Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 10
1.1 Структурно-функциональные особенности клеток сетчатки глаза млекопитающих и человека 10
1.2 Нейронная организация сетчатки глаза млекопитающих и человека 18
1.3 Клетки пигментного эпителия сетчатки глаза млекопитающих и человека 22
1.4 Характеристика глиальных клеток сетчатки глаза млекопитающих и человека 28
1.5 Развитие сетчатки глаза млекопитающих и человека в филогенезе и онтогенезе 34
1.6 Дистрофические заболевания сетчатки глаза человека 36
1.7 Экспериментальные модели животных с дистрофическими изменениями сетчатки глаз 40
Глава 2 Материал и методы исследования 48
Глава 3 Результаты собственных исследований 51
3.1 Структурная организация сетчатки глаза крыс линии Wistar 51
3.1.1 Ультраструктурная характеристика клеток пигментного эпителия сетчатки глаз крыс линии Wistar 52
3.1.2 Ультраструктурные особенности нейронов сетчатки глаз крыс линии Wistar 55
3.1.3 Ультраструктура мюллеровских глиальных клеток сетчатки глаз крыс линии Wistar 61
3.1.4 Наружный и внутренний сетчатые слои и синапсоархитектоника в сетчатке глаз крыс линии Wistar 62
3.2 Структурно-функциональная характеристика сетчатки глаза крыс линии WAG/Rij с генотипами А1А1 и А2А2 65
3.2.1 Ультраструктурные изменения клеток пигментного эпителия сетчатки глаз крыс линии WAG/Rij с генотипами А1А1 и А2А2 68
3.2.2 Ультраструктура нейронов сетчатки глаз крыс линии WAG/Rij с генотипами А1А1 и А2А2 72
3.2.3 Ул ьтраструктурная характеристика мюллеровских глиальных клеток сетчатки глаз крыс линии WAG/Rij с генотипами А1А1 и А2А2 81
3.2.4 Наружный и внутренний сетчатые слои и синапсоархитектоника в сетчатке глаз крыс линии WAG/Rij с генотипами А1А1 и А2А2
3.3 Результаты иммуногистохимических исследований сетчатки глаза крыс линии WAG/Rij с генотипами А1А1, А2А2 и крыс линии Wistar 87
3.4 Сравнительный морфометрический анализ толщины слоев сетчатки глаз крыс линии WAG/Rij с генотипами А1А1 и А2А2 91
ГЛАВА 4 Обсуждение полученных результатов 93
Практические рекомендации 100
Выводы 101
Список сокращений 103
Библиографический список
- Клетки пигментного эпителия сетчатки глаза млекопитающих и человека
- Ультраструктурная характеристика клеток пигментного эпителия сетчатки глаз крыс линии Wistar
- Ультраструктурные изменения клеток пигментного эпителия сетчатки глаз крыс линии WAG/Rij с генотипами А1А1 и А2А2
- Наружный и внутренний сетчатые слои и синапсоархитектоника в сетчатке глаз крыс линии WAG/Rij с генотипами А1А1 и А2А2
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем биологии и медицины является разработка новых методов лечения дегенеративно-дистрофических заболеваний сетчатки глаза, которая, в свою очередь, не может обойтись без экспериментальных моделей на животных (Каламкаров Г.Р. и др., 2008; S. et al., 2002; Wojciechowski A.B. et al., 2002; Bora N.S. et al., 2015). Существует множество моделей с пигментной дистрофией сетчатки, в том числе модели на собаках, кошках, курах, свиньях, мышах и крысах (Поплинская В.А., Строева О.Г., 1990; Милюшина Л.А. и др., 2013; Rivas M.A., Vecino E., 2009). Установлено, что признаки генетически детерминированной врожденной двусторонней дистрофии пигментного эпителия сетчатки глаза выявляются и у крыс линии WAG/Rij. Полученные исследователями данные об этом факте немногочисленны, имеются лишь краткие сведения, опубликованные в 1970-1980 гг. (Lai Y.L. et al., 1975, 1977, 1985; O'Steen W.K., Donnelly J.E., 1982; LaVail M.M. et al., 1987).
Установлено, что эта линия крыс является моделью абсансной эпилепсии (Coenen A.M., van Luijtelaar E.L., 1987; van Luijtelaar G., 1997; Sarkisova K.Yu., Kulikov M.A., 2000; van Luijtelaar G., Zobeiri M., 2013). На основе поведенческих и электрофизиологических исследований сделан вывод о функциональной недостаточности дофаминэргической системы мозга крыс линии WAG/Rij (Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б., 2010; Леушкина Н.Ф. с соавт., 2011; Федорова А.М., 2012; de Bruin N.M. et al., 2000). Леушкина Н.Ф. с соавторами (2011) методом высокоэффективной хроматографии показали снижение содержания дофамина в ткани мозга (в частности в миндалевидном комплексе) и замедление его метаболизма у крыс WAG/Rij с генотипом А2А2 в сравнении с крысами с генотипом А1А1, имеющих различия по локусу Taq 1A DRD2.
