Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Половые различия головного мозга млекопитающих и и их взаимосвязь с поведением, морфологией и функциями организма
1.1.1. Современные представления о половой дифференциации мозга
1.1.2. Половые различия головного мозга млекопитающих 11
1.1.3. Участие клеток мозга в процессах полового диморфизма организма
1.1.4. Влияние половых гормонов на половую дифференциацию мозга
1.1.5. Роль половых гормонов в патофизиологии центральной нервной системы
1.1.5.1. Патогенез эпилепсии при участии половых 27
стероидов
1.2. Общая морфофукциональная характеристика миндалевидного комплекса мозга
1.2.1. Структурные характеристики переднего отдела миндалевидного комплекса
1.2.2. Миндалевидный комплекс - нейроэндокринный центр мозга
1.2.3. Миндалевидный комплекс мозга в патогенезе абсансной эпилепсии
1.2.4. Крысы линии WAG/Rij – экспериментальная модель абсансной эпилепсии мозга
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 58
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 65
3.1. Цитоархитектоническая характеристика основных зон полового диморфизма переднего отдела миндалевидного комплекса мозга крыс линииWAG/Rij
3.2. Результаты планиметрирования зон полового диморфизма переднего отдела миндалевидного комплекса мозга крыс линии WAG/Rij
3.3. Цитологические особенности нейронов зон полового диморфизма переднего отдела миндалевидного комплекса мозга крыс линии WAG/Rij
3.4. Нейроно-глиальный индекс основных зон полового диморфизма переднего отдела миндалевидного комплекса мозга самцов и самок крыс линии WAG/Rij
3.5. Ультраструктурные особенности зон полового диморфизма переднего отдела миндалевидного комплекса мозга крыс линии WAG/Rij
3.5.1. Электронно-микроскопическая характеристика переднего кортикального ядра миндалевидного комплекса мозга самцов крыс линии WAG/Rij
3.5.2. Электронно-микроскопическая характеристика переднего кортикального ядра миндалевидного комплекса мозга самок крыс линии WAG/Rij
3.6. Динамика показателей аудиогенной судорожной активности крыс линии WAG/Rij
3.6.1. Анализ показателей аудиогенной судорожной активности самцов крыс линии WAG/Rij
3.6.2. Исследование показателей аудиогенной судорожной активности самок крыс линии WAG/Rij
3.6.3. Сравнительнай анализ временных показателей аудиогенной судорожной активности крыс линии WAG/Rij
Заключение 125
Практические рекомендации 133
Выводы 134
Список сокращений 136
Список литературы
- Современные представления о половой дифференциации мозга
- Миндалевидный комплекс - нейроэндокринный центр мозга
- Результаты планиметрирования зон полового диморфизма переднего отдела миндалевидного комплекса мозга крыс линии WAG/Rij
- Исследование показателей аудиогенной судорожной активности самок крыс линии WAG/Rij
Современные представления о половой дифференциации мозга
Половой диморфизм в структуре человеческого мозга на основании данных магнитно-резонансной тамографии (МРТ) указывает на когнитивные и поведенческие различия между мужчинами и женщинами (Cosgrove K. P., Mazure C. M., Staley J. K., 2007; Wallentin M., 2009; Whittle S. et al., 2011).Как описано выше, формирование мозга млекопитающих под влиянием половых гормонов начинается внутриутробно (Thornton J., Zehr J. L., Loose M. D., 2009), и половой диморфизм в мозге человека присутствует с рождения, например, размер мозга новорожденных мальчиков примерно на 6% больше, чем у девочек (Gilmore J. H. et al., 2007), что может быть отчасти связано с пренатальным воздействием андрогенов (Peper J. S. et al., 2009). На протяжении жизни половые различия в объеме мозга меняются (Paus T., 2010). Мозг мужчин больше как в общем объеме, так и по объеме большинства структур (Cosgrove K. P., Mazure C. M., Staley J. K., 2007; Luders E., Toga A. W., 2010).Если рассматривать различия по типу тканей, то серого и белого вещества у мужчин больше (Good C. D.et al., 2001; Gur R. C.et al., 1999; Chen X.et al., 2007), однако, учитывая поправку на размер мозга, ситуация несколько усложняется; при этом большинство исследований в оценке относительного объема серого вещества показывают превосходство по данному показателю у женщин (Gur R. C.et al., 1999; Luders E., Steinmetz H., Janoke L., 2002; Chen X.et al., 2007), тогда как относительный объем белого вещества выше у мужчин (Filipek P. A.et al., 1994; Gur R. C.et al., 1999; Goldstein J. M.et al., 2001; Chen X.et al., 2007).
