Содержание к диссертации
Введение
Общая характеристика работы 5
1.1. Основные направления изучения реактивности животных 9
1.2. Методологические основы для изучения поведения животных 12
1.3. Ориентировочно-исследовательское поведение мышей линии бм и мм 14
1.4. Экспериментальный стресс у лабораторных животных разных линий 18
1.5. Применение комплекса gg в ветеринарии и медицине 22
1.6. Свойства высокомолекулярного полисахаридного комплекса gg (форвета) 30
1.7. Механизм действия форвета 31
Глава 2. Собственные исследования материал и методы исследования 34
Глава 3. Результаты собственных исследований 41
3.1. Собственные исследования 41
3.3. Устойчивость мышей линии мм и бм к гипоксии 56
3.4. Цитопатогенный эффект пвг-2 и влияние форвета на организм мышей 58
3.6. Изменения в тканях мышей линии мм после впг – 2 71
3.7. Морфологические изменения в органах мышей линии бм и мм после впг-2 и введения форвета 79
Глава 4. Анализ и обсуждение полученных результатов исследований 92
Выводы 104
Рекомендации по использованию научных выводов 106
Список литературы 106
- Ориентировочно-исследовательское поведение мышей линии бм и мм
- Свойства высокомолекулярного полисахаридного комплекса gg (форвета)
- Цитопатогенный эффект пвг-2 и влияние форвета на организм мышей
- Морфологические изменения в органах мышей линии бм и мм после впг-2 и введения форвета
Ориентировочно-исследовательское поведение мышей линии бм и мм
Первые исследования по изучению поведения животных и изменения у них реактивности начали в 20-х годах прошлого столетия [Крушинский Л.В.,1944,1945; Busnel R.G.,1957]. Были проведены исследования по выяснению роли генотипа в формировании адаптивного поведения, способности животных к экстраполяции и направленного движения при стимуле [Федоров В.К., 1951; Коган А.Б., Семеновых А.П., 1955]. Проблема исследования поведения животных решается выбором группы инбредных линий и созданием модели для достижения цели исследования и специфики изучаемого фенотипа [Крушинский Л.В., 1958, 1959; Calhoun J.B.,1962]. Признаки организма могут варьировать, изменяться в пределах нормы в зависимости от реактивности организма [разнообразные движения, уровень локомоторной активности, длина пройденного пути, время затраченное на обучение, на прохождение препятствий, на знакомство и преодолевание лабиринта, на отыскивание корма, реакция на звуковые раздражители, биохимичеие и другие показатели] [Крушинский Л.В., 1960; Lorenz K., 1966].
Реактивность зависит от факторов внешней среды, а реакции на них определяются состоянием нервной системы, гормональным фоном [Дьякова Л.М.,1972; Bateson P.Р., Imprinting G.,1973]. В современной науке нередко используют рекомбинантные инбредные линии животных, мозаичных и химерныех животных, а также трансгенные организмы. Унитарные реакции животных эволюционируют и указывают на наличие непрерывных переходов между врожденным (инстинктивным) безусловно - рефлекторным и индивидуально приобретенным поведением [Kruchinskii L.V., 1973;Семиохина А.Ф., Забелин С.И., 1974]. В большинстве случаев поведение представляет собой результат интеграции систем организма [Алликметс Л.Х., Оттер М.Я., Ээпик Т.