Наряду с этим известно, что дофамин и мелатонин, регулируя обновление
наружных сегментов фоторецепторов, играют огромную роль в
функционировании сетчатки глаза ( M.B. et al., 1997; P., 2004; K. et al., 2005; Zhang D.Q. et al., 2008). Вполне вероятно, что отличающиеся по выраженности нарушения в обмене дофамина у крыс линии WAG/Rij с различиями генотипа по локусу Taq 1A гена рецептора дофамина
второго типа (DRD2) могут отражаться на структурной организации сетчатки глаза.
Результаты подробного исследования структурной организации, отдельных иммуногистохимических и количественных характеристик сетчатки глаза крыс линии WAG/Rij могли бы быть полезны как для трактовки изменений в сетчатке глаза человека и животных при патологии, так и для разработки новых подходов профилактики и патогенетического лечения дистрофических и дегенеративных болезней сетчатки. Новые знания по данной теме могут быть полезны при племенной работе в составлении программ разведения кошек и собак, страдающих наследственными заболеваниями глаз (прогрессирующая атрофия сетчатки – PRA – Progressive retinal atrophy).
Цель исследования заключалась в выявлении особенностей морфологии сетчатки глаза гомозиготных крыс линии WAG/Rij с различиями генотипа по локусу Taq 1A гена рецептора дофамина второго типа (DRD2).
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-
Провести сравнительный морфологический анализ сетчатки глаз крыс линии WAG/Rij с различиями генотипа по локусу Taq 1A DRD2 и сетчатки глаз крыс линии Wistar.
-
Изучить ультраструктуру клеток пигментного эпителия сетчатки, нейронов, радиальной глии, сетчатых слоев сетчатки глаза крыс линии WAG/Rij с различиями генотипа по локусу Taq 1A гена рецептора дофамина второго типа (DRD2) в сравнении с сетчаткой глаза крыс линии Wistar.
-
Провести морфометрические исследования толщины слоев сетчатки глаз крыс линии WAG/Rij с различиями генотипа по локусу Taq 1A гена рецептора дофамина второго типа (DRD2).
-
Провести иммуногистохимические исследования содержания кислого глиального фибриллярного белка (GFAP) в сетчатке глаз у крыс линии WAG/Rij с различиями генотипа по локусу Taq 1A DRD2 в сравнении с сетчаткой глаза крыс линии Wistar.
-
Оценить функциональное состояние сетчатки глаз крыс линии WAG/Rij с различиями генотипа по локусу Taq 1A DRD2 на основании полученных результатов морфологических и иммуногистохимических исследований.
Научная новизна. Впервые с помощью гистологических,
иммуногистохимических, электронно-микроскопических и морфометрических
методов установлено, что у гомозиготных крыс линии WAG/Rij с различиями
генотипа по локусу Taq 1A DRD2 патоморфологические изменения
дистрофически-деструктивного характера в сетчатке глаз более выражены у крыс
с генотипом А2А2. Выявлено, что деструктивные изменения сетчатки крыс линии
WAG/Rij характеризуются постепенно убывающей степенью выраженности в
перечисленной последовательности: пигментные клетки эпителия сетчатки –
нейросенсорные клетки – ассоциативные нейроны – радиальная глия –
ганглиозные нейроны. Установлено, что наибольшим морфологическим
изменениям с нарушением межклеточных взаимоотношений подвергаются клетки
пигментного эпителия сетчатки и нейросенсорные клетки. Выявлено, что реакция
глиальных элементов на повреждение пигментных клеток и нейронов сетчатки
глаза у крыс линии WAG/Rij неоднозначна и характеризуется как
деструктивными, так и пролиферативными изменениями. Впервые
иммуногистохимическим методом установлено, что в сетчатке глаз крыс с
генотипом А2А2 определяется более выраженная экспрессия кислого глиального
фибриллярного белка (GFAP), доказывающая большую степень разрушений
нейронов и замещения их пролиферирующей радиальной глией в сравнении с
крысами генотипа А1А1 и крысами линии Wistar. На основании полученных
результатов морфологических и иммуногистохимических исследований сетчатки
глаз крыс линии WAG/Rij с различиями генотипа по локусу Taq 1A DRD2 дана
оценка предполагаемого функционального состояния сетчатки. Выявлено, что у
крыс линии WAG/Rij вне зависимости от генотипа дистрофия клеток пигментного
эпителия сетчатки с нарушением клеточных взаимоотношений с
фоторецепторными нейронами сопровождается сохранением более статичных плоских синапсов и исчезновением характерных для сетчатки ленточных синапсов, что является одним из непосредственных доказательств нарушения функций зрительного анализатора у крыс данной линии.
Практическое и теоретическое значение работы. Получены новые знания о морфофункциональной организации сетчатки глаза гомозиготных крыс линии WAG/Rij с различиями генотипа по локусу Taq 1A DRD2. Результаты диссертационной работы могут быть использованы для разработки новых
подходов профилактики и патогенетического лечения различных видов ретинопатий у человека и у домашних животных в ветеринарной медицине. Полученные новые знания могут быть полезны при племенной работе в составлении программ разведения кошек и собак, страдающих наследственными заболеваниями глаз. Материалы работы можно использовать в учебном процессе при чтении лекций на кафедре гистологии, эмбриологии и цитологии, а также для врачей-офтальмологов и ветеринарных врачей. Материалы работы используются в учебном процессе на лекциях и практических занятиях на кафедре физиологии человека и зоологии Башкирского государственного университета, на кафедре морфологии, патологии, фармации и незаразных болезней Башкирского государственного аграрного университета, на курсах и семинарах повышения квалификации врачей офтальмологов ФГБУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» Минздрава РФ.