Отличительной чертой подросткового периода является всплеск половых гормонов в период полового созревания, который относится к активации гипоталамо – гипофизарно – гонадной системы (Sisk C. L., Foster D. L., 2004). При интерпретации половых различий в структуре мозга и функциях мы должны иметь в виду возможность того, что они отражают половые различия в поведении (Draganski B. et al., 2004; Driemeyer J. et al., 2008), что имеет особое значение в период развития человека, характеризующийся значительными изменениями. Как показали данные МРТ, как абсолютные, так и относительные объемы белого вещества с возрастом нарастают более ускоренными темпами у мальчиков по сравнению с девочками в подростковом возрасте (Perrin J.S. et al., 2008).Также показано, что индекс миелинизации у мальчиков – подростков в белом веществе с возрастом снижается, что может быть оправдано влиянием изменений уровня тестостерона, а также увеличением аксонального калибра (Perrin J.S. et al., 2008). Во время подросткового периода у мальчиков имеет место непропорциональный рост аксонов и миелиновой оболочки, что приводит к возможным половым различиям в соотношении между калибром аксона и диаметром волокна. Белое вещество занимает больший диаметр в аксоне и имеют более низкую концентрацию миелина (Paus T., Toro R., 2009). Предполагаемые тестостерон – индуцированные изменения аксонального диаметра в течение подросткового периода у мальчиков влияют на данное соотношение (Paus T., Toro R., 2009). Посмертные исследования взрослых пациентов выявили наличие половых различий и в корковой цитоархитектонике, в том числе в более высокой плотности нейронов в зернистых слоях коры (Witelson S. F., Glezer I. I., Kigar D. L., 1995) и большей в нейропиле у женщин (Rabinowicz T. et al., 1999; 2002). Также известно о более высокой плотности синапсов в коре (Alonso-Nanclares L. et al., 2008), а региональные различия включают в себя больший объем зрительной коры у мужчин (Amunts K. et al., 2007).
Кроме общих различий в объеме мозга, есть и различия в конкретных областях, а именно: в областях, содержащих рецепторы половых стероидов. Такие рецепторы найдены в гипоталамусе в соответствии с его центральной ролью контроля половой и репродуктивной функций (Cameron J.I., 2001).Участки мозга, в которых детально представлены различия по фактору пола представлены также базальными ганглиями, гиппокампом и миндалевидным комплексом (МК) (Hafner H., 2003; Kessler R.C.et al., 2005).Многие из областей мозга с тесными связями с гипоталамусом также содержат рецепторы половых стероидов, видное место среди них занимает МК (Simerly R. B. et al., 1990; Goldstein J. M. et al., 2001). Существует некая согласованность между областями мозга с половым диморфизмом и большим числом рецепторов половых стероидов. Опыты показали: абсолютный объем орбитофронтальной и каудальной зон у самок больше (Filipek P.A. et al., 1994). Гольдштейн (2001) в свое время обнаружил несколько фронтальных и медиальных паралимбических областей мозга, больших по объему у женщин, в то время, как в переднемедиальной коре, гипоталамусе и МК показаны большие объемы у мужчин (Goldstein J. M. et al., 2001).В многочисленных независимых исследованиях было показано, что хвостатое ядро у самок крыс также больше (Giedd J. N. et al., 1997; Sowell E. R. et al., 2002; Wilke M., Krageloh-Mann I., Holland S. K., 2007).Обнаружение полового диморфизма в других областях было менее значимо, это касается областей височной доли мозга, таламуса и промежуточного мозга, а также бледного шара и нижней лобной извилины (Giedd J. N. et al., 1997; Sowell E. R. et al., 2002; Wilke M., Krageloh-Mann I., Holland S. K., 2007).Из основных регионов мозга, включающих морфологические ползависимые различия особо выделяются базальные ганглии и лимбические структуры мозга, в частности, гиппокамп и МК (Giedd J. N. et al., 1997; Goldstein J. M. et al., 2001; Suzuki M. et al., 2005; Wilke M., Krageloh-Mann I., Holland S. K., 2007) с большим темпом роста гиппокампа у женщин и МК у мужчин, что соотносится с данными большей плотности андрогенных рецепторов в МК и эстрогенных рецепторов в гиппокампе, свидетельствуя о большей чувствительности МК к тестостерону и гиппокампа– к эстрогену (McEwen B. S., 2001; Romeo R. D., Waters E., McEwen B. S., 2004; Becker J. et al., 2007).