Е., 1986]. Реактивность животных разнообразна по своим формам, проявлениям и механизмам. В настоящее время накоплен большой материал, который характеризует ее как совокупность разных форм приспособительной деятельности [Хайнд Р., 1988; Cotgreave I.A.,1988]. Этологи изучают биологическую целесообразность поведения и роль поведенческих актов в борьбе за выживаемость вида, показывают врожденные навыки и описывают их у отдельных видов животных [Полетаева И.И., Салимов Р.М., 1992; Crusio W.E., Goldovitz D., Walsten D., Wimer R.E.,1992; Зорина З.А., 2005; Полетаева И.И., Маркина Н.В., Перепелкина О.В., Бояршинова О.А., и др., 2006]. Тогда как реактивность – это путь достижения при проявлении компенсаторно приспособительных реакций. В ходе развития организма формируются нейрохимические особенности мозга с появлением специализированных связей между нейронами в виде физиологической или патологической доминанты, следовых реакций или парабиоза. В тоже время специфические раздражители формируют доминантный очаг возбуждения, образующийся под влиянием гуморальных факторов в каком-либо центре иррадиирующий возбуждение [Маркина Н.В., Попова Н.В., Полетаева И.И., 1999; Маркина Н.В., Перепелкина О.В., Салимов Р.М., Майский О.В., 2003; Witter, R., Stenberg U., Hesse S., Kondo T., Koch F.T., Ulrich A.,2006]. Раздражая определенные участки мозга изменяются ответные реакции у курицы: она встает, 10 оглядывается, испугана, отодвигается от пугающего ее объекта. При дальнейшем усилении раздражения испуг у курицы нарастает, она усиленно двигается и улетает, будто реагирует на приближение хищника [Перепелкина О.В., Тимошенко Т.В., Маркина Н.В., Ревещин А.В., Полетаева И.И., 2007; Тимошенко Т.В., 2007]. Раздражение другого участка мозга может вызывать агрессию птицы и она даже бросается на чучело хорька [Перепелкина О.В., Маркина Н.В., Пинигина Е.А., Ревищин А.В., 2007]. Реакции агрессии могут быть вызваны введением определенных гормонов, которые изменяют поведенческие реакции [Марышева В.В., Лукк М.В., Шабанов П.Д., 2009]. Доказано, что у многих видов животных в онтогенезе имеются периоды, во время которых они по разному реагируют на раздражители [Перепелкина О.В., Голибродо В.А., Лильп И.Г., Полетаева И.И., 2013]. Далее животные на биологические внешние факторы приспосабливают свое поведение «запечатление» Lorenz K. [1939, 1950]. Согласно его мнению, запечатление отличается от условного рефлекса и проявляется в короткий период постнатальной жизни животного. Реакцию на запечатленный объект невозможно снизить в течение всей жизни. Опыты Lorenz K. [1956] показывают, что условно - рефлекторное обучение у молодых животных сохраняется лучше, чем у старых. Фармакологические препараты не оказывают существенного влияния на выработку условных рефлексов, однако могут устранять эффект запечатления [Перепелкина О.В., Маркина Н.В., Салимов Р.М., Полетаева И.И.,2010]. Как подчеркивает Л. В. Крушинский [1978], приспособительная роль элементарной рассудочной деятельности состоит в «обеспечении адаптивной реакции уже при первой встрече с новой ситуацией». В современной науке такие явления остаются мало изученными, правда есть попытки описания, анализа и интеграции их в общую систему знаний.
