Введение к работе
Актуальность работы. До настоящего времени одним из основных средств лечения газовой гангрены, вызываемой в подавляющем большинстве случаев Cl.perfringens, Cl.oedematiens и CI.vibrio septicum, являются специфические антитоксические препараты, получаемые из сыворотки крови иммунизированных животных (лошадей).
Ксеногенные антитоксические противогангренозные сыворотки применяются уже более 80 лет. Как и аналогичные сывороточные препараты против других бактериальных токсинов ( а также против укусов змей), за прошедшее время они были в значительной мере усовершенствованы. При этом основное внимание исследователей, наряду с вопросами повышения активности, сосредоточилось на снижении их анафилактогенности. Последнее обусловлено тем, что такие препараты представляли собой комплекс чужеродных для человека белков из сыворотки крови лошади. В этой связи работы по очистке гетерологических антитоксических сывороток проводились практически с начала их применения.
Существенным достижением на этом направлении было применение ферментативного расщепления сывороточных белков пепсином. Это позволило получать менее реактогенные и более очищенные и концентрированные препараты (I.Parfentiev, 1937, С. Роир, 1939, Бейлинсон А.В.1954).
Метод ферментативной очистки антитоксических сывороток в различных вариантах применяется до настоящего времени.
Однако, несмотря на положительные результаты, которые были получены в процессе усовершенствования антитоксических сывороточных препаратов, им присущи еще и определенные недостатки. В первую очередь, это весьма значительное содержание (до 80%) неактивных чужеродных для человека белков, могущих быть причинами нежелательных иммунологических осложнений (И.И.Райхер, 1973).'Кроме того, выпускаемые в России концентрированные и очищенные с помощью пепсина антитоксические сыворотки "Диаферм" контаминированы групповым веществом крови, близким по антигенным характеристикам эритроцитам человека группы А. Наличие его, при введении
препаратов, также может стать причиной иммунологических конфликтов. ( Г. Христова, !968).
Таким образом, проблема получения ксеногенных противогангренозных сывороток повышенной степени очистки остается достаточно актуальной.
В то же время выполнение этой задачи осложняется тем, что примесные белки в противогангренозных сывороточных препаратах (очищенных с помощью ферментолиза) являются теми же молекулами F/aB/2-фрагментов иммуноглобулинов, но не имеют направленности противогангренозных антител. Поэтому удаление их с помощью физико-химических методов практически невозможно.
Единственным путем, в данном случае, может быть разделение иммуноглобулинов по специфичности с помощью иммуносорбции.
Приложение упомянутого метода к очистке гетерологи-ческих противогангренозных сывороточных препаратов и составляет основную задачу настоящей работы.
Цель работы. Экспериментальное и методическое обоснование иммуносорбционного выделения F/aB/2-фрагментов противогангренозных антитоксинов перфрингенс, эдематиенс и вибрио септикум с помощью поливалентного иммуносорбента. Характеристика физико-химических и иммунологических свойств полученного комплекса аффинно очищенных антитоксинов в сравнении с антитоксинами поливалентной противогангренозной сыворотки " Диаферм".
Основные задачи исследований.
-
Разработка иммуносорбентов на основе геля гидроокиси алюминия и гангренозных анатоксинов перфрингенс, эдематиенс и вибрио септикум и выделение соответствующих антител, а также проверка кратности использования иммуносорбентов.
-
Разработка трехвалентного иммуносорбента на основе геля гидроокиси алюминия и смеси трех гангренозных анатоксинов.
-
Выделить с помощью трехвалентного иммуносорбента комплекс аффино очищенных F/ав/ 2-фрагментов гангренозных антител.
-
Подобрать способ концентрации элюатов антител.
5. Изучить иммунологические свойства (протективные,
анафилактические, токсические), полученного комплексного
антитоксина и присутствие в нем группоспецифического вещества
крови типа А+Н в сравнении с коммерческой поливалентной
противогангренозной сывороткой "Диаферм".
6. Провести лиофилизацию комплекса противоган
гренозных антител.
Научная новизна и практическая ценность. Впервые на основе геля гидроокиси алюминия и соответствующих анатоксинов разработан оригинальный трехвалентный иммуносорбент для бдномоментного выделения комплекса противогангренозных антител (авторское свидетельство N 1370841). С помощью такого иммуносорбента одномоментно выделен комплекс F/aB/2-фрагмен тов антител, по удельной активности в 2-3 раза превосходящий антитоксины коммерческой поливалентной противогангренозной сыворотки "Диаферм". Показано, что очищенный антитоксин свободен от групповых веществ крови, имеет сниженные анафилак-тогенные свойства. Установлена возможность лиофилизацня очищенных антител.
Положения, выносимые на защиту.
1. Разработка принципа одновременного выделения
комплекса аффинно очищенных F/aB/2-фрагментов противо
гангренозных антител(п/перфрингенс, п/эдематиенс и п/вибрио
септикум) с использованием трехвалентного иммуносорбента.
2. Иммунологическая характеристика комплекса аффинно
очищенных F/aB/2-фрагментов противогангренозных антител в
сравнении с коммерческими антитоксическими поливалентными
противогангренозньши сыворотками "Диаферм".
Апробация работы. Основные материалы исследования были представлены на итоговых научных конференциях Пермского НИИВС в 1983, 1985, 1987, 1990, гг.; на научной конференции Ташкенского НИИВС в 1986 г., на межлабораторном совещании института экологии, и генетики микроорганизмов Ур.О РАН в 1997 г.
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 10 работ и получено одно авторское
свидетельство.
Структура работы. Работа состоит из введения, пяти глав и заключения, выводов и приложения. Глава 1 содержит обзор литературы. В главе 2 описаны материалы и методы. Глава 3 посвящена получению моновалентных аффинно очищенных противогангренозных антитоксинов. Глава 4 содержит материалы по очистке комплекса противогангренозных F/ав/г-фрагментов антител на поливалентном иммуносорбенте. Глава 5 посвящена исследованиям иммунологических свойств комплекса аффинно очищенного противогангренозного антитоксина. Список литературы включает 212 источников. Приложение включает акт испытания препарата и отчет о проведении доклинического испытания препарата F/aB/2-фрагментов антител. Работа изложена на 99 страницах, содержит 26 рисунков и 20 таблиц.
