Содержание к диссертации
Введение 4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1 Общая характеристика фотобиологических реакций, инициируемых
видимым светом 11
-
Деструктивные фотобиологические реакции. Фотосенсибилизированные процессы. Фотодинамическое действие видимого света 12
-
Активные формы кислорода 17
-
Фотодинамическое повреждение биомолекул клетки 19
-
Повреждения белков 19
-
Повреждения липидов 20
-
Повреждения нуклеиновых кислот 21
1.5. Прямое фотодинамическое повреждение клеточных органелл 22
1.5.1. Повреждения ядра и наследственного аппарата 23
-
Летальные и ингибирующие эффекты ФД воздействия на культивируемые клетки и на одноклеточные организмы 25
-
Деструктивные ФД процессы в тканях и органах многоклеточных организмов. Летальные эффекты ФД воздействия на сложные многоклеточные организмы 27
-
Метод ФДТ и его клиническое применение 31
-
Влияние ФД действия на процессы реализации наследственной
информации 34
2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 36
2.1 Объекты исследования 36
2.2. Характеристика применяемого воздействия и дозиметрия 37
2.3.Методы исследования 45
-
Измерение морфофизиологических признаков 45
-
Определение общего содержания РНК , 49
2.4. Методы статистической обработки результатов 51
З.РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 52
-
Влияние ФДД на показатель выживаемости/смертности особей Drosophila melanogaster 52
-
Влияние темнового воздействия ФС «Фотогем» и облучения красным светом (633±15 нм) на выживаемость Drosophila melanogaster 61
3.3 Половые различия выживаемости особей DrosophUa melanogaster,
подвергнутых ФДД 61
-
Влияние ФДД на показатели плодовитости Drosophila melanogaster.... 66
-
Влияние темнового воздействия фотосенсибилизатора «Фотогем» на плодовитость Drosophila melanogaster 75
-
Влияние облучения красным светом (633±15 нм) на плодовитость Drosophila melanogaster 77
-
Влияние ФДД на соотношение полов в потомстве первого поколения Drosophila melanogaster 78
-
Влияние отдельных компонентов ФДД на соотношение полов в потомстве первого поколения Drosophila melanogaster 85
-
Влияние ФДД на массу тела (Fi - особей) Drosophila melanogaster... 85
3.10 Влияние темнового воздействия ФС «Фотогем» на массу тела (Fi -
особей) имаго Drosophila melanogaster 89
3.11 Влияние облучения красным светом (633±15нм) на массу тела (Fi -
особей) имаго Drosophila melanogaster 91
3.12 Влияние ФДД на содержание РНК в теле Drosophila melanogaster .. 92
4.0БСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 96
5. ВЫВОДЫ. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 123
-
ЛИТЕРАТУРА 126
-
ПРИЛОЖЕНИЕ 151
Введение к работе
Актуальность темы исследования:
Фотодинамические (ФД) процессы являются разновидностью фотобиологических процессов, протекающих с участием молекул фотосенсибилизатора (ФС). В ходе этих реакций происходит поглощение света молекулами хромофора-сенсибилизатора с последующей генерацией активного синглетного кислорода ('Ог), повреждающего биологические структуры (Конев, Волотовский, 1979). ФД процессы достаточно широко распространены в природе (Румбаль, 2000). Некоторые патологические состояния человека, например, различные виды порфирии и фотодерматозов, связаны с повышением уровня ФД процессов в организме из-за нарушений метаболизма или вредных внешних воздействий ( Идельсон, 1980).
Значение изучения закономерностей ФД процессов связано также с тем, что в клинической ' практике в последнее время прлучили широкое распространение методы направленного фотодинамического повреждения клеток, объединяемые под названием фотодинамическая терапия - ФДТ (Румбаль, 2000; Плужников и др., 2002). ФДТ является современным эффективным щадящим методом лечения злокачестренных опухолей различной локализации (Странадко и др., 2002), а также широко применяется для терапии ряда неонкологических заболеваний, например, гнойных, длительно незаживающих ран, трофических язв, псориаза, ревматоидного артрита и др. (Гейниц и др., 2002). Кроме того, ФД воздействие, лежащее в основе ФДТ, является базовым механизмом для метода флуоресцентной диагностики, также широко применяемой в клинической практике (Кулае, Альмяшев, 1999; Велыиер и др., 1999; Шикунова и др., 2002). ФДТ является фотохимиотерапией, т.к. лечебный эффект осуществляется за счет повреждающего ФД действия на неопластические клетки двух основных компонентов - светового излучения и фотосенсибилизатора (ФС), которые при взаимодействии инициируют свободно-радикальные фотохимические реакции, вызывающие деструкцию клеток (Пасс, 1993). Основным результатом и целью применения ФДТ является интерфазная гибель клеток патологических очагов или их репродуктивная гибель.
