Содержание к диссертации
Введение
РАЗДЕЛ 1. Система ЦМС-Rf PET 1 - центральный компонент современной гибридной селекции подсолнечника (литературный обзор) 9
1.1. Народно-хозяйственное значение подсолнечника 9
1.2 Происхождение подсолнечника 11
1.3. Систематика рода Helianthus 13
1.4. Генетические ресурсы рода Helianthus 16
1.5. Основные тенденции современной селекции подсолнечника 20
1.6. Система ЦМС-Rf в селекции подсолнечника 25
1.6.1. Феномен цитоплазматической мужской стерильности у подсолнечника 25
1.6.2. Генетическая система ЦМС-Rf РЕТ1 28
1.6.3. Гибридная селекция подсолнечника на основе
Н. petiolaris 31
1.6.4. Идентификация и классификация новых типов ЦМС 33
1.6.5. Поиск доноров генов восстановления фертильности 39
РАЗДЕЛ 2. Материал и методика эксперимента 42
2.1. Условия проведения эксперимента 42
2.2. Материал и методы исследования 46
РАЗДЕЛ 3. Создание стерильных аналогов материнских линий на основе различных источников ЦМС 55
3.1. Восстановление фертильности источников ЦМС подсолнечника 55
3.2. Создание и испытание ЦМС-аналогов 59
3.3. Иммунологическая оценка ЦМС-аналогов 62
РАЗДЕЛ. 4. Создание и оценка линий — восстановителей фертильносте пыльцы подсолнечника 66
4.1. Создание и испытание линий - восстановителей 66
4.2. Иммунологическая оценка линий - восстановителей 70
РАЗДЕЛ 5. Создание гибридов подсолнечника на основе новых ЦМС-Rf систем 73
5.1. Характеристика гибридов ультраскороспелой группы 74
5.2. Характеристика гибридов раннеспелой группы '...!.. 79
РАЗДЕЛ 6. Описание перспективных линий ч гибридов подсолнечника, созданных во время проведения эксперимента 86
Выводы 93
Практические рекомендации 95
Список литературных источников 96
Приложения 118
- Происхождение подсолнечника
- Феномен цитоплазматической мужской стерильности у подсолнечника
- Восстановление фертильности источников ЦМС подсолнечника
- Создание и испытание линий - восстановителей
Введение к работе
Актуальность темы. Подсолнечник в России является основной
масличной культурой. Доля подсолнечного масла в общем объеме производства растительньгх жиров в стране составляет свыше 80%. Количество посевных площадей под этой культурой возрастает с каждым годом.
В настоящее время в странах с развитой экономикой производство подсолнечника базируется исключительно на возделывании гетерозисных гибридов, обладающих несомненным преимуществом над сортами по целому ряду качеств, что позволяет снизить затраты на производство продукции. Более того, возделывание гибридов обеспечивает защиту авторских прав селекционера. На данном этапе гетерозисной селекции основное внимание уделяется созданию простых межлинейных гибридов ультраскороспелой, скороспелой и раннеспелой групп спелости, обладающих генетической устойчивостью к патогенам подсолнечника.
Мировое гибридное семеноводство в настоящее время основано на использовании лишь одного источника цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС РЕТ1), обнаруженного P. Leclerq в поколении от скрещивания Helianthus petiolaris Nutt и культурного подсолнечника. Такое интенсивное использование единственного типа ЦМС приводит к высокой генетической однородности гибридов подсолнечника, несущих родственный тип плазмы, что делает повсеместно возделываемые гибриды чрезвычайно уязвимыми к новым расам патогенов и создает потенциальную угрозу эпифитотий, имеющих серьезные экономические последствия.
С целью предотвращения возможных негативных явлений учеными разных стран проводятся широкомасштабные исследования новых источников ЦМС подсолнечника и восстановителей фертильности к ним, конечная цель которых - поиск новых ЦМС-Rf систем для гибридной селекции этой культуры. Накопленные к настоящему времени сведения о цитоплазматической мужской стерильности позволяют моделировать альтернативные системы ведения селекционного процесса с целью его оптимизации, а также улучшения генетической базы культурного подсолнечника. Однако конкретная информация, представляющая непосредственный интерес для практической селекции, а также данные о приложении теоретических аспектов непосредственно в селекционном процессе часто остаются за рамками публикаций, представляя собой коммерческую ценность. Поэтому назрела необходимость проведения нашей работы, в которой показано реальное использование различных источников ЦМС и восстановителей фертильности к ним в гетерозисной селекции подсолнечника.