Методология и методы исследования. Методологической основой
изучения является комплексный подход, включающий ряд гистологических,
электронно-микроскопических, иммуногистохимических, морфометрических
исследований. Полученные количественные данные подвергали статистической обработке.
Положения, выносимые на защиту:
-
Деструктивные изменения сетчатки крыс линии WAG/Rij характеризуются постепенно убывающей степенью выраженности в перечисленной последовательности: пигментные клетки эпителия сетчатки – нейросенсорные клетки – ассоциативные нейроны – радиальная глия – ганглиозные нейроны. Наибольшим структурным изменениям с нарушением клеточных взаимоотношений между ними подвергаются клетки пигментного эпителия и нейросенсорные клетки сетчатки глаза. Более выраженная степень деструкции клеточных элементов в сетчатке глаза гомозиготных крыс линии WAG/Rij с различиями генотипа по локусу Taq 1A гена DRD2 характерна для крыс с генотипом А2А2.
-
Реакция радиальных глиальных элементов на повреждение пигментных клеток и нейронов в сетчатке глаза крыс линии WAG/Rij неоднозначна и характеризуется как деструктивными, так и пролиферативными
изменениями. Повышенная экспрессия кислого глиального фибриллярного белка (GFAP) в сетчатке крыс с генотипом А2А2 в сравнении с сетчаткой глаза крыс с генотипом А1А1 и сетчаткой глаза крыс линии Wistar – один из признаков более выраженных разрушений нейронов и следующей за ней пролиферации глиальных клеток в сетчатке крыс с генотипом А2А2.
3. У крыс линии WAG/Rij вне зависимости от генотипа дистрофия
клеток пигментного эпителия сетчатки с нарушением клеточных
взаимоотношений с нейронами сопровождается исчезновением характерных лентовидных синапсов, выявляющихся обычно в сетчатке глаза с сохраненной функцией.
Степень достоверности и апробация работы. Результаты исследования получены на современном сертифицированном оборудовании с использованием комплекса адекватных методов сбора и обработки информации. Оценка степени достоверности представленных в диссертационной работе результатов опирается на соответствие теоретических заключений статистическим расчетам комплекса проведенных исследований.
Основные результаты данной работы были представлены на конференциях: Всероссийская заочная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы физиологии, психофизиологии и психологии», Уфа, 2011; XI Международный конгресс ассоциации морфологов, Самара, 2012; XV Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей (с международным участием) «Фундаментальная наука и клиническая медицина – Человек и его здоровье», СПб, 2012; XXIII Всероссийская научно-практическая конференция (с международным участием) «Новые технологии микрохирургии глаза», Оренбург, 2012; Международная научная конференция студентов и молодых учёных (на иностранных языках) «Молодежь и наука», Уфа, 2012; Всероссийская молодежная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы науки и образования», Уфа, 2013; XX и XXII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2013», «Ломоносов-2015», Москва, 2013, 2015.
Публикации результатов исследований. По теме диссертации
опубликовано 13 работ, 5 из которых в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из оглавления, введения, обзора литературы, экспериментальной части (описания материалов и методов исследования), результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, практических рекомендаций, выводов и списка использованной литературы. Указатель литературы содержит сведения о 294 источниках, 75 из которых на русском и 219 на иностранных языках.
Диссертационная работа изложена на 132 страницах компьютерного набора. Иллюстрации представлены 53 рисунками (из них 52 микрофотографии, 1 диаграмма), цифровой материал сгруппирован в 2 таблицах.
Клетки пигментного эпителия сетчатки глаза млекопитающих и человека
Сетчатка глаза (retina) у позвоночных животных представлена высокодифферецированной внутренней оболочкой глаза, имеющая нейральное происхождение (Бойкова Н.Н., 2007; Егоров Е.А., 2010; Friedman N.J. et al., 2009). Как и всем тканям нервной системы, сетчатке характерно слоистая структура. Она состоит из трех слоев тел нейронов, разделенных двумя слоями синапсов, образованных их аксонами и дендритами. По мнению большинства исследователей (Хьюбел Д., 1990; Шадричев Ф.Е., 2008; Cook C.S. et al., 1991) сетчатка является частью мозга, отделившаяся от него на ранних стадиях развития, но все еще связанная с ним при помощи зрительного нерва. Основная функция сетчатки – преобразование светового раздражения в нервное возбуждение и первичная обработка зрительного сигнала, с последующей ее передачей в кору мозга. Трансформации световой энергии в сетчатке способствует сложный фотохимический процесс, при котором происходит разложение фотореагентов с последующим восстановлением, с участием витамина А и других веществ.
