Совершенствование методов замораживания и оценки спермы хряков Шапиев, Исмаил Шапиевич

Введение к работе

Актуальность темы. Теоретические исследования в криобиологии спермы животных открьши большие перспективные возможности не только в ускоренном развитии и широком внедрении методов искусственного осеменения с.-х. животных, но и в сохранении генетически наиболее ценных и исчезающих пород и видов животных.

В свиноводстве метод криоконсервации спермы еще не получил такого же размаха как в искусственном осеменении крупного рогатого скота. Это связано с низкой криоустойчивости спермы хряков, необходимостью замораживания значительно больших объемов спермы, технологическими и методическими трудностями, нестабильностью результатов осеменения. Поэтому проблема совершенствования метода криоконсервации спермы хряков и поиск подходов и способов повышения криоустойчивости сперматозоидов остается актуальной.

Хотя сперматозоиды разных видов животных различаются по криоустойчивости, исследования, направленные на изучение механизмов криоповреждения сперматозоидов хряка и на поиск способов повышения их устойчивости при охлаждении и замораживании-оттаивании, могут быть использованы и при разработке методов замораживания спермы на других видах животных.

Нестабильность результатов искусственного осеменения с.-х. животных при использовании криоконсервированной спермы обусловлена значительной видовой, индивидуальной и сезонной изменчивостью устойчивости сперматозоидов к охлаждению и замораживанию. Поэтому существенное значение имеет отбор животных с целью получения криорезистентной спермы, а также отбор эякулятов для замораживания и криоконсервированной спермы на осеменение. В связи с этим большое внимание уделено разработке методов оценки сперматозоидов и их функциональной полноценности до и после замораживания-оттаивания. Особо важное значение точная и объективная оценка функциональной полноценности спермы имеет при создании банка генофондного материала.

Цель и задачи исследований. Исходя из изложенного целью работы было усовершенствование методов криоконсервации спермы и прогнозирования функциональной полноценности сперматозоидов до и после криоконсервации.

Для достижения 'поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать ультраструктурные изменения сперматозоидов
хряка при замораживаний-оттаиваний.

2. Изучить влияние Охлаждения и замораживания-оттаивания на
обшую активность и йзоферментиый спектр фермента лактатдегидро-
геназы. ' .-i_J---:v/?-,

З.Исследовать влияние охлаждения и замораживания-
оттаивания на функционирование дыхательной цепи митохондрий
сперматозоидов. .<.','..

4.Исследовать влияние тиоловых соединений на криоустойчи-
вость сперматозоидов. >

5.Изучить возможность неспецифического повышения крио-устойчивости сперматозоидов.

б.Разработать среду и температурный режим охлаждения для криохонсервации спермы хряков.

'/.Разработать среду для разбавления криоконсервироваиной спермы после ее оттаивания.

З.Исследовать связь показателей качества сперматозоидов после замораживания-оттаивания с их оплодотворяющей способностью.

9.Разработать методы оценки криоустойчивости сперматозоидов и их функциональной полноценности после замораживания-оттаивания.

Научная новизна исследований. Полученные нами данные экспериментальных исследований позволили: развить имеющиеся знания по криобиологии сперматозоидов; показать многофакторный характер криоповреждений; выдвинуть ряд новых положений о механизме и особенностях устойчивости и повреждения сперматозоидов при охлаждении и замораживании-оттаивании. Показано, что наиболее чувствительны к охлаждению и замораживанию-опаиванию механизмы регуляции энергетического обмена сперматозоидов.

Замораживание-оттаивание сперматозоидов хряка приводит к повреждению мембранных структур митохондрий и нарушению функционирования дыхательной цепи - разобщению дыхания и фосфорили-рования и увеличению свободного окисления. Впервые установлены характер и локализация криоповреждений дыхательной цепи. На начальном этапе криоконсервации спермы наиболее чувствителен к охлаждению 1-ый,НАД - зависимый участок дыхательной цепи, а при замораживании-оттаивании повреждению более подвержен 2-ой участок дыхательной цепи. Выявлено, что криоустойчивость сперматозоидов зависит от исходного уровня кислородзависимых окислительных процессов. При высоком исходном уровне дыхания, не сонряжеяного с фосфорилированием, сперматозоиды обладают низкой криоусточи-востью.

Установлено, что повреждения дыхательной цепи сперматозоидов, возникающие при холодовом шоке и замораживании-оттаивании спермы не идентичны. Холодовой шок приводит к необратимому повреждению, а при замораживании-оттаивании в защитных средах, наряду с необратимыми повреждениями,наблюдаются регуляторные изменения функционирования дыхательной цепи.