Следовательно, среди всех возможных биологических эффектов фотодинамического действия (ФДД) основное практическое значение приобретает изучение его деструктивно-ингибирующего влияния на основные морфофизиологические показатели объекта. Такое изучение даёт возможность более глубокого понимания механизмов ФДД, закономерностей его влияния на основные показатели на разных уровнях организации. Важное значение для возможной оптимизации схем и методов ФДТ имеет оценка удельного веса каждого из двух компонентов ФДТ в конечном биологическом эффекте. Актуальной проблемой представлялось также изучение фотоповреждающих (ФП) эффектов ФДТ с использованием доступного и хорошо изученного в генетическом отношении объекта — Drosophila melanogastex. Предполагается, что именно эти его особенности позволят в сравнительно короткие сроки исследовать механизмы и закономерности действия ФДТ на разных уровнях организации живого.
Цели и задачи исследования:
Целью настоящей диссертации является изучение влияния комплексного ФД воздействия и его отдельных компонентов на ряд морфофизиологических и биохимических показателей Drosophila melanogaster, определение возможности использования данного биологического вида в качестве модельного тест - объекта для сравнительной оценки эффективности различных фотосенсибилизаторов и вариантов сочетаний компонентов ФДД. Для реализации поставленной цели были решены следующие основные задачи:
1. Изучение комплексного ФД действия и действия его отдельных компонентов в дозах, входящих в диапазон используемых в клинической практике на организм Drosophila melanogaster с использованием критерия выживаемости (жизнеспособности) и на показатель плодовитости экспериментальных особей.
Исследования результатов ФД действия и действия его отдельных компонентов на соотношение полов в потомстве подвергнутых воздействию особей и их массу тела.
Изучение влияния ФД действия на общее содержание РНК в теле имаго Drosophila melanogaster.
Сравнение биологической эффективности отдельных компонентов ФДД и их сочетанного действия, выраженной в величинах изменения выбранных критериев анализа.
Оценка влияния половых различий экспериментальных особей Drosophila melanogaster на степень проявления изучаемых в работе признаков выживаемости, массы тела (Fi - особей), общего содержания РНК под влиянием ФДД и его отдельных компонентов.
Научная новизна:
Предложена методика оценки биологической эффективности ФД воздействия на организменном и молекулярно - генетическом уровне организации путем изучения его влияния на ряд морфофизиологических и биохимических признаков Drosophila melanogaster. Произведено сравнение роли каждого отдельного компонента ФДД в реализации конечного биологического эффекта. Установлено влияние половой принадлежности экспериментальных особей на степень резистентности к повреждающему (ингибирующему) ФД воздействию. Установлено влияние деструктивного ФД действия на процессы размножения, передачи и реализации наследственной информации у многоклеточного эукариотического организма.
Впервые изучено:
Дозовые зависимости влияния ФДД с ФС «Фотогем» и его отдельных компонентов на показатель выживаемости (жизнеспособности) Drosophila melanogaster.
Влияние различных доз ФДД, а также красного света (633±15 нм, 0,3 Вт/см ) и темнового действия разных концентраций фотосенсибилизатора «Фотогем» на показатели плодовитости, соотношения полов особей в потомстве подвергнутых ФД действия родительских форм и средней массы тела Fj — особей имаго Drosophila melanogaster.
Действие разных степеней ФДД на общее содержания РНК в теле особей имаго избранного модельного объекта.
Взаимосвязь между величинами изменения указанных морфофизиологических и биохимических показателей Drosophila melanogaster при различных дозировках ФДД и соответствующими значениями выживаемости этого модельного объекта.