Внутренняя оболочка глаза (retina) выстилает изнутри всю поверхность хориоидеи. В соответствии со структурой и выполняемыми функциями в сетчатке различают оптическую (pars optica retinae) и реснично-радужковую (pars ciliaris et iridica retinae) части. Наибольшая по площади оптическая часть простирается от диска зрительного нерва до плоской части циларного тела, где заканчивается зубчатой линией (ora serrata). Ресничная часть сетчатки покрывает заднюю поверхность ресничного тела и радужки до зрачкового края. Здесь (в ресничной части или в этой части) сетчатка, потеряв свои оптические свойства, редуцирована до двух рядов эпителиальных клеток. Подсчитано, (Давыдова Т.В., 1991; Вит В.В., 2003; Егоров Е.А., 2010) что толщина сетчатки у края диска зрительного нерва 0,4-0,5 мм, в области фовеолы желтого пятна – 0,07-0,08 мм, у зубчатой линии – 0,14 мм. Наивысшими зрительными функциями в сетчатке обладает ее центральная часть – желтое пятно (macula lutea) (Бирич Т.А. и др., 2007; Apple D.J., Naumann G.О.Н., 1997). По данным некоторых авторов (Егоров Е.А., 2010), такое название происходит от желтой окраски ямки желтого пятна (fovea) у некоторых позвоночных – человека, обезьяны, цвет которого обусловлен наличием пигментов лютеина и зеаксантина. Макула представляет собой высокоспециализированную область сетчатки, диаметром 6 мм, которая находится в центре фокусирования луча света, попадающего в глаз. Центр макулы имеет небольшое углубление – центральную ямку или фовеолу, являющейся самым тонким местом сетчатки, толщиной не более 0,18 мм и диаметром равным 0,2-0,4 мм. Эта область сетчатки (fovea) содержит популяцию колбочек, обеспечивающих центральное зрение и цветоощущение. Однако, по мнению Демирчогляна Г.Г. (1964), Friedman N.J. et al. (2009), в fovea, наряду с колбочками имеются также и палочки. Рядом авторов (Школьник-Яррос Е.Г., Калинина А.В., 1986; Hendrickson A., Provis J., 2006; Rochon-Duvigneaud A., 1943) обнаружено, что человек и другие приматы имеют одну центральную ямку в каждом глазу, в то время как у некоторых видов птиц их две, а у собак и кошек, вместо ямки в центральной части сетчатки обнаруживается «зрительная полоска».
С помощью различных существующих методов микроскопии было показано, что сетчатка является сложной в морфофункциональном отношении структурой (Егоров Е.А., 2010; Eglen S.J. et al., 2014). Исследования ее отдельных аспектов строения продолжаются и в настоящее время.
Установлено (Хэм А., Кормак Д., 1983; Школьник-Яррос Е.Г., Калинина А.В., 1986; Ramon-y-Cajal S., 1972), что сетчатка глаза млекопитающих животных и человека состоит из деяти слоев. В соответствии с принятой в настоящее время номенклатурой слои сетчатки имеют следующие названия: 1) Слой клеток пигментного эпителия; 2) Слой наружных и внутренних сегментов фоторецепторов; 3) Наружная пограничная мембрана; 4) Наружный ядерный слой; 5) Наружный сетчатый слой; 6) Внутренний ядерный слой; 7) Внутренний сетчатый слой; 8) Ганглионарный слой; 9) Слой нервных волокон; 10) Внутренняя пограничная мембрана. Не углубляясь в детали, рассмотрим каждый слой по отдельности. Итак, сразу под сосудистой оболочкой находится слой пигментных эпителиальных клеток, составляющие пигментный эпителий, который простирается на всем протяжении оптической части сетчатки и имеет непосредственную связь со стекловидной пластинкой. Пигментный эпителий представляет собой однослойный эпителиальный ряд клеток гексагональной формы, содержащих пигментные (меланиновые) гранулы.
Ретинальный пигментый эпителий является одной из важных структур зрительной системы, который жизненно необходим для поддержания функциональной целостности сетчатки. Пигментный эпителий поглощает и трансформирует лучи света, устраняя его диффузное рассеивание внутри глаза (Hewitt A., Adier R., 1989; Strauss O., 2005). Также, одной из важных функций пигментных клеток является фагоцитоз постоянно отделяющихся концов наружных сегментов фоторецепторов с возвращением метаболизированного зрительного пигмента в фоторецепторы (Вит В.В., 2003; Strauss O., 2005).Пигмент меланин, содержащийся в меланосомах, поглощает свет, который проходит сквозь сетчатку, и в микроворсинках изолирует наружные сегменты друг от друга, увеличивая остроту зрения (Hill H.Z. et al., 1997; Ardura J. et al., 2010; Stefanova N.A. et al., 2013). Необходимо отметить, что нарушение функции пигментного эпителия лежит в основе развития ряда заболеваний. Его структурные изменения выявлены при возрастной макулопатии, центральной серозной ретинопатии, дистрофии сетчатки (Муслимов С.А., 2000; Вит В.В., 2003; Bird A.C., 1995; Mookiah M.R. et al., 2014).
Ультраструктурная характеристика клеток пигментного эпителия сетчатки глаз крыс линии Wistar
Шведская порода собак бриар, благодаря наличию мутации в гене RPE65 является подходящей моделью аутосомного рецессива пигментного ретинита и врождённого амавроза Лебера у человека, проявляющегося в раннем возрасте и сопровождающегося прогрессирующей дистрофией сетчатки (Marlhens F. et al., 1997; Chen Y. et al., 2006). Посредством электроретинограммы у мышей с мутированным белком RPE65 не выявлена функция палочковых клеток сетчатки, ввиду отсутствия родопсина в дисках наружного сегмента. Благодаря этому, они являются превосходной моделью животных, сетчатка которых состоит только из колбочек (Lund R.D., Coffey P.J. et al., 1997; Marlhens F. et al., 1997; Bandyopadhyay M. et al. 2013).