Цель и задачи исследования Цель работы - создание простых гибридов подсолнечника на основе новых (официально не используемых в селекции и семеноводстве) ЦМС-Rf систем. В связи с этим нами были поставлены следующие задачи:
1. Изучить возможность использования новых источников ЦМС в селекции подсолнечника.
2. Создать ЦМС-аналоги ряда перспективных материнских линий на базе различных типов ЦМС и провести их иммунологическую и морфобиологическую оценку.
3. Создать новые линии-восстановители фертильности пыльцы, изучить их спектр восстановления, а также провести селекционную и иммунологическую оценку новых Rf-линий.
4. Получить и комплексно оценить простые гибриды подсолнечника на основе новых ЦМС-Rf систем.
Научная новизна исследований. Впервые в отечественной селекции показана реальная возможность внедрения в селекционный процесс новых ЦМС Rf систем. Получены и комплексно исследованы ЦМС-аналоги материнских линий на основе различных источников ЦМС. Также впервые в отечественной научной литературе представлены данные о влиянии типов плазм на хозяйственно-ценные признаки селекционного материала, в том числе и на устойчивость к наиболее опасным патогенам подсолнечника. Созданы и детально изучены новые Rf-линии, у них определен спектр восстановления фертильности. Получены принципиально новые гибридные комбинации на различных цитоплазматических субстратах, морфобиологическая и иммунологическая оценка которых выявила их селекционную значимость.
Практическая ценность работы и реализация результатов исследований. В результате проведенных исследований впервые получены гибриды с коротким периодом вегетации; выделены перспективные гибриды ультраскороспелой и раннеспелой групп созревания; получены гибридные комбинации с высоким содержанием масла в семянке. Созданы линии - доноры ультра скороспелости (ВБ 354В) и высокой масличности (ВБ 3090В), селекционная ценность которых подтверждена патентами. В Государственном сортоиспытании находятся первый в России ультраскороспелый гибрид подсолнечника Вейделевский 11 и высокомасличный гибрид Вейделевский 18.
Использование в селекции новых ЦМС-Rf систем с генетическим механизмом восстановления фертильности, подобным ЦМС РЕТ1, способно существенно увеличить изменчивость цитоплазматического генома коммерческих гибридов подсолнечника без изменения существующей системы семеноводства.
На защиту выносятся следующие основные положения:
1. Использование в селекционном процессе различных источников ЦМС при создании родительских линий подсолнечника.
2. Влияние типа стерильной цитоплазмы на некоторые хозяйственно-ценные признаки селекционного материала.
3. Создание и комплексная оценка простых гибридов подсолнечника ультраскороспелой и раннеспелой групп спелости на основе новых ЦМС-Rf систем. Апробация результатов диссертации. Основные результаты
исследований были доложены на II съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (1-5 февраля, 2000 г., г. Санкт-Петербург), на международной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур» (1-2 марта 2001 г., г. Краснодар), на техническом совещании FAO (7-9 октября, 2002 г., Монпелье, Франция), на VI европейской конференции по биотехнологии подсолнечника (5-9 октября, 2003 г. Севилья, Испания), на международной научно-практической конференции «Технологические свойства новых гибридов и сортов масличных и эфиромасличных культур» (5-6 июня, 2003 г., г. Краснодар), а также на ежегодных отчетно-плановых сессиях ученого совета Вейделевского института подсолнечника.
Публикации. По результатам исследования опубликовано пять статей в научных сборниках, тезисы в сборниках докладов конференций, одна статья, находится в печати, зарегистрировано два патента на созданные линии-восстановители фертильности.
Структура и объем диссертации. Диссертация содержит вступление, шесть разделов, выводы, практические рекомендации, список литературных источников и приложения. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц, 11 рисунков. Список литературных источников представлен 223 наименованиями, 132 из них - на иностранных языках.
Автор выражает глубокую благодарность к. с-х н. Чиряеву Павлу
Викторовичу! за методическое руководство при проведении исследований и к. б. н. Чепурной Анне Леонидовне за научное консультирование при написании диссертационной работы и моральную поддержку.
