Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Современное состояние в области идентификации генотипов картофеля 9
1.2. Молекулярно-генетические маркеры в идентификации генотипов, выявлении генетического разнообразия и паспортизации генофонда картофеля 11
1.3. Мировой опыт использования белков и изоферментов как генетических маркеров для идентификации и паспортизации генотипов картофеля 16
2. Материалы и методы 29
2.1. Материалы 29
2.2. Получение белкового экстракта из клубней картофеля 30
2.3. Методы биохимического разделения генотипов картофеля 31
2.3.1. Электрофорез запасных белков и изоферментов 31
2.3.2. Изоэлектрофокусирование 32
2.4. Методы окраски гелей 32
2.5. Документация результатов и статистическая обработка данных 33
3. Белковые и изоферментные маркеры картофеля 35
3.1. Белковые маркеры клубней картофеля 3 5
3.2. Изопероксидазная система картофеля 46
3.3. Изоэстеразная система картофеля 57
4. Характеристика генетического разнообразия сортов картофеля 66
4.1. Полиморфизм сортов, полученных в результате гибридизации разных родительских форм 67
4.2. Вариабельность генетически близких сортов и гибридов - сиб сов и полусибсов 74
4.3. Характеристика вариабельности соматических мутантов, клоно вых вариантов и сомаклональных вариантных линий 80
4.4. Идентификация отличий генетически модифицированных сортов от исходных 92
4.5. Практическое применение белковых маркеров: идентификация предположительных мутантов, сортов - синонимов и дупликатов з
5. Молекулярно-генетический мониторинг исходного материала в процессе оригинального семеноводства картофеля 06
5.1. Идентификация аутентичности оздоровленных в мери стемно-тканевой культуре регенерантных растений исходным
сортам 106
5.2. Идентификация отклоняющихся от исходного генотипа вариантных линий картофеля
6. Методологическая основа использования белковых и изоферментных маркеров при идентификации генотипов картофеля 115
Выводы 120
Предложения 122
Список литературы 1
- Молекулярно-генетические маркеры в идентификации генотипов, выявлении генетического разнообразия и паспортизации генофонда картофеля
- Мировой опыт использования белков и изоферментов как генетических маркеров для идентификации и паспортизации генотипов картофеля
- Документация результатов и статистическая обработка данных
- Характеристика вариабельности соматических мутантов, клоно вых вариантов и сомаклональных вариантных линий
Введение к работе
Актуальность проблемы. При создании и поддержании генетических коллекций и банков сортов картофеля, и в особенности при воспроизводстве и масштабном размножении исходного материала в процессе оригинального семеноводства особую актуальность приобретают две главные задачи: абсолютная уверенность в элиминации патогенов и точное генетическое соответствие исходного «материнского» растения генотипу сорта.
Для сохранения сорта исключительно важное значение имеет контроль генетической стабильности, поскольку в следствие возрастания вероятности спонтанных мутаций, растения, регенерированные из эксплантов соматических клеток, могут иметь существенные морфологические изменения. Длительное депонирование растений картофеля в культуре in vitro, где условия развития растений значительно отличаются от естественных, к которым картофель приспособился эволюционно, также может привести к генетическим изменениям за счет соматических мутаций, обусловленных, например, изменением содержания гормонов. Кроме того, при поддержании в пробирочной культуре неизбежно имеет место и путаница, привносимая техническими исполнителями.
Перечисленные проблемы обусловливают остроту вопросов генетического мониторинга исходного материала в процессе оригинального семеноводства картофеля на всех этапах работы: при оздоровлении сортов, поддержании коллекции in vitro, клональном размножении на биотехнологических модулях.
При этом традиционные методы описания и характеристики образцов на основе морфологических признаков часто имеют ограничения из-за растянутости во времени и недоступности для наблюдения всех признаков одновременно. Кроме того, они не применимы, например, для идентификации сортов в культуре in vitro, рассады и миниклубней, полученных на биотехнологических модулях. Поэтому необходимость разработки и усовершенствования методов экспресс-идентификации генотипов и системы генетического мониторинга сортообразцов при формировании и поддержании генетических коллекций и банков сортов картофеля обусловливает актуальность настоящей работы.
Цель и задачи исследования. ЦЕЛЬЮ исследования являлась разработка технологических основ идентификации генотипов и генетического мониторинга исходного материала на основе белковых маркеров.