Относительно недавно, Weng J. и его коллеги выявили популяцию мышей с отключенным геном краевого протеина – ABCR (Weng J. et al., 1999). Показано (LaVail M.M., Blanks J.C. et al., 1982; Koulen P., 1999), что вследствие нулевой мутации, у них наблюдается повышение уровня полного трансретинальдегида под воздействием света и быстрое накопление липофусцина, сопровождаемое утолщением мембраны Бруха, между РПЭ и хориоидеей. Потеря клеток РПЭ постепенно ведет к вторичной дегенерации фоторецепторов сетчатки. Мыши с отключенным геном ABCR могут применяться в качестве модели для изучения рецессивной болезни Штаргардта человека и патогенеза возрастной макулярной дегенерации (ВМД) (Hafezi F., 2000; Westerfeld C., Mukai S., 2008).
Крысы линии OXYS, созданные в институте цитологии и генетики СО РАН, путем селекции и инбридинга крыс WISTAR, широко используются в качестве адекватной модели для изучения механизмов развития дегенерации сетчатки (Колосова Н.Г. и др., 2003). Основной характеристикой крыс линии OXYS является повышенное радикалообразование, приводящее к преждевременному старению и связанных с ним заболеваний. Другими словами, генетически детерминированное нарушение метаболизма, выражается в повышенной чувствительности крыс OXYS к окислительному стрессу, что, в свою очередь, снижает эффективность работы защитных механизмов. Также, высокий уровень генерации кислородных радикалов способствует развитию деструктивных изменений в сетчатке (Колосова Н.Г. и др., 2003; Beregovoy N.A. et al., 2011). Морфологическими методами показано, что у крыс линии OXYS в сетчатке наблюдается тенденция к развитию гипоксии, нарушению кровоснабжения сетчатки, которому способствуют значительные нарушения в структуре пигментного эпителия, мембраны Бруха, эндотелия капилляров. Отмечено (Жданкина А.А. и др., 2009), что процесс дегенерации также затрагивает нейросенсорные клетки сетчатки, которые, по всей видимости, являются следствием гипоксии и снижения функциональной активности пигментного эпителия.
В вивариях Института биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук, Института цитологии и генетики СО РАН разводят экспериментальных крыс линии Campbell и Hunter. Это мутантные линии с наследственной дистрофией сетчатки глаза. Известно, что в 1938 году в Шотландии M. Bourne с соавт. описали пигментную атрофию сетчатки у крыс линии Campbell с наследственной пигментной дистрофией сетчатки. Дегенеративно-дистрофические изменения сетчатки начинают развиваться после 17-20 суток с момента рождения крысят. К концу второго месяца жизни животные слепнут (Милюшина Л.А. и др., 2013). Эти линии крыс используются как в виде модели для изучения наследственных заболеваний глаза у человека, так и для разработки патогенетических методов лечения наследственных ретинопатий (Поплинская В.А., Строева О.Г., 1990; Хараузов А.К. и др., 1996; Тахчиди Х.П. и др., 2010; Rivas M.A., Vecino E., 2009).
Крысы инбредной линии WAG/Rij выведены в 1924 году в Великобритании в ходе многократного (более 130 поколений) близкородственного скрещивания крыс линии Wistar Albino Glaxo (Wistar Albino Glaxo Laboratory, UK). Позже эта линия крыс была ввезена в Нидерланды (REPGO Institute of TNO at Rijswijk, The Netherlands) (Lai Y.L. et al., 1980; Depaulis A., van Luijtelaar G., 2006). Крысы WAG/Rij, помимо того, что характеризуются наличием абсансной эпилепсии, также, являются моделью наследственной дегенерации сетчатки (Cillino S. et al., 1993; Coppola A., Mosh S.L., 2012; van Luijtelaar G., Zobeiri M., 2013). Дегенерация затрагивает колбочки и палочки, и в меньшей степени клеток во внутреннем ядерном слое. Изменениям подвергается пигментный эпителий сетчатки, которому сопутствуют изменения в метаболизме. Предполагается, что причиной дистрофии слоя пигментного эпителия сетчатки у крыс линии WAG/Rij может являться недостаточное количество клеток Мюллера (O Steen W.K., Donnelly J.E., 1982). У крыс линии WAG/Rij было проведено генотипирование локуса Taq 1A DRD2 с последующим скрещиванием гомозиготных особей. Было получено две сублинии гомозиготных крыс с генотипами А1А1 и А2А2 по указанному локусу, которые к настоящему моменту прошли более 20 поколений (Калимуллина Л.Б. и др., 2005). На основе поведенческих и электрофизиологических исследований сделан вывод о функциональной недостаточности дофаминэргической системы мозга крыс линии WAG/Rij (Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б., 2010; Леушкина Н.Ф. с соавт., 2011; Федорова А.М., 2012; de Bruin N.M. et al., 2000). Леушкина Н.Ф. с соавторами (2011) методом высокоэффективной хроматографии показали снижение содержания дофамина в ткани мозга (в частности в миндалевидном комплексе) и замедление его метаболизма у крыс с генотипом А2А2 в сравнении с крысами с генотипом А1А1.