Свойства высокомолекулярного полисахаридного комплекса gg (форвета)
Полученные данные показывают, что реактивность мышей линии «Малый мозг» и «Большой мозг» существенно изменяется при помещении их в камеру с лабиринтом. Поведение животных контрольной группы в течение 60 минут эксперимента существенно не отличалось от нормы: за исключением 1 – 2 особей они спокойны, преодолевают без усилий перегородки и перемещаются в соседние камеры. Рефлекс «что такое» выражен слабо, несколько мышей заглядывают в межперегородочные отверстия, с 22 – ой по 60 – ю минуту несколько особей было обнаружено в 3 камере. Познавательные установки для животных подопытной группы, после введения форвета, решались быстрее и инвариативнее. Препарат существенно изменяет их поведение и активность. Это нашло подтверждение в опыте по оценке способности мышей к экстраполяции направленного движения к пищевому стимулу [по 41 Крушинскому Л.В., 1986]. Для этого животных помешали в 1 отделение лабиринта, предлагали обнюхать сыр, а затем переносили зигзагообразно в 5 отделение. Эксперименты показали, что мыши линии «Большой мозг» и «Малый мозг» в разное время находят пищевой раздражитель и его поедают. При этом только 10% от общего количества мышей линии «Малый мозг» достигают пищевого раздражителя, что свидетельствует об их пассивности. Мыши линии «Большой мозг» проявляют высокую двигательную активность: на 10 минуте 2-3 особи достигают 5 отделения лабиринта, собирают информацию о новой обстановке, в которую их поместили. Нельзя исключить, что пример «научения» быстро передается другим особям, и до 70% их от общего количества, перемещаются в 3-5 камеры лабиринта. Пищевой раздражитель стимулирует преодолевание перегородок, лабиринта, более того, у животных появляется способность к конкурентности, но обстановка теста быстро теряет для них новизну. Использование препарата форвет стимулирует познавательные и когнитивные способности мышей обеих линии. Однако результаты тестирования показали межгрупповые отличия. Динамика времени перебежек в лабиринте в течение 2 дней эксперимента также отражает лучшую обучаемость мышей линии БМ. Результаты экспериментов, в сопоставлении с данными других авторов [Попова Н.В., Полетаева И.И. и др. 1981; Fuller J.L., Thompson W.R., 1960], свидетельствуют о закономерном проявлении различий в поведении мышей с разной массой мозга, связанном с направленным движением к пищевому стимулу. Доля правильных решений теста на экстраполяцию у мышей линии БМ часто достигает 70% - ного уровня. Это также подтверждает данные, полученные Крушинским Л.В. [1960], Перепелкиной О.В. Маркиной Н.В. и др. [2011], Timoshenko T.V. et al. [2008].
У животных была возможность преодолевать перегородки через верх. В ходе опыта отмечали преодоление мышами барьеров, заглядывание в отверстия лабиринта, индивидуальную и общую активность [рис.11,12]. Оценку способности к экстраполяции направленого движения пищевого стимула тест на элементарную рассудочную деятельность проводили по Крушинскому Л.В., [1986]. Способность к экстраполяции направления движения оценивали у мышей линий «БМ» и «ММ», а затем после введения форвета. Первой задачей было сопоставление способности мышей к обучению в лабиринте с пищевым подкреплением. Для стимуляции мышам давали понюхать сыр, а затем его переносили зигзагообразно в 5 отделение [рис.13] и наблюдали за изменением поведения животных. Экспериментальные исследования показали, что мыши линии «БМ» и «ММ» имеют разную реактивность. Две мыши линии «ММ» в течении 5 – 7 минут переходят во 2 отделение, а остальные на 27 – 30 минуте. Реакция на пищевой раздражитель была выявлена у 10% животных. Вероятно необычные условия эксперимента вызывают беспокойство и тревогу у животных, что подтверждается обильной дефекацией в 1-2 отделениях лабиринта. В группе мышей линии «БМ» двигательная
Мышь преодолевает перегородку к пищевому раздражителю активность была достаточно высокой. Уже на 10 минуте они достигают 5 отделения. Вероятно, пример «научения» быстро передается другим особям. Пищевой раздражитель стимулирует мышей на преодолевание перегородок и появляется конкурентность.
Результаты этого опыта, достоверно отличаются между группами, что следует трактовать как наличие соответствующей обученности у мышей группы БМ. Доля правильных решений теста на экстраполяцию у мышей линии БМ достоверно достигает 70%-ного уровня. У мышей линии ММ он в пределах 10% -ного случайного уровня. Низкий уровень решений теста у линии ММ вероятно также связан с испугом. Это подтверждается уровнем тревожности и стресс-реакции, которые, в эксперименте проявлялись в виде высокой двигательной активности и длительной иммобилизации. При действии стрессоров у мышей была пассивная стратегия поведения. Поэтому, на наш взгляд, уровень способности к решению данного теста был невысокий. Мыши линии БМ склонны выбирать активную стратегию поведения. У них была выше способность к решению когнитивных задач – тестов на экстраполяцию направления движения к пищевому стимулу. Наши эксперименты показали некоторое превосходство в решении поставленных задач у мышей линии БМ. Динамика времени перебежек в лабиринте в течение 2 дней обучения также отражает лучшую обучаемость мышей линии БМ [табл.1].