Влияние половой принадлежности экспериментальных особей Drosophila melanogaster на степень их естественной резистентности к повреждающему ФД действию.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. ФД действие с фотосенсибилизатором «Фотогем» приводит к снижению выживаемости особей Drosophila melanogaster при применении концентраций ФС в трофическом субстрате 5,2 мг/мл и более в сочетании с экспозиционными дозами облучения красным светом 36,0 Дж/см2 и более. Повышение дозы ФДД, связанное с увеличением численного значения одного или обоих его компонентов сопровождается усилением летального эффекта.
ФДД оказывает угнетающий эффект на морфофизиологические показатели как относящиеся непосредственно к подвергнутым экспериментальному влиянию особей дрозофилы, например, плодовитость, так и характеризующие их потомство, такие как соотнощение полов, масса тела имаго. Конкретная величина изменения указанных показателей зависит от дозы ФД воздействия.
ФДД приводит к снижению общего содержания РНК в теле особей Drosophila melanogaster при применении концентрации «Фотогема» в трофическом субстрате 11,5 мг/мл и более и экспозиционнрй дозы облучения 36,0 Дж/см и более.
Половая принадлежность экспериментальных особей Drosophila melanogaster влияет на их устойчивость к деструктивно - ингибирующему влиянию ФДД, т.е. на величины изменения основных морфофизиологических и биохимических показателей. При этом резистентность самок модельного объекта к повреждающему ФДД во всех случаях выше, нем у самцов, что выражается в меньшем снижении указанных показателей у женских особей в сравнении с мужскими при идентичных дозах ФДД.
Совместное, комплексное действие компонентов ФДД приводит к значительно более выраженному уменьшению основных морфофизиологических показателей Drosophila melanogaster: выживаемости, плодовитости, средней массы тела потомства, чем их отдельное влияние.
Различные варианты сочетания компонентов ФДД могут оказывать одинаковое ингибирующее действие на морфофизиологические показатели, если они вызывают идентичные изменения выживаемости. Величина деструктивных изменений морфофизиологических показателей у дрозофилы зависит только от количества первичных повреждающих ФД реакций в биообъекте.
Практическая значимость работы:
Предложенная методика изучения влияния фДД на ряд морфофизиологических и биохимических параметров избранного модельного объекта - Drosophila melanogaster может успешно применяться для сравнения терапевтической эффективности различных ФС перед их клинической апробацией, а также различных режимов и способов проведения сеансов ФДТ, например, разных вариантов сочетаний основных компонентов ФД воздействия. Данная тест — система может способствовать уточнению методики клинического применения метода ФДТ.
Полученные в работе данные могут использоваться в учебном процессе в ВУЗах при изучении радиобиологии неионизирующих излучений, фотобиологии у студентов биологических, экологических и сельскохозяйственных специальностей.
Предложенные методы ФД действия на насекомых могут быть использованы в сельском хозяйстве в качестве физико - химического рпособа борьбы с вредителями культурных растений.
Публикации работы:
Основные результаты; исследования, представленные в диссертационной работе, изложены в 8 публикациях.
Апробация работы:
Основные результаты исследований были доложены и обсуждены на Межрегиональной научно - практической конференции «Река Ока - третье тысячелетие» (Калуга, 2001 г.), на второй международной конференции «Неионизирующие электромагнитные излучения в биологии и медицине (БИО - ЭМИ 2002)» (Калуга, 2002), на научно - практической конференции российских ученых «Актуальные аспекты лазерной медицины» (Москва - Калуга, 2002г.), на третьей международной конференции «Электромагнитные излучения в биологии (БИО - ЭМИ 2005)» (Калуга, 2005), на открытой научно - практической университетской конференции преподавателей КГПУ им. К.Э. Циолковского (Калуга, 2006). Приведённые в диссертации результаты обсуждались на заседании теоретического семинара по вопросам радиобиологии неионизирующих излучений (1999 - 2005). Диссертация апробирована на расширенном заседании кафедры общей биологии КГПУ им. К.Э. Циолковского (2005 г.).
Структура и объем работы:
Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов . и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы, содержащего 208 названий (в том числе 74 иностранных), приложения. Работа включает 31 рисунок и 9 таблиц.