Таким образом, на сегодняшний день многие экспериментальные модели животных с дегенерацией сетчатки глаза как никогда имеют важное значение в науке и служат достижению ряда задач: во-первых, они используются для изучения молекулярных механизмов, приводящих к деструкции клеток сетчатки. Во-вторых, в огромном многообразии различных подходов они служат основой использования терапевтических методов для замедления или даже полного прекращения апоптоза фоторецепторов. Наконец, они являются базой для развития экспериментальной соматической генной терапии, самого многообещающего подхода к сохранению целостности структур сетчатки (Hafezi F., 2000; Eguibar J.R., Corts M.C., 2010). Результаты исследования строения и отдельных количественных параметров сетчатки глаза крыс линии WAG/Rij могут послужить в качестве полезной модели как для изучения сетчатки глаза человека при патологии, так и явиться теоретической базой для разработки новых методов лечения.
Ультраструктурные изменения клеток пигментного эпителия сетчатки глаз крыс линии WAG/Rij с генотипами А1А1 и А2А2
Этот факт был подтвержден подсчетом количества меланосом в пигментных клетках сетчатки глаз крыс линии WAG/Rij и крыс линии Wistar (Рисунок 26). Так как в ПЭС крыс обоих генотипов часто совсем отсутствовали меланосомы, подсчет их производили без деления крыс на генотипы. Количество меланосом в цитоплазме клеток крыс линии WAG/Rij было снижено, чем у крыс линии Wistar (17,18±0,61 и 1,34±0,22 соответственно, при p 0,05).
Ультраструктура нейронов сетчатки глаз крыс линии WAG/Rij с генотипами А1А1 и А2А2 Разрушения нейронов как во внутреннем, так в наружном ядерном слое сетчатки и ганглиозном слое были более выражены в сетчатке крыс с генотипом А2А2. Наружные сегменты ФР на отдельных участках разрушались, они как бы раздвигались, на их месте формировались большие вакуоли (Рисунки 27 и 28). Многие наружные сегменты ФР теряли параллельность расположения дисков.
Нарушение структуры НСФ сетчатки глаза крысы линии WAG/Rij (генотип А2А2). Обозначения: НСФ - наружные сегменты фоторецепторов. Стрелкой (Т) показаны вакуоли, разрывы. Электронная микрофотография. Увел. 8 000.
Межфоторецепторный матрикс был представлен в виде слабого электронно-плотного аморфного вещества, местами он тоже подвергался деструкции. Отдельные митохондрии во внутренних сегментах подвергались деструктивным изменениям, матрикс был вакуолизирован, другие органеллы плохо просматривались. Каналы гЭПР расширялись, наблюдалось неравномерное расположение и исчезновение с них рибосом. Наружняя глиальная мембрана была выражена нечетко.
Во внутренних сегментах ФР обнаруживалось большое количество вакуолей разных размеров и «разрывы» цитоплазмы. Такие же разрывы встречались в области НЯС вокруг ФР в виде больших светлых пространств между клетками (Рисунки 29 и 30). Ядра ФР были округлой формы с крупными глыбками хроматина. Цитоплазма сохранившихся клеток вокруг ядра была очень узкой. Иногда она формировала различные выпячивания (Рисунок 31). В некоторых участках наружнего ядерного слоя расширялись перинуклеарные пространства ФР. В узкой цитоплазме определялось небольшое количество органелл, чаще это были свободные рибосомы.
Клетки внутреннего ядерного слоя были отечными, поэтому не поддавались дифференцировке по ультраструктурным признакам. Мы отличали их только по месту расположения относительно клеточного слоя. По нижней границе клеточного слоя в норме обычно располагаются горизонтальные нейроны. В цитоплазме предполагаемых нами горизонтальных клеток вместо органелл выявлялось множество крупных и мелких светлых вакуолей – вакуолизировались митохондрии и каналы гранулярного эндоплазматического ретикулума (Рисунок 32). У крыс с генотипом А2А2 наряду с такими изменениями выявлялись даже горизонтальные нервные клетки с опустошенной цитоплазмой (Рисунок 33).
Ультраструктура горизонтального нейрона сетчатки глаза крысы линии WAG/Rij (генотип AJAJ). Обозначения: я - ядро горизонтальной клетки. Стрелкой (Т) показаны вакуолизирующиеся митохондрии. Электронная микрофотография. Увел. х 12 000.
Ультраструктура горизонтального нейрона сетчатки глаза крысы линии WAG/Rij (генотип А2А2). Обозначения: я – ядро горизонтальной клетки. Электронная микрофотография. Увел.14 000. Цитоплазма биполярных нейронов была также часто отечной, cодержала крупные вакуоли, перинуклеарное пространство у многих клеток было расширено. Основные органеллы в цитоплазме разрушались или вакуолизировались (Рисунки 34 и 35). Амакринные клетки имели большое светлое ядро с равномерно рассеянным хроматином и небольшим ядрышком, светлую цитоплазму с многочисленными вакуолями разных размеров и редко встречающимися короткими цистернами гранулярного эндоплазматического ретикулюма (Рисунки 36 и 37). Внутриклеточные разрушения определялись и в ганглиозных клетках внутреннего ядерного слоя сетчатки крыс. Кроме признаков деструкции органелл (митохондрий, каналов гЭПР и глЭПР, пластинчатого комплекса Гольджи, полирибосом) наряду с определяющимися в цитоплазме вакуолями, в сетчатке крыс с генотипом А2А2 выявлялись ганглиозные нейроны с опустошенной цитоплазмой (Рисунки 38 и 39).
