Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 17
2.1 Исходное сырье для получения сорбентов 17
2.2 Технологии получения сорбционных материалов 18
2.3 Современные сорбционные материалы в медицине и ветеринарии.. 21
2.4 Особенности структуры и физико-химические свойства углеродных сорбентов 35
2.5 Углерод-углеродные композиционные материалы – новое поколение гемо- и энтеросорбентов 39
2.6 Модифицирование - эффективный способ регулирования адсорбционных свойств сорбентов по отношению к токсичным веществам различной природы 47
2.6.1 Направления и методы синтеза модифицированных гемосорбентов, энтеросорбентов, аппликационных материалов 47
2.6.2 Модификаторы. Основные физико-химические и медико биологические свойства 59
2.7 Процессы сорбции в биологических жидкостях и их моделирование 68
2.8 Заключение к обзору литературы 72
3. Собственные исследования 76
3.1 Материалы и методы исследования 76
3.2 Выбор модификаторов 101
3.3 Получение модифицированных энтеросорбентов биоспецифического действия 95
3.4 Физико-химические характеристики модифицированных энтеросорбентов 114
3.4.1 Исследование рельефа и морфологии углеродных сорбентов 114
3.4.2 Изучение фазового состава углеродных сорбентов 118
3.4.3 Текстурные характеристики сорбентов 122
3.4.4 Элементный состав на поверхности образцов рентгеноструктурным анализом 124
3.4.5 Элементный состав образцов в объеме на анализаторе СHNОS 127
3.4.6 Качественный состав поверхностных функциональных групп методом ИК-спектроскопии 129
3.4.7 Качественный состав поверхностных функциональных групп методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии 137
3.4.8 Титриметрическое определение общего азота и кислородсодержащих групп 146
3.4.9 Исследование адсорбционных свойств сорбентов по отношению к веществам, моделирующим токсичные соединения (метиленовому голубому, витамину В12, белкам-маркерам) 147
3.4.10 Изучение десорбции модификатора с поверхности модифицированных образцов углеродного сорбента 158
3.5 Фармакотоксикологические испытания ветеринарного препарата «Бетулин в углеродной микросфере» 163
3.5.1 Изучение острой токсичности композиционного ветеринарного препарата «Бетулин в углеродной микросфере» на лабораторных животных 163
3.5.2 Определение острой токсичности ветеринарного препарата «Бетулин в углеродной микросфере» на цыплятах 168
3.5.3 Изучение хронической токсичности композиционного ветеринарного препарата «Бетулин в углеродной микросфере» на лабораторных животных 175
3.5.3.1 Клинический статус животных в условиях эксперимента 176
3.5.3.2 Картина периферической крови контрольных и опытных крыс 177
3.5.3.3 Отдаленные эффекты действия препаратов. Оценка их потенциальной опасности 182
3.5.4 Иммунокорригирующие свойства углеродного энтеросорбента «Бетулин в углеродной микросфере» 186
3.5.5 Применение композиционного ветеринарного препарата «Бетулин в углеродной микросфере» для крупного рогатого скота после противопаразитарной обработки Аверсектом-2 188
3.6 Иммунокорригирующие свойства энтеросорбента, модифицированного полиаргинином 194
3.6.1 Биохимические показатели крови крупного рогатого скота и крыс при обработке неостомозаном и энтеросорбции с применением сорбента, модифицированного полиаргинином 194
3.6.2 Гематологические показатели крови и неспецифическая резистентность крупного рогатого скота и крыс при обработке неостомозаном и назначении сорбента, модифицированного полиаргинином 197
3.6.3 Цитологическая и патоморфологическая характеристика органов иммунной системы крыс при воздействии неостомозана и модифицированного полиаргинином углеродного сорбента 204
3.6.4 Оценка адсорбционных свойств сорбента, модифицированного полиаргинином, по отношению к провоспалительным цитокинам 205
3.6.5 Применение энтеросорбента, модифицированного полиаргинином, при остром отравлении пестицидами 209
3.7. Обоснование механизма взаимодействия модифицированных энтеросорбентов с токсичными веществами 213
3.8. Перспективные углеродные материалы, модифицированные биологически активными веществами
4. Обсуждение результатов исследования 230
5. Заключение 248
6. Выводы 250
7. Практические рекомендации 253
Список сокращений 256
Список литературы
- Углерод-углеродные композиционные материалы – новое поколение гемо- и энтеросорбентов
- Физико-химические характеристики модифицированных энтеросорбентов
- Изучение десорбции модификатора с поверхности модифицированных образцов углеродного сорбента
- Обоснование механизма взаимодействия модифицированных энтеросорбентов с токсичными веществами
Введение к работе
Актуальность темы исследован ним из путей достижения прогресса в
современных отраслях народного ________тва, в том числе в производстве
лекарственных средств являются нанотехнологии (А.В. Иванов и др. 2008, 2009, Г.В. Назаров и др., 2009; В.А. Антипов, А.Н. Трошин, 2015).
