Содержание к диссертации
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Физиолого-биохимические аспекты созревания 9
пыльцы и роста пыльцевой трубки
I.I.I* Процессы прорастания пыльцы и образования і о
пыльцевой трубки
1.1.2. Межклеточные взаимодействия пыльцы и пестика із
при спорофитной несовместимости
1.1.3. Свойства пыльцы в системе гаметофитной несов- 14
местимости
1.2. Радиобиология пыльцы 19
1.2.1. Влияние рентгеновского и гамма-облучения на 19
прорастание и рост пыльцы
Цитологические исследования облученной пыльцы 27
Системы пострадиационного восстановления 30
в пыльце
1.2.3.I. Репарация и мутагенез 32
1.3. Применение облученной пыльцы в практическом 37
растениеводстве
Индукция партеногенеза облученной пыльцой 37
Использование радиации для преодоления 40
половой несовместимости у покрытосеменных
растений
1.3.3. Перенос генов с помощью облученной пыльцы . . 45
- З -ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выращивание растений *
Получение и проращивание пыльцы
Исследование свойств облученной пыльцы . . .
Цитогенетические исследования
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 3* ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ФИЗИОЛОГИИ, БИОХИМИИ И ГЕНЕТИКЕ ПЫЛЬЦЫ
3.1. Физиолого-биохимические свойства пыльцы при
прорастании .....
3.1.1. Оптимизация условий для проращивания пыльцы
in vitro . . . .
ЗЛ.2. Получение стерильной культуры пыльцевых
зерен in vitro
3.1.3* Количественное содержание ДНК в пыльце
в процессе прорастания *
3.2. Генетический анализ клонов самосовместимой
и самонесовместимой петунии гибридной по генам, контролирующим самонесовместимость, цвет пыльцы и окраску цветка
ГЛАВА 4. РАДИОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПЫЛЬЦЫ
Ростовые реакции пыльцы на гамма-облучение
Опыляющая способность гамма-облученной пыльцы
Процессы пострадиационного восстановления
в пыльце
4.3.1. Восстановление от сублетальных и потенциаль
но летальных повреждений
- 4 -
4.3.2* Внеплановый синтез ДНК . 122
ГЛАВА 5. РОЛЬ ОБЛУЧЕННОЙ МЕНТОРНОЙ ПЫЛЬЦЫ В ПЕРЕНОСЕ 128 ГЕНОВ ПРИ ПОЛОВОМ ПРОЦЕССЕ
5.1. Менторные свойотва гамма-облученной пыльцы 128
в системе гаыетофитной несовместимости
петунии гибридной
5.2. Осуществление и возможный клеточно-молекуляр- 136
ный механизм гаметической трансформации
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 156
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИЙ . 165
ВЫВОДЫ 166
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 168
Введение к работе
С давних времен пыльца является одним из основных объектов эмбриологических исследований, проводимых на растениях. В связи с этим были подробно исследованы строение и морфология пыльцевых зерен, процесс микроспорогенеза, проанализирован ход процесса оплодотворения и установлена решающая роль в его осуществлении мужского гаметофита [86, 87, 23, 294, 253, ИЗ].
Детальная изученность морфологии, физиологии, генетики и биохимии пыльцы, достаточно простое ее строение, гаплоидное состояние генома в совокупности с возможностью проявления пыльцой всего комплекса сложных внутри- и межклеточных взаимодействий, характерных только для эукариотического организма, обусловили интерес к пыльце со стороны радиобиологов [13, 125, 132, 40, 5, 27]. 9тот интерес постоянно подкреплялся тем, что использование радиации в растениеводстве и, в частности, для облучения пыльцы, позволило успешно решить целый ряд конкретных практических задач по отдаленной гибридизации, индукции гаплоидии и направленному мутагенезу [48, 17, 9, 38, 93, 189].