Реакция радиальных мюллеровских глиоцитов сетчатки глаза крыс линии WAG/Rij обоих генотипов на дегенерацию пигментных клеток и повреждение нервных клеток была неоднозначной и характеризовалась как деструктивными, так и пролиферативными изменениями. Изменялась структура глиальных клеток. Тела мюллеровских глиоцитов во многих участках сетчатки оказывались как бы сжатыми между отечными клетками ВЯС (Рисунок 40). Ядра были веретенообразной формы с равномерно распределенным хроматином. Цитоплазма у таких глиоцитов вокруг ядра была представлена в небольшом объеме, плотная, cодержала редкие короткие цепочки гранулярного эндоплазматического ретикулюма, каналы гладкого эндоплазматического ретикулюма и иногда небольшое количество гранул гликогена. Микрофиламенты в цитоплазме не определялись. Другой противоположный вариант патологических изменений заключался в вакуолизации цитоплазмы радиальных глиоцитов (Рисунок 41). У таких глиоцитов, наоборот, ядра были крупными, как бы набухшими.
Ближе к наружной глиальной мембране в отростках мюллеровских глиоцитов митохондрии подвергались диффузной гомогенизации или вакуолизации. Матрикс некоторых митохондрий был просветлен и содержал хлопьевидный материал. Двухконтурность наружной оболочки сохранялась. Ниже наружной глиальной мембраны микроворсинки мюллеровских глиоцитов, погружаясь в МФМ, плотно обхватывали внутренние сегменты ФР. Происходило набухание микроворсинок, они становились толще и короче.
В области наружного ядерного слоя отростки мюллеровских глиоцитов были не характерно широкими, имели электронно-плотный матрикс с нечеткими микрофиламентами и плотными цитоплазматическими тяжами, единичными гранулами гликогена (Рисунок 42). Витреальные отростки мюллеровских глиоцитов вакуолизировались, а внутренняя глиальная мембрана почти не изменялась. В них не выявлялись гранулы гликогена.
Наружный и внутренний сетчатые слои и синапсоархитектоника в сетчатке глаз крыс линии WAG/Rij с генотипами А1А1 и А2А2
Результаты наших исследований показали, что одним из главных отличительных морфологических признаков организации сетчатки глаз половозрелых крыс линии WAG/Rij от сетчатки крыс линии Wistar и других млекопитающих является дистрофия клеток пигментного эпителия сетчатки. В цитоплазме клеток ПЭС у крыс линии WAG/Rij разрушаются, в первую очередь, пигментные гранулы – меланосомы, выявляются лишь единичные. Вместо них часто определяются липофусциновые гранулы – пигмент «изнашивания». Нужно отметить, что при этом почти все остальные органеллы также претерпевают какие-либо деструктивные изменения. Так митохондрии набухают, происходит или их вакуолизация с полным просветлением матрикса и деструкцией крист, или же, наоборот, помутнение матрикса с разрушением крист, а также некоторые из них подвергаются жировому перерождению. Цистерны гладкого эндоплазматического ретикулюма в апикальной части клетки вакуолизируются. Органеллы, причастные к белковому обмену, в частности каналы гЭПР, расширяются и теряют рибосомы. Ослабляется одна из главнейших функций клеток ПЭС – фагоцитарная, об этом свидетельствует отсутствие в цитоплазме специфичных гетерофагосом, содержащих фрагменты наружных сегментов фоторецепторов. Утолщенные и укороченные микровиллы клеток ПЭС не способны к плотному обхватыванию наружных сегментов ФР и поддерживанию межклеточных взаимоотношений. Все эти перечисленные патоморфологические изменения, несомненно, должны отразиться на основной функции сетчатки глаза -зрительной.
Ранее придавали основное значение только двум функциям пигментного эпителия – как светопоглощающего экрана и неотъемлемого участника в цикле восстановления родопсина (Донцов А.Е., Островский М.А., 1984; Wald, 1986; Blanks J.C., 1989). На самом деле клетки ПЭС – это полифункциональная система, от полноценной деятельности которой зависит жизнеспособность сетчатки и всей зрительной системы (Панова И.Г., 1993; Вит В.В., 2003; Strauss O., 2005). Дисфункция клеток ПЭС приводит к дистрофии всех слоев сетчатки глаза (Муслимов С.А., 2000; Zarbin M.A., 1998). Выполнение многочисленных функций ПЭС осуществляется благодаря высокоспециализированной структурной организации его клеток (Панова И.Г., 1993). Меланосомы пигментного эпителия, поглощая избыточные кванты света, повышают разрешающую способность фоторецепторных нейронов, защищают сетчатку от повреждающего действия света и ультрафиолетовых лучей. Меланин играет также и защитную роль, предохраняя наружные сегменты ФР от перекисного окисления липидов (Островский М.А. и др., 1988). Факт почти полного разрушения меланосом в клетках ПЭС крыс линии WAG/Rij, несомненно, свидетельствует о выпадении вышеперечисленных функций клеток, которые вносят большой вклад в нормальное функционирование зрительного анализатора.