Актуальной задачей бионанотехнологии является разработка полезных материалов для медицины и ветеринарии на основе нанодисперсного углерода (продукта термического разложения углеводородного сырья нефтяного и каменноугольного происхождения и природного газа). Исходным материалом в генезисе нефти и газа являются органические осадки крупных водоемов (планктон, водоросли, микроорганизмы, мелкие животные), которые, погибая, образуют слой донного ила. По мере его уплотнения ускоряются биохимические процессы, способствующие образованию газообразных и жидких углеводородов.
Применение сорбентов в медицине и ветеринарии направлено на нейтрализацию негативного воздействия эндо- и экзотоксинов на организм человека и животных (К.Х. Папуниди и др., 2010; Y. Nakamura et all, 2007). Различные нарушения «биохимического гомеостаза» не могут не отразиться на системах защиты организма: органах детоксикации, экскреции, иммунитета. «Токсический прессинг» вызывает каскад последующих расстройств, с которыми организм уже не может справиться самостоятельно или с помощью медикаментозной терапии. Это приводит к развитию состояния хронической интоксикации, усугубляющей течение патологических процессов.
Для достижения эффективности терапии необходимо провести санацию внутренней среды, снизить токсическую нагрузку на органы иммунной системы, вывести из организма токсины, что достигается различными методами сорбционной терапии. Наиболее распространенными методами являются гемо- и энтеросорбция, очищение плазмы и лимфы (плазмосорбция, лимфосорбция), аппликационное применение сорбентов (вульнеросорбция) (Н.А. Беляков, 1991; Н.Н. Калинин, 2006; З.А. Канарская и др. 2011; Ю.М. Лопухин и др., 1985).
Углеродные сорбенты относятся к неселективным материалам, способным сорбировать широкий спектр веществ. Они перспективны в качестве материалов для создания биоспецифических сорбентов, что обусловлено их уникальными свойствами. Химическое модифицирование углеродных материалов биологически активными веществами, функциональными группами применяют как способ повышения адсорбционных свойств сорбентов по отношению к эндо- и экзотоксинам. С помощью вариации количества групп и их химической природы можно целенаправленно изменить физико-химические свойства углеродных сорбентов, расширяя тем самым сферу их применения (В.Ф. Суровикин и др., 2007).
Степень разработанности проблемы. Энтеросорбция относится к методам эфферентной терапии, основанным на связывании и выведении из желудочно-кишечного тракта токсинов различной природы (В.Г. Николаев и др., 2007; К.Х. Папуниди, 2010; М.Я. Тремасов и др., 2012, 2013). Основной механизм действия сорбционных препаратов основан на связывании токсических веществ в
желудочно-кишечном тракте путем адсорбции, абсорбции, ионного обмена, комплексообразования. Известны энтеросорбенты различной структуры и происхождения (Н.А. Беляков, 1991; В.Г. Николаев, 2007).
Применяемые в настоящее время сорбенты обладают недостаточной сорбционной емкостью, низкой механической прочностью, высоким содержанием минеральных примесей (золы), ограниченным спектром показаний к применению (Н.А. Беляков, 1991).
В связи с этим актуальной задачей является создание новых эффективных модифицированных углеродных сорбентов для детоксикации организма человека и животных, не оказывающих на них отрицательного воздействия, удобных в практическом применении для лечения широкого спектра заболеваний, а также позволяющих повысить качество продуктов питания животного происхождения.
В работе для химического модифицирования поверхности углеродных сорбентов с целью повышения их биоспецифических свойств предполагается применить метод поликонденсации биологически активных веществ (аргинина) и образования полимеров «in situ» (непосредственно на поверхности углеродных сорбентов). В настоящее время подобные процессы практически не изучены. Результаты этих исследований приведены в данной работе.
Цель и задачи исследования. Целью исследования явилась разработка модифицированных биологически активными веществами сорбентов ветеринарного назначения на основе нанодисперсного углерода, изучение их физико-химических и фармакотоксикологических свойств с последующим внедрением в практику ветеринарной медицины.
Для достижения цели поставлены следующие задачи:
1.Определить основные требования к свойствам исходного углеродного материала (носителя) и модифицирующим веществам для получения углеродных энтеросорбентов с биоспецифическими свойствами.
2.Разработать способы химического модифицирования исходного углеродного энтеросорбента и определить параметры модифицирования, позволяющие изменять его физико-химические свойства.
3.Исследовать физико-химические характеристики полученных углеродных сорбентов: химический состав, пористую структуру, кислотно-основные и адсорбционные свойства.
4.Изучить острую и хроническую токсичность модифицированных
биологически активными веществами сорбентов в опытах на лабораторных животных и цыплятах.
5. Оценить степень риска отдаленных неблагоприятных эффектов при
введении препаратов беременным самкам крыс.
6. Обосновать иммунокорригирующее действие модифицированных бетулином
и полиаргинином энтеросорбентов при противопаразитарной обработке животных.