Впервые показана возможность повышения криоустойчивости сперматозоидов введением, в среду криоконсервации низких концент-

раций веществ со специфическим и неспецифическим действием (низкомолекулярные SH-соединения, мочевина, бензимидазол и его производные).

Выявлено, что разбавление спермы средой повышает активность изоферментов ЛДГ ответственных за гликолиз и состоящих преимущественно из М субьединиц. Показано, что увеличение отношения М субъединиц к Н субъединицам (М/Н) сопровождается повышением криоустойчивости сперматозоидов.

Впервые установлено, что сопряженность дыхания и фосфори-лирования в замороженно-оттаянных сперматозоидах, оцениваемая по величине стимуляции дыхания при действии разобщителя 2,4-динитрофенола, может служить показателем их функциональной полноценности. На основе проведенных исследований разработаны:

1. Среды для криоконсервации спермы хряков пригодные также для разбавления спермы при плюсовых температурах (А.С. № 540634; № 938990; № 1534042).

2. Метод замораживания спермы путем ее концентрирования центрифугированием (А.С. № 1561250).

3. Синтетическая среда для разбавления замороженно-оттаянной спермы (А.С. № 1191073).

4. Способы оценки качества сперматозоидов полярографическим и флуоресцентным методами, которые позволяют прогнозировать криоустойчивость сперматозоидов и их оплодотворяющую способность после замораживания-опаивания (А.С. № 938990).

Основные положения выносимые на защиту:

5. Особенности механизмов криоповреждения и криоустойчивости сперматозоидов хряков.

6. Способы повышения криоустойчивости сперматозоидов и усовершенствованный метод замораживания-оттаивания спермы хряков.

7. Методы оценки качества сперматозоидов и прогнозирования их оплодотворяющей способности.

Практическая значимость работы и реализация результатов исследований. Результаты экспериментальных исследований позволили расширить понимание молекулярных механизмов крионовреждений и криозащиты клеточных структур, определить способы и направление повышения криоустойчивости к повреждающему действию низких температур. Введение в состав среды криоконсервации мочевины и унитиола или производных бензимидазола увеличило результативность криоконсервации сперматозоидов хряка, а предложенный способ концентрирования спермы уменьшил потребность в хладоагенте и емкостях для хранения замороженной спермы. Методы оценки качества

криоконсервированной спермы и прогнозирование ее оплодотворяющей способности дают возможность отбирать для осеменения и хранения наиболее полноценную сперму после ее криоконсервации.

Материалы работы использованы при. разработке научно-методических и нормативных документов:

8. Методические указания по исследованию физиологии и биохимии спермы (Ленинград, 1974);

9. Методические рекомендации по низкотемпературной консервации спермы хряков (Ленинград, 1980);

10. Методические рекомендации по оценке качества спермы хряков при низкотемпературной консервации (Ленинград, 1980);

11. Методические рекомендации по криоконсервации концентрированной спермы хряков (Ленинград, 1985);

12. Методические рекомендации по оценке качества спермы хряков и баранов (Ленинград, 1989).

Апробация работы. Изложенные в диссертации результаты исследований были доложены и обсуждены на: ежегодных координационных совещаниях по криоконсервации спермы с.-х. животных в 1975-1985 г.г.(ВИЖ); Советско-американском семинаре "Физиология воспроизведения сельскохозяйственных животных" Москва, 1977; ХХХШ конференции БАЖ, Ленинград, 3982; 1-Всесоюзном биофизическом съезде, Москва, 1982; Н-Всесоюзной конференции "Механизм криопо-вреждения и криозащиты биологических объектов", Харьков, 1984; Всесоюзном симпозиуме "Биохимия сельскохозяйственных животных и продовольственная программа", Ташкент, 1986; Международной конференции "Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины", Харьков, 1988; Научно-практической конференции "Биологически активные вещества в сельском хозяйстве", Ленинград, 1988; На координационных совещаниях стран СЭВ по криоконсервации спермы, 1981 (СССР), 1988 и 1990 г.г. (ГДР); На международном симпозиуме по молекулярной генетике и биотехнологии, С-Петербург, 1994.

По материалам диссертации опубликовано 60 научных работ, в том числе: 1 методические указания, 4 методические рекомендации. По теме диссертации получено 6 авторских свидетельств и зарегистрировано 1 изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов и предложений* списка литературы. Работа изложена на 307 стр. машинописного текста, содержит 75 табл., 26 рис. Список литературы включает 458 источников, из них 232 иностранных.