Происхождение подсолнечника
Подсолнечник является одной из ведущих масличных культур в мире. Причем потребность в этой культуре увеличивается с каждым годом. Это объясняется тем, что в последнее время в мире значительно возрос интерес к растительным жирам, как более полезным для здоровья человека по сравнению с животными [47]. По данным FAO (Продовольственная и Сельскохозяйственная Организация Объединенных Наций) во всем мире за последние пять лет общее количество посевных площадей под подсолнечник увеличилось на 1,3 млн. га и составило более 21 млн. га, производство семян возросло на 2,1 млн. т, производство подсолнечного масла - на 710 тыс. т [222]. Такая мировая тенденция прослеживается и в России, где за последние пять лет площади посева подсолнечника удвоились, достигнув 4,4 млн. га [41].
Подсолнечное масло является ценным высококалорийным пищевым продуктом, широко применяемым в пищевой промышленности для изготовления рыбных и овощных консервов, кондитерских изделий и в хлебопекарном производстве. Важное значение масла определяется, прежде всего, наличием в его составе незаменимых ненасыщенных жирных кислот, особенно линолевой, которая отличается высокой биологической активностью. В среднем в подсолнечном масле содержится 90 % ненасыщенных (олеиновая и линолевая) и 10 % насыщенных (пальмитиновая и стеариновая) жирных кислот [24]. Выделяемые из подсолнечного масла фэсфатиды широко применяются в кондитерской и маргариновой промышленности, хлебопечении и приготовлении лецитина для медицинских целей. Рафинированием и гидрогенизацией из подсолнечного масла приготовляют жировой продукт — саломас, высшие сорта которого идут на изготовление маргарина и твердых пищевых жиров, а низшие - для производства мыла [56]. Низкосортное подсолнечное масло также используют в лакокрасочной промышленности для производства олифы.
Помимо получения растительного масла, подсолнечник широко используется и на другие хозяйственные цели. Так, при переработке семян подсолнечника получают ценные кормовые белковые продукты - макуху (при прессовом способе получения масла) и шрот (при экстрагировании масла при помощи растворителей) [46].
В качестве корма также применяется зеленая масса растений подсолнечника силосных сортов. Посевы подсолнечника, убираемые на силос, имеют определенное значение особенно в северных районах, где нет условий для возделывания кукурузы. Подсолнечник пригоден для силосования в чистом виде и в смеси с другими растениями [87].
Разносторонне используется лузга подсолнечника. Из нее получают гектозный сахар, который перерабатывают на этиловый спирт и кормовые дрожжи, а также фурфурол, который идет на производство пластмасс.
Подсолнечник - один из лучших медоносов. Каждый гектар его посева может дать до 20 - 40 кг меда [25].
В малоснежных засушливых районах стебли подсолнечника, оставленные на зиму в поле, способствуют снегозадержанию. Пепел, полученный от сжигания стеблей подсолнечника - ценное фосфорно-калийное удобрение.
Подсолнечник используют и в медицине. Спиртовые настои его краевых цветков применяют, как противолихорадочное средство [24].
Несмотря на такое важное народно-хозяйственное значение подсолнечник - относительно молодая сельскохозяйственная культура. Его интенсивно выращивают, как масличную культуру, всего лишь около 120 лет. Однако первые следы возделывания подсолнечника, возраст которых датируется 2-3 тыс. лет, обнаружены еще в раскопках древних индейцев по берегам рек Арканзас и Миссури [159]. Таким образом, Северная и отчасти Южная Америка являются родиной и центром разнообразия видов рода Helianthus [88]. Возделывание подсолнечника началось на территории современных американских штатов Аризона и Нью-Мехико. Вероятно, семена и цветы подсолнечника употреблялись индейцами в пищу и применялись в медицинских целях, в ритуалах. В дальнейшем ареал распространения расширился от Южной и Северной Дакоты до Пенсильвании и Онтарио (Канада) [195]. Ко времени прихода европейцев однолетние дикорастущие формы подсолнечника использовались племенами индейцев по всей современной территории США, Канады и Мексики.