7.Разработать методические рекомендации по применению модифицированных энтеросорбентов в практике ветеринарной медицины.
Научная новизна результатов исследований. В процессе исследования получены новые научные данные теоретического и прикладного характера.
Определены основные требования к свойствам носителя и модификаторам для получения биоспецифических углеродных энтеросорбентов. Разработаны способы модифицирования биологически активными веществами углеродных сорбентов.
Исследованы физико-химические характеристики углеродных сорбентов:
химический состав, текстурные характеристики, кислотно-основные и
адсорбционные свойства. Установлены закономерности их изменения в процессе модифицирования. Доказано, что нанесение бетулина на сорбент приводит к локальному распределению его мелкодисперсных частиц на поверхности и в порах, а при нанесении аргинина на углеродную поверхность образуется локально распределенная полимерная пленка. При модифицировании уменьшаются удельная площадь поверхности и общий объем пор, при этом существенных различий в структуре исходного и модифицированных образцов не установлено. Элементный анализ показал повышение содержания кислорода в образцах, модифицированных бетулином, до 1,25±0,06% и полиаргинином - до 4,78±0,04% против 0,96±0,07% в исходном образце. Содержание общего азота в образце, модифицированном полиаргинином, достигает 3,12±0,62%. Это связано с наличием групп -NH, -NH2 в молекуле модификатора.
С использованием метода ИК-спектроскопии доказано, что импрегнирование углеродного сорбента бетулином происходит со значительным увеличением полос поглощения, соответствующих колебаниям связи С-О в спиртах и фенолах. При модифицировании углеродного сорбента полиаргинином происходит изменение интенсивности полос поглощения, соответствующих колебаниям связей С-О и C-N. Появление полосы поглощения при 1651 см-1 соответствует как ассиметричным деформационным колебаниям NH3+, так и группе С=О, сопряженной с ароматическим кольцом. В результате модифицирования аргинином изменяется состав поверхностных функциональных групп углеродного энтеросорбента.
При фармакотоксикологическом исследовании модифицированных сорбентов установлено, что композиционный ветеринарный препарат «Бетулин в углеродной микросфере» является малотоксичным препаратом. Однократное введение препарата «Бетулин в углеродной микросфере» в дозе 9000 мг/кг не вызывает клинических признаков интоксикации у лабораторных животных, не оказывает гематотоксических эффектов. У беременных крыс доза препарата 200 мг/кг не вызывает изменений, свидетельствующих о наличии эмбриотоксических и тератогенных эффектов, независимо от периода эмбриогенеза.
Доказана возможность применения углеродного энтеросорбента «Бетулин в углеродной микросфере» для коррекции иммунной реактивности животных.
В эксперименте на крысах установлено, что введение углеродного сорбента, модифицированного полиаргинином, в дозе 400 мг/кг в течение 5 дней нормализует миграцию зрелых лимфоцитов из тимуса после противопаразитарной обработки неостомозаном и повышает пролиферативную активность клеток лимфоидного ряда.
На фоне интоксикации процесс энтеросорбции с применением сорбента, модифицированного аргинином, приводит к снижению в крови крыс количества провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-8, ФНО-) и острофазного белка – лактоферрина.
Приоритет и новизна исследований подтверждены патентами на изобретения (№ 2477125 «Композиционный ветеринарный препарат и способ его получения», зарегистрировано в гос.реестре изобретений РФ от 10.03.2013 и № 2534805 «Способ модифицирования углеродного гемосорбента», зарегистрировано в гос.реестре изобретений РФ от 07.10.2014).
Теоретическая и практическая значимость работы. Настоящая работа относится к области фундаментальных и прикладных знаний. Исследования актуальны как в теоретическом отношении (разработка научных основ химического модифицирования углеродных материалов), так и в практическом плане (создание биоспецифических углеродных сорбентов ветеринарного назначения).
Изучено влияние биологически активных веществ, используемых в качестве
модификаторов, на изменение химической природы поверхности, пористой
структуры и адсорбционных свойств углеродных сорбентов. Выявлены
закономерности, описывающие адсорбцию токсических веществ
модифицированными сорбентами в модельных условиях и реальных системах.
Разработана и утверждена в установленном порядке нормативная
документация: технические условия (ТУ 9318-032-71069834-2011) Препарат
ветеринарный «Бетулин в углеродной микросфере», уточненный временный
технологический регламент производства опытных партий ветеринарного препарата
«Бетулин в углеродной микросфере» ТР 71069834-35-2011, производственная
инструкция по эксплуатации опытной установки получения ветеринарного
препарата «Бетулин в углеродной микросфере», инструкция по эксплуатации
опытного технологического стенда для получения ветеринарного препарата
«Бетулин в углеродной микросфере» на основе нанопористого углеродного
носителя, технические условия (ТУ 9318-045-71069834-2014) «Энтеросорбент
углеродный с полиаргинином». Получена лицензия Федеральной службы по
ветеринарному и фитосанитарному надзору РФ на производство лекарственных
средств ветеринарного применения № 00-15-1-002530 от 02.09.2015 г. Для
специалистов ветеринарной службы изданы методические рекомендации
«Применение модифицированных биологически активными веществами сорбентов
в ветеринарной медицине», одобренные секцией животноводства Центра научного
обеспечения АПК при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия
Омской области (протокол № 5 от 14.10.2015 г.).