При этом ставились следующие ЗАДАЧИ:
-
Разработать системы белковых и изоферментных маркеров для идентификации и паспортизации сортов картофеля in vitro и in vivo.
-
Дать характеристику генетического разнообразия сортов различного происхождения на основе белковых маркеров: сортов, полученных в результате межсортовой гибридизации; генетически близких сортов — сибсов и по-лусибсов; соматических мутантов и клоновых вариантов сортов; генетически модифицированных сортов в сравнении с исходными.
-
Разработать технологию молекулярно-генетического мониторинга банка сортов картофеля на этапах формирования, поддержания и размножения
оздоровленного исходного материала в процессе оригинального семеноводства.
Научная новизна и практическая значимость. Впервые дана количественная характеристика генетического разнообразия сортов различного происхождения по изоферментным и белковым маркерам. Определен уровень полиморфизма сортов отечественной и зарубежной селекции, выявлены генетически родственные и дивергентные сорта, что может быть использовано в селекционной работе при подборе родительских форм для скрещивания. Проведена кластеризация сортов согласно их происхождения: сортов, полученных в результате гибридизации, сибсов и полусибсов, соматических мутантов и клоновых вариантов, генетически модифицированных сортов. Показано, что в таком ряду происходит закономерное уменьшение вариабельности при оценке на основе генетических дистанций. Определены возможности и ограничения маркеров в идентификации отличий соматических мутантов, клоновых вариантов, сомаклонов и генетически модифицированных сортов от исходных генотипов.
Предложена система молекулярно-генетического мониторинга образцов оздоровленного генобанка. Обнаружено, что возможно появление линий, генетически отличающихся от исходных генотипов. В Госреестре РФ выявлены сорта, неразличимые по белковым и изоферментным маркерам и являющиеся клоновыми вариантами или синонимами уже внесенных в реестр сортов.
Личный вклад соискателя. Соискателю принадлежит разработка программы и методики исследований, схемы основных экспериментов и теоретическое обобщение полученных результатов. Большая часть экспериментальных данных получена автором лично.
Апробация результатов диссертации. Основные результаты работы доложены: на школе молодых ученых «Современные методы селекции картофеля на устойчивость к болезням и качество» (Коренево, 2004), на научно-практической конференции, посвященной 75-летию ВНИИКХ «Состояние и перспективы селекции и семеноводства картофеля» (Москва, ВНИИКХ, 2006 г.).
Опубликованность результатов. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, включая 5" научных1 статей, 2 методических указания, 1 методические рекомендации.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, экспериментальной части (4 главы), выводов, предложений, списка использованной литературы и приложения.
Молекулярно-генетические маркеры в идентификации генотипов, выявлении генетического разнообразия и паспортизации генофонда картофеля
Исследование полиморфизма запасных белков и изоферментов является одним из важнейших путей получения информации о генотипе (Конарев, 1983; Созинов, 1985). Биоспецифичность белков служит основой их применения в качестве генетических маркеров. Специфичность разных групп белков неодинакова. Различия связаны с характером эволюционной и генетической изменчивости.
Для такого рода исследований наибольший интерес представляют полиморфные белки (прежде всего запасные белки и изозимные системы), которые могут служить маркерами гена и его аллельной структуры. (Hunter, Market, 1957; Левитес, 1986). С точки зрения В.Г. Конарева (1983) эволюци-онно консервативные белки могут использоваться как маркеры высших таксонов, а маркерами видов и геномов могут служить эволюционно более молодые белки.
Согласно положениям Н. Stegemann (1979), при использовании белковых и изоферментных маркеров основополагающим является следующее:
1) метод разделения и идентификации должен быть недорогим, легким для выполнения и не зависимым от загрязняющих анализируемый образец веществ в различных концентрациях; 2) разделение должно быть одноэтапным процессом и начинаться с сырого экстракта, для того чтобы свести к минимуму возможные нежелательные изменения при подготовке проб;
3) вначале следует испытать один генотип в различных условиях (например, изучить влияние климата, удобрений, пестицидов, регуляторов роста, возраста растений, зрелости клубней и т.д.) для уверенности в том, что спектры белков не зависимы от этих условий, или для того, чтобы получить исчерпывающе точные знания о таких возможных изменениях;
4) спектр белков того или иного образца должен иметь определенное число индивидуальных, только ему присущих, особенностей, легко отличимых от других. Чем больше их число, тем представляются большие возможности для дифференциации. Для надежного сравнения образцов нужен также внутренний стандарт.