Миндалевидный комплекс - нейроэндокринный центр мозга
Планиметрирование структур мозга проводили на гистологических препаратах 15 самцов и 16 самок крыс линии WAG/Rij, окрашенных гематоксилин-эозином. Определение площади зон полового диморфизма переднего отдела МК мозга осуществляли в программе Universal Desktop Ruler (AVP Soft, USA) в мм2. Для определения различий между двумя группами крыс была определена абсолютная и удельная общая площадь МК и ядер ЗПД на ростральном и каудальном уровнях переднего отдела.
Подсчет нейроно-глиального индекса
Количество нейронов и клеток глии определяли на препаратах самцов (n=15) и самок (n=16) крыс линии WAG/Rij, окрашенных крезилом фиолетовым. Готовые гистологические препараты изучали в световом микроскопе. Плотность клеточных элементов измеряли в поле зрения микроскопа МБИ-11 (ЛОМО, Россия) на площади 0,031 мм при увеличении в 400 раз (объектив 40, окуляр 10), что делает возможным дифференцировку нейронов и клеток глии.
Исследовали нейроглиальные соотношения на основе подсчета плотности нейронов (сома которых не выходила за пределы анализируемого окна), плотность общей глии и плотность сателлитной глии, окружающей нейроны. При измерении плотности клеток в единице объема вещества учитывали только клетки с наличием профиля ядра и ядрышка, а также основные принципы дифференцировки нейронов и глиоцитов.
Сателлитными считали глиоциты, находящиеся от тела клетки на расстоянии не более диаметра его ядра. Определяли нейроглиальный индекс как отношение количества глиальных клеток к количеству нейронов.
Электронная микроскопия Для проведения электронно-микроскопических исследований переднего кортикального ядра миндалевидного комплекса крыс под контролем микроскопа МБС-10 (ЛОМО, СПб, Россия) был выделен миндалевидный комплекс у самцов (n=12) и самок (n=14) крыс линии WAG/Rij. Кусочки тканей мозга крыс фиксировали в охлажденном растворе 2% глютарового альдегида на фосфатном буфере Миллонига (рH 7,2-7,4) в течение 2 часов, отмывали в трех порциях того же буфера. Постфиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия (приготовленном на фосфатном буфере Миллонига, рН 7,2-7,4) – 1 час. Обезвоживали в этаноле по восходящей концентрации и абсолютном ацетоне. Заливку проводили в эпон-812 по общепринятой методике (Б.Уикли, 1975). Для правильной ориентации блока использовали полутонкие срезы, окрашенные 1% р-ром толуидинового синего, приготовленным на 2,5 % р-ре безводной соды. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB-III (Швеция), контрастировали 2% водным раствором уранилацетата и раствором цитрата свинца по Рейнольдсу (1963). Фотографировали в электронном микроскопе Jem-100B (Япония) при увеличениях 3000 – 20000. Структурно-функциональное состояние нейронов определяли на основании комплексного анализа ультраструктур клеточного ядра и органоидов цитоплазмы, руководствуясь критериями, разработанными Ахмадеевым А. В. и Калимуллиной Л. Б. (2005). Исследование полового цикла самок крыс В яичнике млекопитающих происходят циклические, повторяющиеся через определенные интервалы времени процессы созревания фолликулов, овуляции и образования желтых тел (Вундер П.Н., 1973). Если содержать половозрелых самок белых крыс изолированно от самцов, то такие эстральные циклы правильно повторяются в среднем каждые 4-5 дней в течение круглого года. Определить фазу эстрального цикла у крыс можно путем микроскопического исследования влагалищных мазков. Изменения в матке и влагалище крысы во время эстрального цикла обусловливаются половыми гормонами, вырабатываемыми в яичниках. С целью определения регулярности эстрального цикла, т.