Мыши линии БМ, уже через 10 мин собирают информацию о новой обстановке, в которую их поместили. Уровень исследовательской активности у них выше, а обстановка теста быстро теряет для них новизну. Общим выводом из данной работы по изучению поведения мышей линии БМ и ММ является расширение наших знаний о формировании у них навыков разной сложности.
Цитопатогенный эффект пвг-2 и влияние форвета на организм мышей
В легких определяются выраженные деструктивные процессы, как бронхиального дерева, так и респираторного отдела легкого [рис.37]. По ходу бронхов и кровеносных сосудов различного размера скопления лимфоидных клеток [рис.38]. Лимфоидные фолликулы, располагаясь вокруг мелких бронхов давят на стенку, в других случаях лимфоидная ткань располагается по ходу бронхов. В просвете бронхов различного калибра видны спущенные эпителиоциты, а единичные лимфоидные клетки.
Белая и красная пульпа с центральной артерией селезенки у животных группы «ММ». Гематоксилин и эозин, об.40, ок.10 Одновременно была исследована селезенка мышей – орган кроветворения и иммунной защиты. У мышей радившихся от матерей в состоянии инфицированности герпесом, определяются изменения в состоянии белой, и красной пульпы. В частности отмечается уменьшение размеров лимфатических узелков [рис.40], однако их в количественном отношении больше, чем у мышей линии «БМ». Вокруг белой и красной пульпы выражена инфильтрация, застой и кровенаполнение венозных синусов.
При интоксикации мышей – матерей при герпесе у их потомства видны гистологические изменения сердца [рис.42 – 43], при этом отмечается довольно обширная инфильтрация лимфоидной ткани между кардиомиоцитами. Встречают участки миокарда с плотным расположением лимфоидной ткани и диффузная инфильтрация лимфоцитов и макрофагов между кардиомиоцитами. В то же время повсеместно возникает нарушение микроциркуляции. Венозный застой, диапедез эритроцитов в соединительную ткань [рис.43]. Значительно изменяется микроциркуляция, с появлением лимфоидных инфильтратов по ходу кардиомиоцитов.
Установлено, что форвет обладает умеренным антигриппозным действием, которое распространяется и на гриппозную инфекцию, вызванную ВПГ- 2. Он обладает способностью снижать инфекционный титр вируса в легких мышей и снижать количество лейкоцитов в них, что также указывает на замедление развития гриппозной инфекции. В исследованных органах мышей линии БМ и ММ после применения ВПГ-2 и форвета установлено, что в печени не исчезают гистологические изменения по сравнению с группой ВПГ- 2. У группы животныхлинии БМ печень состоит из стромы и паренхимы, строма образована из соединительнотканной капсулы и отходящими от нее трабекулами, разделяющими железу на отдельные дольки. Каждая долька имеет шестигранную форму, в центре дольки проходит центральная вена [рис.44], от нее веерообразно к периферии проходят печеночные пластинки. В междольковой рыхлой соединительной ткани располагаются триада печени: междольковый желчный проток, междольковая артерия и вен. Во всех печеночных пластинках цитоплазма гепатоцитов окрашивается равномерно, с базофильным оттенком. Ядра клеток округлой формы и занимают центральное положение, хроматин ядра не плотный, но на фоне ядра четко определяется 1 и 2 ядрышка. Между печеночными пластинками располагаются внутридольковые венозные синусоиды, которые расширены умеренным или значительным кровонаполнениям. Кровеносные сосуды также кровенаполнены. Вокруг синусоидных капилляров определяется расширенная периваскулярная зона Диссе. Наиболее заметные изменения касаются уменьшения лимфоидных клеток в различных участках печени. Особенно это видно около центральной вены дольки печени [рис.44]. Небольшое количество и размеров лимфоидные скопления определяются за пределами долек печени, они встречаются в междольковой соединительной ткани, по ходу междольковых кровеносных сосудов и желчного протока.
