Введение к работе
Актуальность темы. В решениях XXVII съезда КПСС под-черкивается-важность внедрения новых достижений науки во все области народного хозяйства. В «Основных направлениях экономического и социального развития СССР на 1986— 1990 годы и на период до 2000 года» указывается на необходимость улучшения сельскохозяйственных животных путем использования достижений генетики и селекции. Претворение в жизнь решений XXVII съезда КПСС и реализация продовольственной программы выдвигает перед учеными задачи разработки эффективных методов и приемов селекции, способствующих решению поставленных задач. На современном этапе наиболее эффективной мерой в достижении этой цели является использование в животноводстве одного из направлений современной генетики — иммунной и биохимической'ге-нетики.
Группы кровн и полиморфные системы белков и ферментов успешно применяются в селекции в качестве возможных маркеров количественных признаков. Открытие и изучение генетических систем аллотипов эритроцитарных антигенов и полиморфных белков крови дало селекционерам методы объективного контроля родословных животных, маркирования пород, линий, семейств, повышения жизнеспособности молодняка при отборе стрессоустойчивых и резистентных животных.
В коневодстве использование генетических маркеров необходимо как для экспертизы происхождения, генетической маркировки и идентификации лошадей на ипподромах и конных заводах, так и для решения частных вопросов повышения эффективности селекции. Поэтому научный поиск и разработка путей и специальных методов использования имму-ногенетических маркеров для повышения эффективности селекционной работы в коневодстве приобретают особую актуальность.
Тема диссертации является составной частью плана научно-исследовательских работ по коневодству в отраслевой
и - - < j , , ..,#
CS.4 . \ . .;>|
научно-технической программе О.СХ.44 Государственного агропромышленного комитета СССР (тема 02 «Усовершенствовать и внедрить методы использования иммуногенетических маркеров в коневодстве», номер государственной регистрации 107756) и связана с целевой комплексной программой 0.51.25.
Цель и задачи исследований. Основной целью исследований являлось изучение генетических особенностей эритроци-тарных антигенов и полиморфных белков и ферментов крови лошадей и выяснение возможности их использования для повышения эффективности племенной работы в коневодстве. Исходя из этой цели были поставлены следующие задачи: Г Обобщить имеющуюся информацию по генетике полиморфных систем крови у лошадей.
-
Разработать и внедрить в производство эффективный метод иммуногенетического контроля достоверности происхождения лошадей.
-
На основе изучения существующих технологий получения сывороток-реагентов для определения групп крови сельскохозяйственных животных разработать и предложить производству усовершенствованный метод изготовления сывороток-реагентов для определения групп крови лошадей, вклю- чающий способ повышения эффективности иммунизации реципиентов.
-
Исследовать генетические маркеры и изучить особенности аллелофонда лошадей верховых, рысистых и тяжеловозных пород. Определить целесообразность использования генетических маркеров (групп крови и полиморфных белков)-при изучении генетической структуры пород лошадей.
5. Изучить связь полиморфных систем белков „ и групп крови с воспроизводительными функциями лошадей.
Научная новизна результатов исследований. Впервые определены у лошадей генетические обусловленные полиморфные системы белков, ферментов и групп крови. Изучены их генетические особенности, характер наследования и феноти-пнческие изменения в онтогенезе.
Полученные данные использованы как источник информации о генетической структуре пород лошадей, выявлении межпородных и внутрипородных различий и связей, определении консолидации и гомогенности популяций, при контроле достоверности происхождения.
Впервые получены идентифицированные с международными стандартами сыворотки (реагенты) для определения групп крови лошадей. Организовано их изготовление для научных и производственных целей и создан Всесоюзный банк реагентов.-Разработаны и внедрены в производство методы изготовления сывороток-реагентов для- определения, эритро-
- о
цитарных антигенов у лошадей и контроля достоверности их происхождения по полиморфным системам белков и группам крови. Впервые при проведении иммунизации применен биогенный препарат продигиозан, повышающий иммунологическую активность продуцентов, а при изготовлении сывороток-реагентов использовано криоконеервирование больших объемов эритроцитов в условиях ультранизких температур.
Изучены полиморфные системы белков, ферментов и групп крови в аспекте' их взаимосвязи с воспроизводительными способностями лошадей.
Теоретическая и практическая значимость работы. Проведенные исследования позволили получить данные об аллело-фонде лошадей верховых, рысистых и тяжеловозных пород, которые имеют теоретическое значение при систематике пород, служат источником информации об их генетической структуре и составляют материалы учета аллелофонда основных пород лошадей в СССР.