Композиционный ветеринарный препарат «Бетулин в углеродной микросфере» награжден медалью и дипломом на Х Международной специализированной выставке «Мир биотехнологий», г. Москва 20-22 марта 2012 г. и медалью на 14 Международном форуме и выставке «14-е Высокие технологии XXI века», г. Москва 24-26 апреля 2013 года.
Углеродный энтеросорбент, модифицированный полиаргинином, в номинации «Биотехнология в животноводстве и ветеринарии» награжден медалью и дипломом на ХII Международной специализированной выставке «Мир биотехнологий», г. Москва 18-20 марта 2014 г.
Композиционный ветеринарный препарат «Бетулин в углеродной микросфере» и «Энтеросорбент углеродный с полиаргинином» введены в перечень защищенных патентами конкурентоспособных лекарственных средств и медицинских изделий
российского производства, целесообразных к экспорту на зарубежные рынки (письмо Министерства промышленности и торговли РФ № ЦС-46106/19 от 30.10.2015 г.).
Методология и методы исследования. В диссертационной работе
использован комплекс общенаучных и частных специальных методов исследования. Первые предусматривали применение совокупности общетеоретических и эмпирических методов исследования, таких как системный подход, анализ, эксперимент, измерение, сравнение. Из частных специальных методов исследования использованы электронно-микроскопические (электронный микроскоп JSM–6460 LV, «JEOL», Япония), рентгеноспектральные (порошковый рентгеновский дифрактометр D8 Advance, «Bruker», Германия; энергодисперсионный спектрометр EDAX, «EDAX», Япония; рентгеновский фотоэлектронный спектрометр ES-300 Kratos Analytical, США), спектрофотометрические (спектрофотометр CECIL-1021, “Cecil Instruments Limitid”, США), аналитические (объемная статическая вакуумная установка Sorptomatic-1900, «Carlo Erba», Италия; экспресс-анализатор Gemini 2380, «Micromeritics», США; элементный анализатор Vario EL Cube «Elementar», Германия; ИК-спектрометр Nicolet-IR5700, «Intertech Corporation», США; хромато-масс-спектрометр Agilent Technologies 6890/5973N, Agilent, США), иммунологические (планшеточный фотометр Multiscan EX, Финляндия), а также другие методы исследования, выполненные на современном научном оборудовании Омского регионального центра коллективного пользования СО РАН (г. Омск), Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института катализа им. Г.К. Борескова Сибирского отделения Российской академии наук (ИК СО РАН, г. Новосибирск) и института ветеринарной медицины и биотехнологии ФГБОУ ВО ОмГАУ им. П.А. Столыпина (г. Омск).
Положения, выносимые на защиту:
1.Биотехнология мезопористого углеродного сорбента с бетулином
предусматривает перевод бетулина в водорастворимое состояние с последующим импрегнированием в пористую углеродную матрицу, полученную из пористого углеродного материала с последующей гидромеханической обработкой.
2.Биотехнология мезопористого углеродного сорбента, модифицированного полиаргинином, включает в себя двойную пропитку сорбента L-аргинином с последующей поликонденсацией модификатора на поверхности сорбента в инертной среде, что увеличивает количество поверхностных функциональных групп, взаимодействующих с провоспалительными цитокинами.
3.Модифицированные биологически активными веществами углеродные энтеросорбенты являются малотоксичными для лабораторных животных и цыплят. При ежедневном введении в дозах 200, 500 и 1000 мг/кг в течение 14 дней не изменяют клинический статус животных. Введение беременным самкам крыс терапевтической дозы на протяжении всей беременности не вызывает изменений, свидетельствующих о наличии эмбриотоксических и тератогенных эффектов.
4.Модифицированные энтеросорбенты проявляют иммунокорригирующие свойства при угнетении иммунной реактивности животных, снижают уровень провоспалительных цитокинов в плазме крови, что расширяет спектр показаний к проведению энтеросорбции в клинической практике.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность
результатов исследований обусловлена значительным объемом экспериментов, связанных с синтезом и испытанием новых углеродных модифицированных материалов, использованием высокоинформативных методов исследования в лабораторных и производственных условиях с применением статистической обработки цифровых данных.