Легкие у мышей линии БМ меняют свою морфологическую картину после введения форвета. По ходу бронхов выявляются различного размера и протяженности лимфоидные скопления,которые располагаются на недалеко от бронхов или вплотную прилегают к адвентициальной оболочке. Надо 80 заметить, что основная масса бронхов остается свободной от лимфоидных клеток.
Местами, в бронхах различного калибра, выявляются участки, где слизистая оболочка отечна, инфильтрирована маrрофагами, лимфоцитами, тучными и плазматическими клетками. В респираторном отделе легкого слизистая оболочка бронхиол становится полнокровной и набухшей, выработка слизи резко усилена, наблюдается отечность. В альвеолах скапливается слизь, нейтрофилы, макрофаги, эритроциты и слущенные эндотелиальные клетки, выявляется небольшое количество фибрина [рис.45,46].
Морфологические изменения в органах мышей линии бм и мм после впг-2 и введения форвета
Оценку ориентировочно-исследовательского поведения в незнакомой сложной среде-лабиринте провели на мышах ММ и БМ. Латентный период в начале обследования новой среды у мышей БМ и ММ не различается, т.е. они, как правило собираются вместе и какое-то время неподвижны. Мыши линии БМ для осуществления первого знакомства с неизвестной обстановкой затрачивали меньше времени и число заходов в разные отделения при обследовании лабиринта было большим. Далее у мышей линий у БМ появляется активность у отдельных особей отмечено, до 20 преодолеваний барьеров, время пребывания в различных отделениях у них было достоверно больше, чем у ММ. Интересно, что у последних, как правило, активной были 1-2 особи, остальные находились группой в первом отделении лабиринта. В тоже время они дольше обследовали лабиринт при попадании в него, что, возможно отражает высокую эффективность исследовательского поведения. Повторные заходы в какие-либо отделы лабиринта у мышей линии ММ были реже. Эта склонность мышей линии ММ вероятно связана с их более высоким уровнем тревожности о чем сообщают исследователи [Маркина Н.В., Перепелкина О.В., Тимошенко Т.В., Полетаева И.И., 2007; Timoshenko T., Revishchin A., Pavlova G., Poletaeva I.,2008; Timoshenko T., Revishchin A., Pavlova G., Poletaeva I.,2008]. На различных тестах примерно такие же данные были получены другими исследователями [Маркина Н.В., Перепелкина О.В., Тимошенко Т.В., Полетаева И.И., 2007; Timoshenko T., Revishchin A., Pavlova G., Poletaeva I.,2008; Timoshenko T., Revishchin A., Pavlova G., Poletaeva I.,2008].
Эмоциональную реактивность, тревожность и стресс-реактивность мышей линий БМ и ММ оценивали по уровню дефекации и уринации. Это является проявлением испуга животного, в тоже время об этом свидетельствует реакция замирания и время груминга [Маркина Н.В., Перепелкина О.В., Тимошенко Т.В., Полетаева И.И., 2007; Timoshenko T., Revishchin A., Pavlova G., Poletaeva I.,2008; Timoshenko T., Revishchin A., Pavlova G., Poletaeva I.,2008; Зарубина И.В., 2009]. Последний показатель является проявлением тревожности и исследовательской мотивации. В тесте по исследованию лабиринта были обнаружены межлинейные различия в показателях уровня тревожности, ОИА показатель развития реакции страха – замирание - возникает чаще у мышей линии ММ. У мышей БМ она проявляется в виде повышенной локомоции при преодолении перегородок лабиринта. Аналогичные данные на мышах помещенных в новую обстановку получили многие авторы [Зарубина И.В., 2009; Perepelkina О.V., Boyarshinova O.S., Timoshenko Т.V., Poletaeva I.I. et al.,2009]. Так в тестах Порсолта в неизбегаемой скользкой воронке, в которой моделируют предрасположенность животных к развитию депрессии были получены соответствующие результаты [Зарубина И.