е. ритмичности функционирования яичников, ежедневно в течение месяца перед сеансами аудиогенного киндлинга у самок брали влагалищные мазки для определения эстральных циклов и анализировали их клеточный состав. Для регулярности циклов у самок, клетки с самками и самцами располагались рядом друг с другом. Мазки (влагалищные смывы) брали в 12.00 часов дня (Комаров Ф.И., Рапопорт С.И., 2000). Пробы брали глазной пипеткой: в нее набирали несколько капель воды и, неглубоко вводя кончик пипетки во влагалище, промывали последнее 1-2 раза, выжимая воду из пипетки и насасывая ее обратно. Взятая таким образом проба, переносилась на предметное стекло. Каплю с взятой пробой рассматривали под микроскопом в слегка затемненном поле. В течение суток предметные стекла с нанесенными каплями высушивались на воздухе. Затем каждое предметное стекло в отдельности медленно проводилось над пламенем газовой горелки, чем достигалась фиксация мазка. На высушенный мазок пипеткой наносили несколько капель раствора метиленовой синьки для окрашивания. В течение 15-20 мин. После этого краску смывали с мазков и давали им подсохнуть на воздухе в течение 2-3 часов (Кабак Я.М., 1968).
Результаты планиметрирования зон полового диморфизма переднего отдела миндалевидного комплекса мозга крыс линии WAG/Rij
Кроме светлой цитоплазмы нейроны обладают и светлыми ядрами, форма которых определяется как овоидная. В ядрах определяется небольшое количество хроматина, организованного в виде мелких глыбок, равномерно рассеянных в кариоплазме. Контуры кариолеммы достаточно четкие. Ядрышко клеток крупное и занимает центр ядра, либо несколько смещено к периферии.
Наряду со светлыми нейронами в СЕ определяются и темные клетки, лежащие по поверхности скопления клеток. Размеры их тела больше, форма тела полигональная; значительную часть тела клеток занимает темное клеточное ядро, величина которого зависит от размеров самой клетки. Форма клеточного ядра овоидная с большим количеством мелких и крупных глыбок гетерохроматина. Ядрышко выглядит плотным, располагается эксцентрично и интенсивно окрашивается. В узких ободках перикариона темных нейронов определяются небольшие количества мелкозернистой базофильной субстанции, равномерно распределенных по цитоплазме. Дендриты клеток очень узкие, в некоторых клетках число дендритов может достигать 3-х, в дендритах содержатся незначительные количества хроматофильной субстанции. Среди нейронов расположены клетки глии: астроциты и олигодендроциты.
Таким образом, резюмируя характеристику нейронов СЕ самцов и самок крыс WAG/Rij, можно сказать, что основная масса клеток представлена светлыми нейронами с большим количеством эухроматина в клеточном ядре и пылевидной базофильной субстанцией. Темные клетки представлены в меньшем количестве и характеризуются преобладанием гетерохроматина в крупном ядре.
Центральное ядро каудального уровня МК самцов крыс (рис. 6) образовано большим скоплением кариохромных нейронов с характерным для них крупным темным ядром. Форма большинства клеток полигональная с небольшим скоплением базофильной субстанции в цитоплазме. Помимо них, определяются и нейроны средних размеров с умеренным количеством цитоплазмы, содержащей незначительное количество базофильной субстанции. Клеточное ядро данных клеток, как правило, светлое. Таким образом, в СЕ определяется две части: большая, занимающая медиальные зоны СЕ, образована кариохромными нейронами, и меньшая по величине латеральная, содержащая преимущественно светлые нейроны.
Клетки СЕ на каудальном уровне переднего отдела МК самок крыс представлены также кариохромными нейронами различных размеров с хорошо отличимым ядром, полигональной формы тела с явной зернистостью в цитоплазме. Также, как и у самцов крыс, ядро образовано темными и светлыми клетками.