В Европу подсолнечник был завезен из Северной Америки в начале XVI в. испанцами, где его культивировали первоначально, как декоративную культуру [85]. К концу века декоративные формы подсолнечника были интродуцированы уже по всей Европе Подсолнечник выращивали в ботанических садах Бельгии, Голландии, Германии, Швеции, Англии [195]. Распространению подсолнечника в Европе способствовали, помимо ботаников, и медики, поощрявшие интерес к этому растению в поисках новых лекарственных источников [88]. Постепенно культура приобретает в Европе определенное пищевое значение благодаря употреблению семянок [195]. Это способствовало отбору однокорзиночных форм с большими корзинками и крупными семянками. Отдельные попытки использовать подсолнечник в качестве масличного растения предпринимались вплоть до XVIII в. Первым свидетельством об использовании семянок подсолнечника в качестве источника растительного масла является патент на выработку масла из подсолнечника, выданный в 1716 г. в Англии A. Вшіуап [195].
В Россию подсолнечник был завезен Петром I из Голландии в конце XVII в., где его также первоначально разводили в качестве приусадебного растения ограниченного применения (как суррогат кофе, корм для птицы). Согласно другой версии подсолнечник на территорию России был завезен в 1975 г. гетманом К. Г. Розумовским [72]. О том, что семена содержат масло, стало известно лишь в XVIII в.
В начале XIX в. в России началась массовая селекция подсолнечника в направлении получения слабоветвистых, крупносемянных и неосыпающихся форм, так как семена подсолнечника стали широко использоваться населением в пищу. В тридцатых годах XIX в. крестьянин Д. С, Бокарев (с. Алексеевка Воронежской губернии) осуществил первую удачную попытку добыть масло [72].
Полевая культура подсолнечника, как масличного растения, возникает в 50-х годах в Воронежской, а затем в Саратовской губерниях. Первая маслобойка для промышленной переработки семян была построена в России в 1883 г. Развитие маслобойного дела обусловило спрос на семена подсолнечника, что повлекло за собой быстрый рост посевных площадей под этой культурой и способствовало селекции на масличность. В дальнейшем культура подсолнечника как масличного растения стала распространяться и в прилегающие губернии [88].
Феномен цитоплазматической мужской стерильности у подсолнечника
Формирование фертильной пыльцы - важнейший процесс, который обеспечивает половое размножение у растений. Он находится под контролем множества ядерных и цитоплазматических генов, активно взаимодействующих между собой. Нарушение по какой-либо причине этого взаимодействия приводит к стерилизации мужской генеративной сферы растения, которая может быть обусловлена генетическими факторами, локализованными в цитоплазме, и проявление которых контролируется определенными ядерными генами — цитоплазматическая мужская стерильность (ЦМС) [89]. ЦМС наследуется по материнской линии и проявляется в наследственной дегенерации пыльцевых зерен на определенном этапе микроспорогенеза, что приводит, в конечном итоге, к полной стерилизации пыльников.
Фенотипически мужская стерильность растений подсолнечника проявляется в нескольких формах [72]: - пыльники не выходят из венчиков цветков, сильно редуцированы, пыльцевые зерна отсутствуют; - пыльники нормально выходят из венчика цветка, но пыльцевых зерен нет или их очень мало и они стерильны; - тычинки имеют короткие нити, и пыльники не выходят из венчика цветка. Пыльники развиты нормально, содержат фертильную пыльцу, но не растрескиваются; - стерильность по типу протогинии [3, 13]: утром первого дня цветения растения все раскрывшиеся цветки стерильны. К вечеру у части цветков появляются нормально развитые фертильные пыльники. На следующий день происходит то же самое. В последующие дни цветения корзинки фертильные цветки не появляются. В большинстве случаев ЦМС подсолнечника морфологически выражается в сильной редукции пыльников и отсутствии пыльцы, что обусловлено специфическими нарушениями нормального протекания микроспорогенеза [74]. Основываясь на цитологических наблюдениях, ученые предположили, что, по-видимому, дегенерация пыльцевых зерен индуцируется ядерными факторами, контролирующими созревание пыльцы, которые становятся неактивными при нарушении нормальных ядерно-плазменных взаимодействий в клетке [177]. Многие исследователи также сходятся во мнении, что дегенерация микроспор тесно связана с аномалиями лизиса тапетума [36, 52,64-68, 138,173,188].