Основные результаты диссертационной работы доложены и одобрены на
Международной научно-производственной конференции по актуальным проблемам
агропромышленного комплекса (Казань, 2004); Сибирском Международном
ветеринарном конгрессе "Актуальные вопросы ветеринарной медицины"
(Новосибирск, 2005); Международной научно-практической конференции
"Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных" (Троицк, 2005); 2-d Russian-Chinese international scientific conference on pharmacology (Пермь, 2006); 4th International Symposium on Carbon for Catalysis (Dalian, China, 2010); Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011, 2012, 2013, 2014, 2015, 2016); XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011); Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные проблемы теории адсорбции, пористости и адсорбционной селективности» (Москва-Клязьма, 2011, 2012, 2013, 2014, 2015); II Международном конгрессе ветеринарных фармакологов и токсикологов (Санкт-Петербург, 2012); Белорусско-Российском семинаре «Углеродные материалы: характеризация и применение» (Минск, 2013); Всероссийской конференции с международным участием «Жизнеобеспечение при критических состояниях» (Москва, 2012, 2013, 2014); Научном семинаре, посвещенном 45-летию ВНИИТУ и памяти его организатора В.Ф. Суровикина (Омск, 2014); III Международном конгрессе ветеринарных фармакологов и токсикологов «Эффективные и безопасные лекарственные средства в ветеринарии» (Санкт-Петербург, 2014); II Российском конгрессе по катализу (Самара, 2014); Международной междисциплинарной конференции «Современные решения исследований природных, синтетических и биологичских материалов» (Санкт-Петербург, Петергоф, 2014); V семинаре памяти профессора Ю.И. Ермакова (Республика Алтай, 2015).
Публикации. По результатам диссертационного исследования опубликовано 47 научных работ, в том числе 18 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, 2 патента, методические рекомендации для специалистов ветеринарной службы 2 монографии.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 301 странице компьютерного текста и включает разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследования, заключение, выводы, практические рекомендации, приложения. Работа иллюстрирована 37 таблицами, 72 рисунками. Список цитируемой литературы содержит 418 источников, в том числе иностранных авторов - 118.
Углерод-углеродные композиционные материалы – новое поколение гемо- и энтеросорбентов
Исследованы физико-химические свойства углеродных сорбентов: химический состав, текстурные характеристики, кислотно-основные и адсорбционные свойства. Установлены закономерности их изменения в процессе модифицирования. Доказано, что нанесение бетулина на сорбент приводит к локальному распределению его мелкодисперсных частиц на поверхности и в порах, а при нанесении аргинина на углеродную поверхность образуется локально распределенная полимерная пленка. При модифицировании уменьшаются удельная площадь поверхности и общий объем пор, при этом существенных различий в структуре исходного и модифицированных образцов не установлено. Элементный анализ показал повышение содержания кислорода в образцах, модифицированных бетулином, до 1,25±0,06% и полиаргинином - до 4,78±0,04% против 0,96±0,07% в исходном образце. Содержание общего азота в образце, модифицированном полиаргинином, достигает 3,12±0,62 %. Это связано с наличием групп -NH, -NH2 в молекуле модификатора.
С использованием метода ИК-спектроскопии доказано, что импрегнирование углеродного сорбента бетулином происходит со значительным увеличением полос поглощения, соответствующих колебаниям связи С-О в спиртах и фенолах. При модифицировании углеродного сорбента полиаргинином происходит изменение интенсивности полос поглощения, соответствующих колебаниям связей С-О и C-N. Появление полосы поглощения при 1651 см-1 соответствует как ассиметричным деформационным колебаниям NH3+, так и группе С=О, сопряженной с ароматическим кольцом. В результате химического модифицирования выбранной аминокислотой происходят изменения в составе функциональных групп на поверхности углеродного сорбента.
При фармакотоксикологическом исследовании модифицированных сорбентов установлено, что композиционный ветеринарный препарат «Бетулин в углеродной микросфере» является малотоксичным препаратом. Однократное введение препарата «Бетулин в углеродной микросфере» в дозе 9000 мг/кг не вызывает клинических признаков интоксикации у лабораторных животных, не оказывает гематотоксических эффектов. У беременных крыс доза препарата 200 мг/кг не вызывает изменений, свидетельствующих о наличии эмбриотоксических и тератогенных эффектов, независимо от периода эмбриогенеза.
Доказана возможность применения углеродного энтеросорбента «Бетулин в углеродной микросфере» для коррекции иммунной реактивности животных. В эксперименте на крысах установлено, что введение углеродного сорбента, модифицированного полиаргинином, в дозе 400 мг/кг в течение 5 дней нормализует миграцию зрелых лимфоцитов из тимуса после противопаразитарной обработки неостомозаном и повышает пролиферативную активность клеток лимфоидного ряда. На фоне интоксикации процесс энтеросорбции с применением сорбента, модифицированного аргинином, приводит к снижению в крови крыс количества провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-8, ФНО-) и острофазного белка – лактоферрина. Приоритет и новизна исследований подтверждены патентами на изобретения (№ 2477125 «Композиционный ветеринарный препарат и способ его получения», зарегистрировано в гос.реестре изобретений РФ от 10.03.2013 и № 2534805 «Способ модифицирования углеродного гемосорбента», зарегистрировано в гос.реестре изобретений РФ от 07.10.2014).