Разработанный и внедренный в практику коннозаводства метод контроля достоверности происхождения лошадей позволил снизить за 10 лет число недостоверных записей с 16,0 до 4,5%. Данные о происхождении племенных лошадей регулярно передаются на племенные фермы и в конные заводы, используются для подтверждения происхождения при трансплантации яйцеклеток и искусственном осеменении, записываются в международный регистр при продаже арабских и ахалтекинских лошадей на международных аукционах, служат основанием для записи племенных лошадей в госплем-книги.
Экономический эффект от проведенного за 5 лет контроля достоверности записей происхождения 21314 лошадей составил 1188633 рубля.
Разработанный и внедренный способ повышения иммунологической активности реципиента позволил за один год повысить эффективность иммунизации на 30% и увеличить производство сывороток-реагентов с 4,0 до 20,0 тысяч тесто-доз.
Изучение взаимосвязи полиморфных систем белков и групп крови с воспроизводительными способностями лошадей позволило разработать способы, обеспечивающие повышение их плодовитости. '
Публикация материалов исследований. Материалы диссертационной работы опубликованы в научных журналах: «.Сельскохозяйственная биология», «Доклады МОИП», научно-производственном журнале «Коневодство и конный спорт», в сборниках научных трудов, журналах и сборниках международного общества по изучению групп крови и биохимического полиморфизма животных, а также общества биологии вос-
производства. По материалам диссертации опубликовано 53 научных статьи.
Апробация работы. Основные положения диссертации апробированы на трех научно-технических советах МСХ СССР в 1974, 1980, 1985 годах, по материалам которых утверждены три методические рекомендации и технические условия. Материалы диссертационной работы доложены на: 2—3-й конференциях молодых ученых по разведению и генетике сельскохозяйственных животных (ВНИИРГЖ, г. Пушкин, 1970— 1971), 15- и 16-й Международных конференциях по группам крови и биохимическому полиморфизму животных (Ирландия, Дублин, 1976, Ленинград, 1978), научной конференции «Повышение эффективности методов генетики и селекции в животноводстве» (Байсогола, 1978), 2-ом Всесоюзном симпозиуме по иммунологии воспроизведения (Москва, 1980), научно-технических советах МСХ СССР (Москва, 1974, 1980, 1985), 5- и 6-ом Международных симпозиумах «Иммунология репродукции» (Болгария, Варна, 1982, 1985), 33-й ежегодной конференции Европейской Ассоциации по животноводству (Ленинград, 1982), Всесоюзном симпозиуме «Биохимия сельскохозяйственных животных и продовольственная программа» (Ташкент, 1986).
Объем работы. Диссертация изложена на 339 страницах, содержит 117 таблиц, 2 графика. Список использованной литературы содержит 385 наименований, в том числе 188 на иностранных языках.
Материал и общая методика исследований. Основу работ по изучению особенностей аллелофонда лошадей 12 пород, разработке теоретических основ и методов использования достижений иммунной и биохимической генетики в племенной работе в коневодстве составили материалы, в сборе и обработке которых автор принимал непосредственное участие в течение 20 лет.
Объектом исследования при изучении генетически обусловленных полиморфных систем крови служили более 20 тысяч лошадей чистокровной арабской, чистокровной верховой, ахалтекинской, терской, тракененской, донской, буденновской, орловской и русской рысистых, русской, владимирской и советской тяжеловозных пород, разводимых в 40 конных заводах и 16 племенных фермах колхозов и совхозов РСФСР, Украины, Белоруссии, Грузии, Туркмении, Азербайджана.
При сравнении наблюдаемого числа исключений отцовства с предполагаемым и контроля надежности систем при исключении «недействительных» родителей соответствующие тесты проведены в трех вариантах экспериментальных случаев. При проведении первого варианта в эксперимент были
включены 84 матки с жеребятами известного происхождения и 15 произвольных жеребцов, которые заведомо не являлись' отцами этих жеребят. Исключение ложного отцовства проводили с использованием каждой из шести полиморфных систем: Tf, Л1, Es, 6-PGD, PGM, PHI. Второй вариант—комиссионно проведенная «закрытая» экспертиза с закодированными образцами крови от 20 кобыл, их жеребят и трех возможных отцов. Используя полиморфные системы Ti + AL + Es + Pi, устанавливали для каждого жеребенка истинного отца, исключая дзух ложных.
В третьем варианте ложное отцовство исключали у 300 лошадей чистокровной верховой, ахалтекинской и терской пород но сумме и различным сочетаниям полиморфных систем Tf+Al + Pi + Cp-j-Ca + Es.
Изучение фенотипнческих изменений полиморфных систем белков и ферментов крови п онтогенезе лошадей и процессе храпения образцов сыворотки проводили сравнением фенотипов альбумина, трансферрина, эстеразы утробного плода, новорожденных, жеребят в месячном и старше одного месяца возрасте и их родителей. Предполагаемый возраст плодов определяли по весу и длине тела эмбриона по методу В. Акатова п др. (1977).