До недавнего времени исследователи лишь предполагали существование специфического нарушения, приводящего к дегенерации пыльцы. Последними молекулярными исследованиями достоверно установлено, что первопричиной ЦМС у подсолнечника действительно является конфликт ядерного и митохондриального геномов клетки [89]. Именно экспрессия новых митохондриальных генов при отсутствии в ядерном геноме генов-восстановителей приводит в конечном итоге к нарушению микроспорогенеза и возникновению мужской стерильности растения.
У подсолнечника Н. petiolaris ЦМС обусловлена инсерцией определенной повторяющейся последовательности (265 п.н.) в 5 - конец гена аденозинтрифосфотазы (atpA) [124, 136, 149]. Возникшая в результате инсерции новая открытая рамка считывания (ог/522) транскрибируется, как полицистронная мРНК, включающая, в том числе, ген atpA (рис. 1.1).Ее трансляция ведет к накоплению ЦМС-специфического белка 16 кДа, который встраивается в митохондриальные мембраны и, как предполагают, нарушает цепь транспорта электронов [136, 171]. Предполагается, что продукт ядерного гена - восстановителя фертильности (Rf) на пост-транскрипционном уровне каким-то образом дестабилизирует митохондриальный транскрипт и этим восстанавливает фертильность растения [174, 210].
Впервые о цитоплазматическом наследовании мужской стерильности у подсолнечника было сообщено Г. Штуббе еще в 1958 г., но дальнейших сообщений о данном источнике не обнаружено [86]. Позже ученые безуспешно пытались получить экспериментальным путем растения с ЦМС посредством перемещения ядра одного вида подсолнечника в цитоплазму другого вида [93].
Первый источник ЦМС в СССР был выделен из сортов ВНИИМК [25, 30]. Однако получить 100 % закрепление стерильности у этой формы так и не удалось: максимальный выход стерильных растений составлял 70 - 80 %. Для практической селекции этот источник был непригоден. Второй источник ЦМС, обнаруженный у эндемичного подсолнечника из Армении, был описан А. В. Анащенко [4]. Однако выраженность этого типа ЦМС сильно зависела от погодных условий (минимальных температур воздуха в момент IV этапа органогенеза) и варьировала от 20 до 100 %, что делало невозможным его практическое применение.
Первый стабильный источник ЦМС был получен во Франции P. Leclerq в 1968 г. в результате межвидовой гибридизации Н. petiolaris Nutt х Н. annuusL.(сорт Армавирский 93.45) с последующими беккроссами (ВС) на культурный подсолнечник [156, 157]. Растения Fі и BCj были полностью фертильны. Лишь в третьем поколении от самоопыления ВСі было найдено стерильное растение, которое вновь было скрещено с отцовским сортом.
В следующих потомствах этого беккросса уже все растения были стерильными. В последствии этому источнику ЦМС был присвоен индекс РЕТ1 согласно кодификации FAO [198].
После открытия источника ЦМС РЕТ1 многие ученые начали исследования с целью нахождения эффективных генов восстановления фертильности пыльцы подсолнечника. М. Kinman в 1970 г. первым сообщил о гене, восстанавливающем фертильность источника ЦМС PET 1, у линии Т66006-2-1 [146]. В дальнейшем именно эта система ЦМС — Rf стала основой бурного прогресса гибридов подсолнечника в мире.
М. Kinman предположил, что единственный доминантный ген Rfi является условием восстановления фертильности ЦМС подсолнечника [146], Если генотип стерильного растения обозначить, как rf] rf], то при скрещивании его с растением, гомозиготным по гену восстановления фертильности (Rf[ Rfi), растения поколения F( будут фертильны (Rft rf]). Тогда в поколении F2 расщепление растений на фертильные и стерильные составит 3 : 1, а в анализирующих скрещиваниях -1:1.
Н. Enns с группой ученых [115], работавших с канадскими линиями, произошедшими от скрещиваний дикорастущего Н. annuus с культурным подсолнечником, также пришел к выводу о контроле восстановления фертильности одним доминантным геном.
Восстановление фертильности источников ЦМС подсолнечника
Для селекционной оценки полученных гибридных комбинаций использовали в качестве контроля сорт подсолнечника Белгородский 94 (для группы ультраскороспелых гибридов) и гибрид Вейделевский 99 (для группы раннеспелых гибридов):
Сорт Белгородский 94 - ультраскороспелый, продолжительность вегетационного периода от всходов до физиологической спелости составляет 72 - 75 дней. Масличность семянок - 48 — 50 %, потенциальная урожайность сорта — 1,5 — 1,8 т/га.