Теоретическая и практическая значимость работы. Настоящая работа относится к области фундаментальных и прикладных знаний. Исследования актуальны как в теоретическом отношении (разработка научных основ химического модифицирования углеродных материалов), так и в практическом плане (создание биоспецифических углеродных сорбентов ветеринарного назначения).
Изучено влияние биологически активных веществ, используемых в качестве модификаторов, на изменение химической природы поверхности, пористой структуры и адсорбционных свойств углеродных сорбентов. Выявлены закономерности, описывающие адсорбцию токсических веществ модифицированными сорбентами в модельных условиях и реальных системах.
Разработана и утверждена в установленном порядке нормативная документация: технические условия (ТУ 9318-032-71069834-2011) Препарат ветеринарный «Бетулин в углеродной микросфере», уточненный временный технологический регламент производства опытных партий ветеринарного препарата «Бетулин в углеродной микросфере» ТР 71069834-35-2011, производственная инструкция по эксплуатации опытной установки получения ветеринарного препарата «Бетулин в углеродной микросфере», технические условия (ТУ 9318-045-71069834 2014) «Энтеросорбент углеродный с полиаргинином». Получена лицензия Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору РФ на производство лекарственных средств ветеринарного применения № 00-15-1-002530 от 02.09.2015 г. Для специалистов ветеринарной службы изданы методические рекомендации «Применение модифицированных биологически активными веществами сорбентов в ветеринарной медицине», одобренные секцией животноводства Центра научного обеспечения АПК при Министерстве сельского хозяйства и продовольствия Омской области (протокол № 5 от 14.10.2015 г.).
Физико-химические характеристики модифицированных энтеросорбентов
В качестве окисляющих газов применяются углекислый газ либо водяной пар, при этом протекают следующие реакции: С + С02 = 2СО С + Н20 = СО + Н2 Активация воздухом на практике из-за высокой экзотермичности и, как следствие, возможности развития неконтролируемого процесса «загорания» применяется редко. Взаимодействие кокса с газообразными окислителями при активации ведет к частичному выгоранию углерода, которое характеризуется степенью обгара. Пористая структура в большей степени зависит от текстуры исходного кокса, размеров его частиц, степени обгара, наличия минеральных примесей. При небольших степенях обгара (до 50%) образуются преимущественно микропоры, увеличение степени обгара приводит к появлению более широких мезо- и макропор.
Также в качестве газов-активаторов могут использоваться смеси кислорода с различными газами, сернистый газ и др. [158,194].
Химическая активация проводится при температуре 200-800С. Уголь обрабатывают растворами карбонатов, сульфатов, нитратов, хлоридов (в частности, хлорида цинка), азотной, серной, фосфорной кислотами. Важным показателем химической активации является степень пропитки материала. Выбор оптимальных условий пропитки обеспечивает получение адсорбента с заданной пористой структурой.
Термообработка пропитанного вышеуказанными солями или кислотами углеродного материала приводит к разложению химических реагентов с образованием окисляющих газов (СО2, S02, N02, Cl2) , которые диффундируют в поры карбонизованного материала. При этом в первую очередь окисляется менее плотная его часть (аморфный углерод), образуя поры молекулярных размеров нерегулярного строения. В последующем выгорают плоскости конденсированных ароматических колец в углеродных кристаллитах, образуя щелевидные поры [190]. Для получения формованных пористых углеродных материалов полукокс или кокс смешивают со связующим (нефтяным пеком, смолой, полимерами с низкими температурами размягчения) с последующей формовкой, сушкой и термообработкой [271].
Получаемые по традиционной технологии активные угли обладают в основном микропористой структурой, ограничивающей их адсорбционную активность по отношению к веществам с молекулярной массой более 500 Да. Гранулы углей имеют произвольную форму и шероховатый рельеф поверхности; они непрочные, при гемосорбции разрушаются с выделением в кровь тонкой пыли. Такой характер поверхности приводит к травмированию клеток крови, после контакта с сорбентом количество тромбоцитов и лейкоцитов снижается до 80%. Угли содержат в большом количестве минеральные примеси (соединения калия, кальция, натрия, магния, железа, алюминия, кремния), которые не только ухудшают адсорбционные и структурные свойства угля, но и могут переходить в кровь [119,222,265]. Поэтому подготовка активного угля для медицины включает и стадию деминерализации для снижения содержания минеральных примесей. Деминерализацию осуществляют обработкой углей кислотами – соляной, серной, плавиковой с последующей промывкой и обработкой щелочами для нейтрализации [265]. Введение в технологию стадии деминерализации позволило улучшить качества угля, но не влияет на его пористую структуру. Сложившаяся ситуация инициировала проведение исследований, направленных на создание новых сорбентов высокого качества на основе специальных видов сырья и технологий.