Фенотипические изменения белков и ферментов в сыворотке крови, происходящие в процессе двух и пятилетнего хранения образцов при температуре минус '20 С, определяли горизонтальным электрофорезом в крахмальном геле с использованием специфических для каждой системы методик.
При разработке методов, повышающих эффективность проводимых иммунизации, использовали биогенный препарат про-дигиозан. Отработка оптимальной дозы препарата и сроков его введения проведена в течение двух лет, в восьми опытах, на 70 животных. '
В опытах по криоконсервиропанию эритроцитов в условиях ультранизких температур (—196 С) изучали эффективность 17 криозащитных веществ (сахаров и многоатомных спиртов), действующих интра- и экстрацеллюлярно.
Исследования но изучению содержания железа в сыворотке крови лошадей проводили на кафедре биофизики МВА'на атомспектрофогометре. Статистическую обработку этого материала проводили методом дисперсионного анализа двух-факторных комплексов на ЭВМ-ЕС-1035.
При изучении взаимосвязи полиморфных систем, белков и ферментов крови с воспроизводительными функциями лошадей анализировали результаты 27345 спариваний 8799 кобыл 10 пород с 830 жеребцами за период с 1963 по 1979 годы. Показателями, характеризующими воспроизводительную способность, считали зажерсбляемость, число абортов, прохоло-
. ' 5
стов и процент благополучной выжеребки. Исследования проводили с учетом возрастных групп животных, как суммарно, так и отдельно по породам и конным заводам.
Две серии контролируемых подборов проводили в шести конных заводах, на 555 кобылах и 59 жеребцах. Результаты случки и выжеребки при этом подтверждали актами спе-циалистов'этих хозяйств.
При изучении воспроизводительных функций лошадей в зависимости от групп крови анализировали результаты плодовой деятельности 786 кобыл арабской породы, принадлежащих Терскому конному заводу за период с 1974 по 1984 годы. При этом результаты спариваний кобыл с жеребцами изучали в зависимости от характера их подборов по системе D групп крови, антигенного сходства спариваемых родителей и возможности возникновения материнско-нлодовой иммунологической несовместимости.
Антигены эритроцитов определяли с помощью 16 сывороток-реагентов, которые были изготовлены нами в лаборатории иммуногенетики ВНИИ коневодства. Специфичность реагентов подтверждали в Международных сравнительных испытаниях. Полиморфные системы белков и ферментов крови выявляли горизонтальным электрофорезом в крахмальном геле, по О. Смитису (1955) в различных модификациях. Типы трансферрина и альбумина определяли по Б. Ганэ (1966), — эстеразы — по К. Томашевской-Гушкевич (1976), карбоан-гидразу и кислую фосфогазу — по К. Сандбергу (1968), пре-альбумины — но М. Бренду (1967, 1970), 6-фосфоглюконат-дегидрогеназу, фосфоглюкомутазу, фосфогексозу-изомеразу— по С. Бенгтссону, К. Сандбергу (1973), каталазу — по Е. Кел-ли, К. Стормонту (1971).
Частоту антигенных факторов вычисляли но Л. Животов-скому и А. Машурову (1974), частоты генов для электрофо-ретических систем определяли путем простого подсчета генов по формуле, выведенной из уравнения Харди-Вайнберга. Расчет концентрации аллелей в двухаллельных системах С, К, U групп крови, где генотипы серологически не выявляются, проводили по формуле Харди-Вайнберга (1908), а в более сложных системах, Л, Р, Q групп крови по формуле Ф. Бер-нштейна (1930), предложенной им для определения частот аллелей в группах крови АВО человека.
В сложной закрытой системе D групп крови определения частот аллелей проводили аллокашгонным методом А. Ней-манна-Соренсена (1956).
Показатель «вероятности исключения», определяющий вероятность возможности определения ошибочного родителя, рассчитывали по формуле А. Джемисона (1978). Показатели объединенного эффекта исключения в разных сочетаниях и
по всем полиморфным системам белков, ферментов и групп крови рассчитывали по формуле Л. Винера (1930).
Уровень генетического сходства при сравнении пород определяли по формуле Майяла-Линдстрема (1966).
Уровень генетического сходства лошадей по нескольким полиморфным системам вычисляли по формуле Л. Животов-ского и Л. Машурова (1974).
Ожидаемый и фактический уровень гомозиготности, тест гетерозиготности и число эффективных аллелей в популяциях лошадей вычисляли по формулам Л. Робертсона (1956).
Проверку фактического и ожидаемого распределения генотипов осуществляли методом хи-квадрат (Л. Животовский, Л. Машуров, 1974). Цифровой материал обработан биометрически (П. Рокицкий, 1964).