Передняя амигдалярная область содержит дисперсно расположенные нейроны средних размеров. Большая часть клеток и у самцов крыс, и у самок носит характер кариохромных, т.е. имеющих темное, хорошо определяемое ядро (рис. 7). В составе ААА также встречаются крупные кариохромные клетки, обладающие полигональной формой тела с четко определяющимися главными дендритами. В перикарионе этих нейронов определяется незначительное количество базофильной субстанции.
Средние по размерам нейроны ААА имеют округло-овальную форму тела и центрально расположенное светлое ядро, большая часть из них кариохромные, хотя, встречаются и светлые нейроны. Мелкие нейроны обладают узким ободком цитоплазмы с определяющимися в ней небольшими количествами хроматофильной субстанции. Также в составе ААА встречаются и крупные нейроны. Анализ клеточного состава ААА показал наличие темных, светлых, а также цитохромных нейронов, которые имеют темную цитоплазму и светлое ядро. Данный состав клеток характерен и для самцов, и для самок крыс линии WAG/Rij. Цитохромные нейроны имеют большие размеры, крупное светлое ядро со значительной массой темной цитоплазмы, содержащей хорошо развитую цитоплазматическую сеть.В составе СОа различают три основные зоны: поверхностную, поверхностно-клеточную и глубокую. В поверхностной зоне СОа выявляется большое число «выселившихся» из поверхностно-клеточной зоны нейронов. Особенно много клеточных элементов в медиальной части ядра.
В зонах, расположенных под мягкой оболочкой, большинство клеток являются элементами глии. Форма и размеры нейронов весьма разнообразны, от мелких до крупных, от круглой формы тела до полигональной, встречаются также веретенообразные и пирамидообразные нейроны. Дендриты клеток имеют различную толщину, большинство из них направлены в сторону клеточной зоны ядра. Особенностью расположения клеток поверхностной зоны СОа является тенденция их группирования в ряды в латеральной части данной зоны, в то время, как медиальная зона характеризуется хаотичным расположением клеток.
Поверхностно-клеточная зона СОа характеризуется плотным расположением нейронов, причем густота нейронов в латеральной части выше (рис. 8). Именно здесь скопление нейронов под поверхностной зоной носит характер четкой полоски. Для медиальной части поверхностно-клеточной зоны характерен полиморфизм нейронов. В клеточном ядре четко выявляется ядрышко. Дендриты в мелких нейронах не выявляются. Средних по размеру нейронов меньше, они обладают круглой формой тела и сферическими ядрами. Среди них встречаются веретеновидные клетки с четко определяющимися двумя дендритами, отходящими от противоположных концов тела клетки и содержащих мелкозернистую базофильную субстанцию. Клеточное ядро имеет плотное ядрышко.
Исследование показателей аудиогенной судорожной активности самок крыс линии WAG/Rij
Единственным отличием, явно бросающимся в глаза при сравнительном исследовании ультратонких срезов СОа МК крыс линии WAG/Rij разного пола, является более разреженное расположение клеток у самок. При изучении же ультраструктуры самих клеток СОа МК выраженных отличий от таковой у самцов крыс мы не нашли. Для самок, также как и для МК крыс-самцов, характерен полиморфизм нервных клеток, выражающийся в разнообразии формы тела, в вариации размеров клеток, неодинаковом содержании органелл в цитоплазме, разной структуре ядерных элементов, а значит и в разном функциональном состоянии клеток.
Так называемые «темные» нейроны СОа МК самок имели цитоплазму и ядра повышенной электронной плотности. Налицо были все признаки повышенной функциональной деятельности данных клеток. Нейроны имели удлиненную форму, разную длину клеток – от 10-15 мкм до 40-50 мкм. Удлиненные ядра располагались чаще всего в центральной зоне цитоплазмы (рис. 31). Они были неровными, имели выпячивания кариоплазмы. В мелких «темных» нейронах ядра казались крупнее, так как занимали в клетке значительную часть тела, и цитоплазма местами принимала вид узкого ободка. Перинуклеарные пространства, ограниченные внутренней и наружней ядерной мембраной, были неравномерно расширены. В кариоплазме выявлялось большое количество мелких глыбок гетерохроматина, а между ними определялся гранулярный материал в виде интерхроматиновых и перихроматиновых гранул, из-за чего ядра «темных» нейронов выглядели электронноплотными (рис. 32).