Использование сорбционных материалов в медицине и ветеринарии открывает возможности адсорбции, ионного обмена, комплексообразования), получения новых знаний в области химии твердого тела при контакте с биологическими жидкостями, развития представлений о взаимодействиях на поверхности границ раздела фаз сорбента (твердая фаза) и раствора биологически активных соединений (жидкая фаза). Гемосорбенты В связи с для разработки и создания новых сорбентов для научных исследований процессов сорбции (отсутствием сорбентов, отвечающих медицинским требованиям, были организованы научные исследования, направленные на разработку сорбентов высокого качества с использованием специальных видов сырья и новых технологий.
Гемосорбенты можно условно разделить на два основных класса в зависимости от преобладающего типа взаимодействия в системе «извлекаемое вещество – сорбент»: 1 - нейтральные сорбенты (силикагели, нейтральные сополимеры, не обладающие ионогенными группами); 2 - ионообменные сорбенты (органические и неорганические иониты синтетического и минерального происхождения) [107,119].
Изучение десорбции модификатора с поверхности модифицированных образцов углеродного сорбента
На основе этих пористых углеродных материалов под руководством заслуженного химика РСФСР, лауреата Ленинской премии, доктора технических наук, профессора В.Ф. Суровикина были созданы сорбенты медицинского назначения: гемосорбент углеродный в физиологическом растворе стерильный ВНИИТУ-1, энтеросорбент углеродный ВНИИТУ-2 и энтеросорбент углеродный Зоокарб [114,252,265].
На первой стадии синтеза, проводимой в скоростном газовом потоке при температуре 1250-1500С, из жидких углеводородов образуются нанодисперсные псевдосферические углеродные частицы размером 40-60 нм (частицы сажи), при этом выделяются минеральные примеси и удаляются зольные компоненты при использовании специальных устройств и обессоленной закалочной воды.
Эти наночастицы, объединяемые в агрегаты углерод-углеродными связями при гранулировании с применением связующего вещества, образуют углеродный каркас сферической формы (рис. 5).
На второй стадии в результате реакции разложения пропана, бутана и других газообразных углеводородов на поверхности углеродных наночастиц при температуре 750-900С получается гранулированный углерод-углеродный композит, состоящий из нанодисперсных углеродных частиц и пироуглерода (рис. 5, процесс 1).
На третьей стадии этот композит подвергается активации водяным паром при 700-950С, превращаясь в мезопористый углеродный материал, получивший название «Сибунит» (аббревиатура от «Сибирский Углеродный Носитель») (рис. 5, процессы 2-5) [238,265].
Технологический процесс получения медицинского сорбента из «Сибунита» включает операции, направленные на придание ему совместимости с кровью, стерильности и апирогенности.
Основной операцией является пневмогидромеханическая обработка этого материала в режиме псевдоожижженного слоя. Эта операция позволяет удалить с поверхности и пор сорбента пылевидные углеродные частицы, довести рН сорбента до физиологических норм, повысить общую прочность гранул за счет разрушения «слабых» гранул и удалить возможные неровности поверхности («шлифовка» гранул) [144].
Последующими технологическими операциями являются: сушка сорбента, стерилизация воздухом при 200С, упаковка в медицинские флаконы с физиологическим раствором, стерилизация паром. Новое направление получения углеродных сорбентов было лишено недостатков, характерных для других способов их получения. Оно позволило получить мезопористые углеродные сорбенты, селективно удаляющие токсины средней молекулярной массы, полностью соответствующие требованиям медицины. Гемосорбент углеродный ВНИИТУ-1 Многочисленные испытания позволили определить основные свойства гемосорбента углеродного ВНИИТУ-1 и оценить его эффективность в сравнении с другими углеродными гемосорбентами, применяемыми в медицине (регистрационное удостоверение ФСР № 2008/03492 от 25.09.2012).
Гемосорбент углеродный ВНИИТУ-1 – изделие медицинского назначения. Он имеет высокую химическую чистоту (содержание углерода не менее 99,5%), гладкую поверхность гранул сферической формы размером 0,5-1,0 мм (табл. 2-4). Отличительные свойства данного изделия – практически полное отсутствие пыли на поверхности и в порах, высокая прочность гранул, мезопористая структура с преобладающим размером пор 50-60 нм, высокая адсорбционная активность по отношению к токсичным веществам с низкой и средней молекулярной массой. Присутствие небольшого количества макропор на поверхности ВНИИТУ-1 позволяет сорбировать вещества с высокой молекулярной массой. Снижена способность сорбента к травмированию клеток крови. Практическое применение показало, что снижение количества тромбоцитов и лейкоцитов в крови после контакта с сорбентом не превышает 10-15% от исходного уровня [144].