В., 2009; Perepelkina О.V., Boyarshinova O.S., Timoshenko Т.V., Poletaeva I.I. et al.,2009]. Поведение в «неизбегаемой скользкой воронке» мышей БМ и ММ было различным: попыток выпрыгнуть из воронки - и времени пассивного избегания (распластанная поза над водой). Была выше у БМ, тогда как время неподвижного замирания в воде было выше у ММ. Поведение «беспомощности» («зависанию» в тесте Порсолта) было выражено более четко у мышей линии ММ [Зарубина И.В., 2009; Perepelkina О.V., Boyarshinova O.S., Timoshenko Т.V., Poletaeva I.I. et al.,2009]. Активную стратегию поведения мышей линии БМ можно объяснить уровнями реактивности. Ранее было показано, что у мышей ММ была повышена судорожная готовность, что может отражать их возбудимость, которая у них сочетается с повышенной тревожностью [Зарубина И.В., 2009; Perepelkina О.V., Boyarshinova O.S., Timoshenko Т.V., Poletaeva I.I. et al.,2009]. Авторы Perepelkina О.V., Boyarshinova O.S., Timoshenko Т.V., Poletaeva I.I. et al., [2009] также отмечают, что периоды активного и пассивного плавания были достоверно выше у мышей БМ по сравнению с ММ [Тимошенко Т.В., Перепелкина О.В., Маркина Н.В., Ревищин А.В., [и др.]2009; Poletaeva I.I., Zorina Z.A.,2014]. Состояние неподвижности, в тесте Порсолта, было выше у мышей линии ММ по сравнению с БМ. Акустическая реакция вздрагивания (стартл-реакция) была наоборот интенсивнее у мышей линии ММ [Тимошенко Т.В., Перепелкина О.В., Маркина Н.В., Ревищин А.В., [и др.]2009; Poletaeva I.I., Zorina Z.A.,2014]. У гибридов достоверных межлинейных различий интенсивности стартл-реакции выявлено не было. Анализируя данные литературы и собственные исследования, можно сделать заключение, что выявляются корреляции между размером мозга и особенностями поведения у мышей и крыс [Тимошенко Т.В., Перепелкина О.В., Маркина Н.В., Ревищин А.В., [и др.]2009; Poletaeva I.I., Zorina Z.A.,2014]. Эти корреляции могут видоизменяться при изменении условий, в которых пребывает животное. Можно предположить, что такая модуляция межлинейных различий имеет значение в адаптации популяций к существованию в экспериментальных природных условиях.
Таким образом, проведенные нами исследования на мышах полученных от матерей переболевших простым герпесом 2 типа, позволили получить данные о различной степени адаптации животных к новым условиям, обучаемости при исследовании лабиринта и преодолевании его перегородок, реакции на звуковой раздражитель разной силы и тональности, устойчивость к гипоксии. Крысы лучше переносили ФН при плавании и показывали лучшие результаты, в печени и головном мозге был умеренный уровень показателей СРО и ПОЛ. В тоже время АФК и НСТ – тест оставались достаточно высокими. У собак и овец форвет проявил себя как иммуномодулятор. Форвет влияет на выраженность морфологических изменений в органах мышей разных линий. Это позволяет планировать мероприятия по стимулированию органа к инфекционному воздействию, в данном случае следует направить усилия на энергообеспечение организма для усиления его детоксикационных функций. ЦПЭ в печени является маркером эффективности рекомендованных веществ для коррекции патологических состояний. Наши дынные по изменению гематологических, биохимических показателей на кошках, собаках и овцах после применения высокомолекулярного полисахаридного комплекса в норме и патологии могут найти применения в разных областях ветеринарии. Высокомолекулярный полисахаридный комплекс обладает выраженным стимулирующим действием на биохимические, гематологические и морфологические показатели у животных разных видов. Перспективы его применения в ветеринарной медицине очевидны и актуальны.