Клетки ПЭС переваривают фагоцитированные части наружных члеников палочек и колбочек ФР благодаря наличию хорошо развитой лизосомной системы. В пигментных клетках крыс линии WAG/Rij лизосомы определялись редко, что является доказательством ослабления катаболизма в данных клетках. О снижении уровня метаболических процессов свидетельствовало и закономерное накопление включений липофусцина. А катаболитические и метаболические процессы в клетках неразделимы. Известно, что наряду с эстерификацией, изомеризацией, хранением и транспортом витамина А в клетках ПЭС осуществляется и синтез межклеточного матрикса: межфоторецепторного матрикса и базального компонента базальной мембраны (Hewitt A., Adier R., 1989). Клетками ПЭС осуществляется транспорт большого количества метаболитов к зрительным нейронам и от них в направлении сосудистой оболочки (Панова И.Г., 1993; Hicks D., Malecaze F., 1990; Lutty G. et al., 1999; Strauss O., 2005). Учитывая вышеперечисленные данные, нельзя отрицать, что патоморфологические изменения, выявленные нами в клетках ПЭС глаза крыс линии WAG/Rij, отрицательно влияют на ход физиологических процессов в сетчатке глаза, обеспечивающих ее нормальное функционирование.
Для понимания механизмов дегенеративно-дистрофических процессов, протекающих у человека при таком относительно распространенном заболевании, как пигментный ретинит, крысы линии WAG/Rij являются уникальной системой и новой потенциально очень полезной моделью дистрофии пигментного эпителия сетчатки глаза (Островский М.А. и др., 1988). Известно, что пигментный ретинит – одна из основных причин слабовидения и слепоты у людей. Болезнь выражается в постепенной деструкции фоторецепторного слоя сетчатки, а именно, исчезают их наружные сегменты, что и обуславливает потерю зрения. Существенное значение в процессе развития болезни имеет нарушение метаболических взаимоотношений между сетчаткой и пигментным эпителием (Панова И.Г., 1993). Экспериментальную модель крыс линии WAG/Rij с дистрофией пигментных клеток сетчатки можно рекомендовать использовать для разработки методов лечения дегенеративных заболеваний сетчатки глаза человека и животных. Выбрав правильную тактику лечебных мероприятий направленных, в первую очередь, на восстановление и поддержание состояния клеток пигментного эпителия сетчатки, а также восстановление межклеточных контактов с фоторецепторными клетками, вероятно, можно добиться в какой-либо мере стабилизации физиологических процессов в сетчатке глаза пациентов с пигментными ретинитами (врожденное заболевание) и возрастной макулодистрофией (приобретенное заболевание). Наряду с вышеописанными изменениями клеток ПЭС в сетчатке глаз крыс линии WAG/Rij и с генотипом А1А1, и с генотипом А2А2 по локусу Taq 1A гена рецептора дофамина второго типа (DRD2) нами были обнаружены выраженные признаки разрушения фоторецепторных нейронов в слое палочек и колбочек, в наружном ядерном слое, а также частичной деструкции биполярных, амакриновых и горизонтальных нейронов во внутреннем ядерном слое сетчатки со структурными изменениями их отростков. Дистрофические процессы касались и нейронов самого внутреннего слоя сетчатки – ганглиозных клеток. Изменения сетчатки крыс линии WAG/Rij с различиями генотипа по локусу Taq 1A гена DRD2 характеризовались деструкцией постепенно убывающей в перечисленной последовательности: пигментные клетки эпителия сетчатки – нейросенсорные клетки – ассоциативные нейроны – радиальная глия – ганглиозные нейроны. Известно, что патологические изменения в нейронах сетчатки часто развиваются вследствие дисфункции дегенерировавших клеток пигментного эпителия сетчатки (Панова, И.Г., 1993; Муслимов С.А., 2000). Дисфункция же пигментных клеток может выражаться не только в нарушении основной их деятельности – фагоцитоза фрагментов наружных сегментов фоторецепторных нейронов. Выпадение любой из многочисленных функций клеток ПЭС обычно приводит к патологическим процессам во всех слоях сетчатки и, как следствие, опять же к расстройству функций зрительного анализатора (Панова И.Г., 1993).
Несмотря на общность патоморфологических признаков в сетчатке крыс линии WAG/Rij с разными генотипами по локусу Taq 1A гена рецептора дофамина второго типа (DRD2) нами было выявлено, что процессы деструкции клеток ПЭС и нейронов во всех слоях сетчатки более выражены у крыс с генотипом А2А2. Не исключено, что это может быть связано с более выраженной функциональной недостаточностью дофаминэргической системы нервной ткани крыс генотипа А2А2 по сравнению с крысами генотипа А1А1. Функциональная недостаточность дофаминэргической системы мозга крыс линии WAG/Rij хорошо изучена на основе поведенческих и электрофизиологических исследований Ахмадеевым А.В., Калимуллиной Л.Б. (2010), Леушкиной Н.Ф.и соавт. (2011), Федоровой А.М. (2012). Леушкина Н.Ф. с соавторами (2011) методом высокоэффективной хроматографии показали снижение содержания дофамина в ткани мозга (в частности в миндалевидном комплексе) и замедление его метаболизма у крыс с генотипом А2А2 в сравнении с крысами с генотипом А1А1.