Обоснование механизма взаимодействия модифицированных энтеросорбентов с токсичными веществами
Для определения адсорбционной способности сорбента к навеске образца 0,2000 ± 0,0002 г добавляли 2 мл раствора белка с концентрацией вещества от 0,150±0,030 до 2,400±0,050 мг/мл и измеряли количество адсорбата в растворе по истечении 24 ч после контакта. Концентрацию веществ в растворе определяли до и после проведения адсорбции при соответствующей длине волны. Рассчитывали значения статической обменной емкости и полученные данные вносили в таблицу значений.
Испытания сорбентов проводили по разработанным методикам на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории Омского государственного медицинского университета Министерства здравоохранения РФ (ЦНИЛ ОмГМУ Минздрава РФ). Изучение адсорбционных свойств образцов исследовали по отношению к цитокинам (интерлейкину 6 - ИЛ-6, интерлейкину 8 – ИЛ-8, фактор некроза опухоли). Испытания проводили с использованием плазмы крови лабораторных животных [157]. Концентрацию провоспалительных цитокинов в плазме крови определяли до и после ее контакта с образцом энтеросорбента. Уровни интерлейкинов определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на планшеточном фотометре «Multiscan EX» (Финляндия) с использованием наборов реагентов Pro Con IL-6, Pro Con IL-8 (ООО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург) методом твердофазного ИФА [125,126]. Изучение десорбции бетулина с поверхности модифицированных образцов углеродного сорбента. Десорбция биологически активных веществ с поверхности углеродного сорбента – сложный многоступенчатый процесс, протекающий под воздействием нескольких факторов (рН среды, температуры). Это необходимо учитывать при создании модельных условий для изучения десорбционных свойств сорбента. Для определения эффективности действия полученных образцов оценивали процесс извлечения биологически активного компонента бетулина из модифицированных образцов в модельный раствор; определяли время установления равновесия процесса десорбции, а также влияние рН на количество бетулина, десорбируемого с поверхности.
Для исследования десорбции бетулина из пор образцов препарата была разработана методика количественного определения бетулина хромато-масс-спектрометрическим методом. Хроматографический метод исследования имеет ряд преимуществ перед методом титрования: более низкий предел обнаружения, сокращение длительности анализа, отсутствие затрат на дорогостоящие реагенты.
Определение количества бетулина в сорбенте проводили до и после десорбции в растворах, моделирующих биологическую среду желудка (0,02 Н раствор НСl, рН=1,7) и биологическую среду кишечника (0,0025 Н раствор NaHCO3, рН=8,5). Десорбцию осуществляли в термостате при температуре 38-39С (нормальная температура тела для животных).
При проведении процесса десорбции бетулина к навеске модифицированного сорбента 2 г приливали 10 мл водного 0,02 Н раствора соляной кислоты или 0,0025 Н раствора гидрокарбоната натрия. Герметично закрывали колбу парафиновой лентой и помещали в термостат. По истечении определенного времени (2, 4, 6, 16, 24 ч) колбу вынимали из термостата, жидкую фазу декантировали. Сорбент после десорбции промывали дистиллированной водой и высушивали в сушильном шкафу при температуре 105±2С до постоянной массы.
Концентрацию бетулина, перешедшего в раствор с углеродного сорбента после десорбции, определяли методом SIM (селективной регистрации отдельных ионов с заданными m/z, где m – масса, z – заряд) с построением калибровочных графиков зависимости интенсивности сигнала от количества молекул чистого вещества – бетулина (m/z=442). В качестве калибровочных растворов использовали этанольные растворы бетулина с концентрацией в диапазоне 0,0020,008 М. При содержании бетулина в исследуемом растворе до 0,002 М его определяли отношением площади хроматографического пика исследуемого образца (содержание бетулина в исследуемой пробе) к площади пика эталонного калибровочного раствора (бетулин с известной концентрацией). При этом условно предполагали идентичность составов исследуемых и стандартных проб. Присутствие глицерина в растворе не мешало определению. Площадь хроматографического пика линейно зависела от содержания бетулина в пробе.
Таким образом, зная площадь пика Y1, полученного для калибровочного раствора с содержанием бетулина до 0,002М (Х1), площадь пика исследуемого раствора Y2, определяли концентрацию исследуемого раствора бетулина X2 по формуле: X2 = (Y2/Y1 0,002). Фармакотоксикологические исследования Фармакотоксикологические исследования исходного и модифицированных образцов мезопористого углеродного энтеросорбента проводили на кафедре диагностики, внутренних незаразных болезней, фармакологии, хирургии и акушерства института ветеринарной медицины и биотехнологии ФГБОУ ВО ОмГАУ им. П.А. Столыпина, в Государственном научном учреждении «Сибирский научно исследовательский институт птицеводства Российской академии сельскохозяйственных наук (г. Омск), ЦНИЛ ОмГМУ Минздрава РФ и хозяйствах Омской области. Эксперименты проводили на беспородных крысах, белых нелинейных мышах, цыплятах кросса «Сибиряк» и крупном рогатом скоте. Исследования на животных осуществляли согласно требованиям Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментах и для других научных целей (2005) [65]. Схема исследований представлена на рисунке 9.