В большинстве ядер определялось крупное округлое электронноплотное ядрышко с повышенным содержанием гранулярного компонента. Иногда встречались крупные ядрышки, разделяющиеся щелью на две неравные части (рис. 33). В этих ядрах, а также и в цитоплазме «темных» клеток выявлялись признаки активных белоксинтетических процессов. Через ядерную оболочку происходил активный транспорт белковых компонентов, синтезируемых в ядре. По внутренней кариолемме в ядрах выявлялись скопления из РНП-гранул. Околоядерная зона цитоплазмы клеток была густо усеяна множеством темных единичных рибосом и множеством полисом.
В цитоплазме «темных» нейронов кроме большого количества рибосом и полисом определялись многочисленные каналы ГЭР (рис. 34). Они часто располагались по периферии клеточной цитоплазмы. Сильно расширенные просветы каналов ГЭР были заполнены светлым хлопьевидным материалом или были пустыми. Каналы гладкого эндоплазматического ретикулюма (ГЛЭР) просматривались изредка. В цитоплазме клеток выявлялось по несколько пластинчатых КГ (3-4) (рис. 35).
Около его длинных расширенных каналов просматривалось множество секреторных гранул, везикул и вакуолей. Вырабатываемый клетками секрет концентрировался в виде неоднородных крупных скоплений без окружающей мембраны, похожих на липофусциновые включения. Единичные первичные лизосомы определялись в виде округлых или овальных электроноплотных телец, окруженные мембраной, а вторичные лизосомы в виде липофусциновых телец с неоднородным темным содержимым. В цитоплазме выявлялись округлые мультивезикулярные тельца, состоящие из множества светлых и более темных мелких капелек. Митохондрии в «темных» клетках имели разные размеры и формы, тонкие кристы. В некоторых митохондриях кристы на фоне просветленного матрикса полностью разрушались. «Темные» нейроны активно участвовали в формировании многочисленных аксосоматических синапсов (рис. 36).
Пресинаптические компоненты содержали светлые мелкие пузырьки (от 20 до 40 нм), иногда митохондрии небольших размеров. В пресинаптическом компоненте наряду с указанными мелкими пузырьками встречались иногда и отдельные элементарные секреторные гранулы в виде окаймленных пузырьков с плотным центром. На одной из микрофотографий демонстрируется плотный клеточный контакт между функционально активным «темным» нейроном и функционально спокойным «светлым» нейроном с крупным ядром, содержащим крупное электронноплотное ядрышко (рис. 37). В цитоплазме «темной» клетки, кроме некоторого количества каналов ГЭР, выявлялось большое количество довольно крупных округлых митохондрий. В некоторых участках цитоплазмы по границе соединения клеток митохондрии были с разрушенными кристами.
Крупные округлые нейроны со светлой цитоплазмой, с крупными округлыми или несколько удлиненными светлыми ядрами, содержащими малое количество гетерохроматина находились в более спокойном функциональном состоянии (рис. 38).
По морфологическим признакам это были так называемые «светлые» нейроны. Контуры клеточного ядра в некоторых «светлых» нейронах были ровные, а в отдельных клетках имели неровности в виде глубоких инвагинаций или «лопастных» выбуханий (рис. 39). Перинуклеарное пространство у «светлых» клеток почти на всем протяжении было узким (40-50 нм). Под внутренней ядерной мембраной в виде небольших скоплений определялись мелкие частицы краевого гетерохроматина, около них присутствовали перихроматиновые гранулы. В центральных зонах кариоплазмы выявлялся эухроматин. В отдельных ядрах определялось крупное округлое электронноплотное ядрышко (рис. 40).
Во всех «светлых» нейронах в цитоплазме выявлялись небольшие по размерам тельца Ниссля, состоящие из удлиненных единичных канальцев ГЭР и неплотных скоплений рибосом и полисом, единичные мелкие округлые или удлиненные митохондрии с кристами, 1-2 небольших пластинчатых КГ, редко отдельные канальцы ГлЭР с узкими просветами.