Гибрид Вейделевский 99 (авторское свидетельство № 31837) -раннеспелый. Вегетационный период от всходов до физиологической спелости составляет 90 - 93 дня, потенциальная урожайность гибрида - 2,5 -2,9 т/га, масличность - 50 — 52 %, сбор масла с гектара - 1,2.т.. Гибрид с 2003 г. является контролем во второй группе спелости по Белгородской области в Государственной Комиссии по охране и испытанию селекционных достижений Российской Федерации.
Полевые опыты закладывали на полях стационарного селекционного севооборота в соответствии с принятой в Белгородской области методикой возделывания подсолнечника [23]. Предшественник - озимая пшеница.
После уборки предшественника проводили лущение стерни на глубину 8 — 10 см тяжелыми дисковыми боронами. Осеннюю вспашку проводили на глубину 25 - 27 см. Весной в почву одновременно с предпосевной культивацией вносили почвенный гербицид «Фронтьер». Подготовленное таким образом поле маркировали в двух направлениях (0,7 х 0,7 м). Посев проводили, как правило, в последней декаде апреля — первой декаде мая ручными сажалками с размещением гнезд 0,7 х 0,35 м, на глубину 6-8 см, по три семени в гнездо. Делянки селекционных опытов четырехрядковые, общей площадью 24,5 м (2,8 х 8,75 м), учетной площадью 12,25 м (1,4 х 8,75 м). Повторность трехкратная. В фазе трех пар листьев проводили прорывку растений, при которой в гнезде оставляли по одному наиболее развитому растению. Уход за опытами включал в себя две междурядные обработки почвы.
В осенне-зимний период опыты закладывали в фитотроне. Растения выращивали в сосудах объемом 20 л. Искусственное освещение обеспечивалось металлогалоидными лампами ДРИ-2000-6. Температура воздуха поддерживалась на уровне +20 С в течение 8 часов (ночь) и+26 С в течение 16 часов (день). Полив растений проводили по мере необходимости.
Для определения восстановительной реакции источников ЦМС и спектра восстановительной способности новых Rf-линий проводили гибридологический анализ по полной схеме топ-кроссов: для получения тест-гибридов Fj каждый источник ЦМС опылялся пыльцой каждой фертильной линии. Скрещивания проводили вручную с использованием бумажных изоляторов - пергаментных пакетов размером 40 х 60 см. Родительские растения изолировали за три - четыре дня до начала цветения. Опыление осуществляли в предполуденные часы, когда влажность воздуха снижалась, исчезала роса, и воздух был в достаточной мере прогрет. Каждое опыление повторяли, как правило, через 2-3 дня. Опыленное растение маркировали этикеткой. Комбинации скрещиваний проводили в двукратной повторности. Растения обмолачивали вручную индивидуально.
Фертильные растения поколения F\ от скрещивания [ЦМС Rf] самоопыляли. Самоопыление заключалось в предварительном изолировании растения за 3 - 4 дня до цветения и последующем нанесении его собственной пыльцы на рыльца пестиков. Процедуру повторяли через 2 — 3 дня.
Самоопыление проводили также в питомниках самоопыления для получения и последующего размножения линий - восстановителей фертильности, для чего на делянке каждого восстановителя отбирали по 2 - 4 типичных, соответствующих определенному описанию, растения и изолировали. Однако доопыление под изоляторами не проводили в виду отбора на автофертильность. При сборе урожая отбирали те корзинки, в которых количество завязавшихся семян было наибольшим.
Растения поколений Fi и F2 выращивали для анализа восстановления и описывали по признаку стерильности/фертильности. Потомство каждого растения высевали на отдельной делянке и анализировали индивидуально. Описание по признаку стерильности/фертильности проводили визуально, критерием оценки служило наличие или отсутствие пыльцы. Генетический анализ расщеплений проводили в соответствии с методиками и рекомендациями, изложенными в специальных пособиях [32, 40, 48,73]. Проверку соответствия наблюдаемого расщепления предлагаемой нами генетической модели проводили методом "хи-квадрат" (% ).
