнению с 3-м пассажем (6-м с начала культивирования). В потомках клеток, облученных в дозе 1000 мГр, отмечается процесс ускоренного радиационно-индуцированного старения, что хорошо заметно на 11-м пассаже после облучения (рис. 3.13 Б). Тогда как в потомках клеток, облученных в малой дозе, на поздних пассажах отмечается даже некоторая, хотя и статистически незначимая, тенденция к снижению доли SA--gal позитивных клеток (рис. 3.13 Б).
Изображения SA-gal позитивных клеток (указаны стрелками – цитоплазма окрашена в темно-зеленый цвет). Ядра окрашены Hoechst 33342 (голубые). (Б) Изменение доли (%) SAgal позитивных клеток в зависимости от клеточного пассажа в контрольных и облученных клетках. В самом деле, результаты исследований отдаленных эффектов облучения показали, что на 3 и 5 пассажах потомков клеток, облученных в дозах 80 и 1000 мГр, число фокусов H2AX не отличается от контрольных значений. Это говорит о том, что, по крайней мере, после облучения в этих дозах в культурах МСК не наблюдается описанной в работе [Vaurijoux A., 2017] передачи длительно существующих фокусов Н2АХ через клеточные деления. Наблюдаемое на 8 и 11 пассажах клеток, облученных в дозе 1000 мГр, увеличение числа фокусов Н2АХ можно объяснить РИНГ или ускоренным старением клеток. Однако РИНГ наблюдается в основном в культурах иммортализованных или опухолевых клеток. В первичных культурах нормальных клеток существенный вклад в увеличение количества ДР ДНК вносит клеточное старение. В пользу данного предположения говорят результаты, полученные нами для длительно-культивируемых необлученных МСК десны, где на поздних пассажах наблюдается резкое увеличение числа фокусов H2AX, ассоциированное со снижением пролиферативной активности, а в случае МСК костного мозга еще и с увеличением доли SAgal позитивных клеток. Можно предположить, что воздействие ионизирующего излучения в дозе 1000 мГр лишь интенсифицирует этот процесс. В пользу этого говорит и тот факт, что на 11 пострадиационном пассаже клеток, облученных в дозе 1000 мГр, увеличение числа фокусов Н2АХ также сопровождалось снижением пролиферативной активности и увеличением доли SAgal позитивных клеток. Важно отметить, что облучение в дозе 80 мГр не приводило к статистически значимым изменениям исследуемых показателей в потомках облученных клеток в течение 11 пассажей после облучения. В целом полученные результаты позволяют сделать важное заключение о том, что облучение в малой дозе не индуцирует процессы ускоренного старения и РИНГ в потомках облученных клеток.