Внимание многих ученых как в нашей стране, так и за рубежом привлек метод "облученной менторной пыльцы" [274, 275, 233, 243, 244, 28, 298]. Суть метода заключается в том, что при опылении используется смесь пыльцы, состоящая из несовместимой жизнеспособной и совместимой, но облученной гамма-радиацией в таких дозах, когда оплодотворяющая способность полностью теряется (зародыш и эндосперм не образуются), но сохраняется цитоплазматическая активность* Такое резкое различие в радиоустойчивости ядра и цитоплазмы обусловливает возможность роста пыльцевой трубки нормальной длины при
- б -
отсутствии или полном нарушении процесса двойного оплодотворения, С использованием метода "облученной менторной пыльцы" стало возможным получать нормальные семена как путем преодоления барьера несовместимости пыльцевыми трубками несовместимой пыльцы, так и в результате индукции партеногенеза.
Таким образом, использование радиации на основе широкого изучения физиологических механизмов в оплодотворении открывает широкие перспективы для управления этим процессом.
В настоящее время на первый план выдвинулась задача преобразования генома эукариотической растительной клетки в связи с необходимостью обогащения видового генофонда и создания растительных форм, наиболее приспособленных к измененным климатическим условиям и в то же время сочетающих в себе особо ценные признаки современных сортов.
На майском 1982 г. Пленуме ЦК КПСС отмечалось: "Советские ученые немало сделали для подъема сельского хозяйства. Но то, чем мы могли удовлетвориться вчера, уже явно недостаточно завтра и даже сегодня. Вот из этого и надо исходить в науке" [2].
Продовольственная Программа, разработанная на основе решений ХХУІ съезда КПССі поставила следующую важную задачу - выведение и быстрейшее внедрение в производство новых сортов и гибридов, отвечающих требованиям индустриальных технологий, обеспечивающих стабильно высокие урожаи при разных погодных условиях. Решение этой задачи также лежит в усиленном развитии теоретических исследований по биотехнологии и проблемам генной инженерии в селекции растений, поскольку методы генной инженерии позволяют манипулировать с наследственным веществом на уровне молекул, дают возможность разрабатывать принципиально новые подходы к созданию хозяйственно ценных сортов растений [I, 2, 44].
В 1975 году К.їїанди [24oJ предложил интересный метод, названный "гаметической трансформацией", аналогичный методу микроинъекций ДНК в яйцеклетку у животных организмов [183, 39, 64 J , с тем лишь отличием, что впрыскивание ДНК здесь происходит естественным путем по пыльцевой трубке, облученной летальными дозами гамма-радиации генетически инертной пыльцы, использующейся в качестве мен-торной при смешанном опылении как во внутривидовых, так и межвидовых скрещиваниях. Применение этого метода в гаметофитной системе внутривидовой и межвидовой несовместимости в роде nicotians (семейство Solanaceae) позволило получить растения с некоторыми фено-типическими признаками растений-доноров менторной пыльцы. Предполагается, что перенос генов произошел вследствие миграции некоторого количества генетического материала облученной пыльцы в образовавшуюся зиготу и образования гибридных молекул ДНК [242, 244, 2451 246j. Перенесенные таким путем гены могут интегрироваться в геноме зародыша и передаваться потомству.
Метод, предложенный Панди, интересен в том плане, что наряду со своей простотой, он таит возможность введения различного количества чужеродной генетической информации в геном, поскольку число вводимых активных и неактивных оперонов можно контролировать дозой облучения [150, 159].
Целью настоящей работы является детальное изучение физиологических и радиобиологических свойств пыльцы Petunia hybrida і ее прорастающей и оплодотворяющей способности как в норме, так и после гамма-облучения.
Конечная задача настоящей работы состоит в том, чтобы путем глубокого изучения радиобиологических свойств пыльцевых зерен и детального анализа дозовых зависимостей генетической и цитоплаз-матической активности пыльцы и действия систем репарации ДНК в пыльце установить диапазон доз, при которых происходит гаметиче-ская трансформация.
Успешное решение поставленных задач связано с разработкой новых методических подходов для проращивания пыльщд in vitro , а такке требует большой подготовительной работы по выведению клонов растений с точно известными и легко тестируемыми генетическими маркерами*
Как объект исследования мы выбрали Petunia hybrids - растение, хорошо изученное в генетическом плане и часто поэтому служащее модельной системой для проведения экспериментов по радиационной генетике [218, 50, 51, 127j. Беоь комплекс проведенных нами радиобиологических исследований на пыльце послужил основой для выявления менторных свойств облученной пыльцы и возможности ее использования для целей гаметической трансформации.