У всех линий — восстановителей фертильности оценивали фертильность пыльцы в соответствии с методикой по Гейденгайну [1, 49]. Процент фертильных пыльцевых зерен (Ф) определяли по формуле: Для решения задачи получения стерильных аналогов использовали метод насыщающих скрещиваний. Каждый из источников ЦМС скрещивали с Б-линиями (ВБ 246, ВБ 127, ВБ 217, ВБ 1002), после чего полученное поколение F] повторно ими же опыляли. Обратные скрещивания (беккроссы) проводили до получения растений, максимально приближенных к растениям Б-линий по фенотипу, что достигалось после 4-5 циклов. Гибридные семена получали в результате скрещиваний материнских форм (ЦМС-аналоги) и линий - восстановителей фертильности (R - линии) на искусственно изолированных участках гибридизации.
С целью выявления уровня соответствия новых ЦМС-аналогов исходных линий контролю, а также для оценки полученных гибридов по основным хозяйственным параметрам проводили морфологические наблюдения и биометрические измерения. На делянках определяли длину вегетационного периода, начало и конец цветения. Биометрические промеры осуществляли на 10 растениях каждого варианта спустя 10-14 дней после окончания цветения растений. Определяли высоту растения, количество узлов, диаметр корзинки. Для учета значений высоты растений мы производили промеры с точностью до 1 см. Верхней точкой растения считали верхний край его соцветия. Известно, что первые две пары листьев культурного подсолнечника расположены супротивно, а остальные спирально [27]. Поэтому, при учете количества узлов на одном растении первую и вторую пару листьев принимали каждую за один узел. Массу 1000 семян определяли согласно общепринятой методике [63]. Все биометрические данные подвергались статистической обработке с использованием ЭВМ (программы Statistica, MSExel).
Уборку проводили вручную в два этапа. Сначала корзинки с делянок срезали серпом и накалывали на стебель. После подсушивания корзинок урожай с учетных рядков делянки собирали вручную (с подсчетом числа растений) и обмолачивали на селекционной молотилке (СМ-1). После обмолота и очистки от посторонних примесей семена анализировали по лузжистости (болгарским способом в модификации ВНИИМК [26]) и масличности (с помощью ЯМР-анализатора). Массу 1000 семян определяли общепринятым методом [63].
Создание и испытание линий - восстановителей
Наиболее сходны с контролем по реакции восстановления источники ЦМС ARG1 и ARG3. На их делянках со всеми восстановителями, за исключением линии М-8-778, зафиксировали фертильные растения, причем восстановление фертильности в тест-гибридах [ЦМС Rfj было полным. Расщепление растений на фертильные и стерильные в поколении F2 во всех случаях соответствовало математической модели 3:1.
Полное восстановление фертильности источников ЦМС R1G2, DEB1 и PRH1 отметили в гибридных комбинациях с участием линий RHA-274, R-1209 и R-1213. Характер расщепления растений по признаку фертильности / стерильности в поколении F2 свидетельствует о контроле восстановления двумя доминантными комплементарными генами (табл. 3.2). Причем один из генов-Rf в большинстве случаев присутствовал, по-видимому, у обоих родителей в гомозиготном состоянии (например, Rf)Rf( Rf2 _ ), и расщепление наблюдали только по одному гену, о чем и свидетельствует соотношение 3:1. Тест-гибриды источников ЦМС RIG2, DEB1 и PRH1 с линией М-11-784 расщеплялись в поколении Fi в соотношении 1 : 1 или же были стерильными. Линия М-8-778 оказалась неэффективной для всех типов ЦМС, за исключением ЦМС РЕТ1. Отрицательная восстановительная реакция, вероятно, объясняется гетерозиготностью отцовских растений по генам-Rf или их отсутствием к этим видам плазм. Более того, у этих источников система ЦМС — Rf может несколько отличаться от таковой у РЕТ1; несовпадение с набором генов-Rf у восстановителя фертильности, в свою очередь, приводит к отсутствию эффекта восстановления.
Таким образом, согласно результатам генетического анализа механизм восстановления фертильности источников ЦМС ARG1, ARG3, RIG2, DEB1 и PRH1 в общем сходен с таковым у типа ЦМС РЕТ1, что соответствует литературным данным [79]. Наблюдаемые различия восстановительной реакции могут свидетельствовать о сложных ядерно-плазменных отношениях внутри ЦМС-Rf системы и о генетическом различии разных видов плазм. Следует отметить, что во время проведения эксперимента мы именовали исследуемые типы ЦМС «нетрадиционными», «не РЕТ-1 типа» [33]. Однако при написании диссертационной работы и статей для зарубежных изданий, руководствуясь последними отечественными и зарубежными исследованиями [78, 79, 135, 137], мы предпочли использовать термин «РЕТ-подобные источники ЦМС».
Создание стерильных аналогов осуществляли посредством перевода на различную стерильную основу линий ВБ 246, ВБ 127, ВБ 217 и ВБ 1002, являющихся родительскими компонентами некоторых перспективных гибридов ВИЛ (Вейделевский 98, Вейделевский 99, МСЧ98). Для этого каждый из пяти образцов источников ЦМС был скрещен с закрепителем стерильности пыльцы взятых для работы линий, после чего полученное стерильное поколение Fj опыляли закрепителем повторно. Обратные скрещивания (беккроссы) проводили до получения растений, максимально приближенных к растениям взятых Б-линий по фенотипу.
С целью выявления уровня соответствия полученных ЦМС-аналогов исходным линиям по основным хозяйственным параметрам проводили биометрические измерения. Изучение беккросных поколений показало, что по большинству признаков стерильные аналоги достигают фенотипического сходства с фертильными линиями уже после 4-5 возвратных скрещиваний,
Полученные данные свидетельствуют о значительной приближенности величины основных параметров ЦМС-аналогов к контролю (исходным линиям на основе ЦМС РЕТ1). Однако, несмотря на сходство родительских компонентов и полученных стерильных аналогов, наблюдали некоторое отклонение величины основных параметров даже после большого количества циклов насыщающих скрещиваний (табл. 3.3). 1ак, длина вегетационного периода у стерильных аналогов, полученных на базе источников ЦМС ARG1, ARG3 и PRH1 была на 3 - 5 дней меньше, чем у контрольных образцов исходных линий - закрепителей стерильности. Стерильные аналоги подсолнечника на основе ЦМС R1G2, имели длину вегетационного периода до цветения на уровне стандарта, а аналоги, полученные с участием типа ЦМС DEB1, превышали её на 3-5 дней. По высоте растений все полученные ЦМС - аналоги были выше исходных Б-линий, уровень отклонения от контроля колебался от 5 до 15 см (табл. 3.3). Исключение составили аналоги, полученные с участием плазмы R1G2: высота растений на делянках этих аналогов линии В Б 1002 находилась на уровне контроля. Стерильные линии, полученные на основе источников ЦМС DEB1 и RIG2, превышали по диаметру корзинки контрольные образцы на 2 - 3 см. Весь остальной материал имел размер корзинки на уровне, незначительно превышающем величину этого признака у исходных фертильных линий. Масса 1000 семянок у полученных ВС-потомств всех комбинаций была на уровне или ниже, чем у контрольных линий, лишь у аналогов, полученных на основе типа ЦМС DEB1, масса 1000 семянок превышала контроль. Уровень масла в семянке у полученных аналогов был на уровне или несколько ниже, чем у контрольных образцов. Только у ЦМС-аналогов на плазме PRH1 эта величина была незначительно выше контроля. Очевидно,. различия между контролем и ЦМС-аналогами связаны с влиянием на те или иные признаки типа стерильной цитоплазмы. Многочисленные зарубежные исследования подтверждают, что тот или иной тип цитоплазмы может несколько усиливать какой-либо признак или, наоборот, отрицательно влиять на него [71, 94, 176, 197-199]. Однако в доступных нам литературных источниках мы не обнаружили конкретной информации о влиянии на морфобиологические признаки селекционного материала тех источников ЦМС, которые используются в нашей работе. В отечественной научной литературе освещены исследования влияния на хозяйственные признаки только источника ЦМС РЕТ1 [42, 50], где делается вывод об отсутствии отрицательного влияния этой плазмы на селекционный материал. В нашем исследовании все пять источников ЦМС в большей или меньшей степени влияли на каждый из агрономических признаков, по которым оценивали ЦМС-аналоги. Поскольку выраженного отрицательного влияния типа цитоплазмы на агрономические признаки ни в одном случае нами зафиксировано не было, все полученные ЦМС-аналоги были использованы нами в следующих этапах эксперимента.