Еще в 60-х годах прошлого столетия было обнаружено, что спектры белков зрелых покоящихся клубней стабильны в течение 8-9 месяцев с момента осенней уборки до посадки следующей весной при хранении при температуре +2+4С и не подвержены влиянию условий выращивания (Stegemann, Loeschke, 1961, 1977; Loeschke, Stegemann, 1965, Stegemann, 1979, Mandolino etal., 1996). Уникальным объектом для биохимического изучения являются свободные от вирусной инфекции пробирочные клубни картофеля (Будин и др., 1981). Недопустимо использование пораженных бактериальными и грибными болезнями клубней; хотя, как известно, латентная зараженность не влияет на воспроизводимость белковых спектров с использованием обычных стандартных методик анализа (Stegemann, 1979). Это положение также справедливо для спектров ряда изозимов, таких как эстеразы и пероксидазы, однако зараженность может сильно отражаться на спектрах фосфорилаз (Gerbrandy et al., 1975).
Изменения в спектрах были отмечены при сильном прорастании клубней (Stegemann et al., 1973). Н. Stegemann (1979) констатировал отсутствие влияния на спектры белков клубней сильных различий по содержанию соли в почве, удобрений, различных регуляторов роста и т.д.: при различных условиях роста растений компонентный состав спектров оставался стабильным, однако абсолютное количество белка в клубнях при этом могло меняться.
Если клубни сильно недозрелые, то сортоотличительные признаки в электрофоретических спектрах менее выражены. Было установлено, что один белковый компонент в спектре является маркером недозрелости, который исчезает по мере созревания клубней (Stegemann et al., 1973).
Запасные белки клубней (и в некоторой степени ботанических семян) различных сортов картофеля различаются главным образом по зарядам, но не по молекулярным массам своих субъединиц (Macko, Stegemann, 1969). Электрофоретическое разделение белков и изоферментов может быть основано: 1) только на зарядах молекул белков (изоэлектрическое фокусирование); 2) главным образом на размерах нативных молекул (электрофорез в гелях с градиентом концентрации - с градиентом пор); 3) на размерах субъединиц белков, дезинтегрированных и насыщенных додецилсульфатом натрия (ДДС-Na- или SDS-электрофорез) и 4) на размерах, форме и заряде (при достаточно непредсказуемом совместном действии этих факторов) в непрерывных и прерывистых (диск-электрофорез) буферных системах.
Выбор конкретного вида разделения зависит как от оборудования и реактивов, имеющихся в распоряжении исследователя, так и целей и задач, на решение которых направлен эксперимент. Для сортовой дифференциации нескольких сортов достаточен практически любой тривиальный метод разделения, а для идентификации сотен сортов необходим один стандартный, полностью воспроизводимый в любой лаборатории метод, с единой методикой документации и интерпретации спектров (Мусин и др., 2003).
Методика работы с белками-маркерами складывается из этапов разделения белковых смесей, идентификации белковых и изозимных компонентов в спектрах и биохимической или генетической интерпретации информации о составе белков анализируемых генотипов. Среди методов гель-электрофореза используются электрофорез в агарозном (Consden et al., 1946), крахмальном (Smithies, 1955) и полиакриламидном (Raymond, Weintraub, 1959) гелях. Известны анодная (Davis, 1964) и катодная (Reisfeld et al., 1962) буферные системы для вертикального диск-электрофореза. Для анализа белков в денатурирующих условиях (с ДДС-Na) обычно используют диск-электрофорез в буферной системе Леммли (Laemmli, 1970). Как быстрые способы определения молекулярных масс (ММ) субъединиц белков получили известность методы Shapiro et al. (1967) и К. Weber, М. Osborn (1969). Для анализа запасных белков клубней наиболее популярна трис-боратная буферная система (Stegemann, 1983). При исследовании одновременно многих изоферментных локусов часто используют электрофорез в крахмальном геле в горизонтальной системе, однако разрешение при этом явно недостаточно (Douches, Lundlam, 1991).
Наилучшим является проведение электрофореза в тонких пластинах полиакриламидного геля в вертикальной системе. На одной пластине геля обычно можно анализировать до 20 образцов в равных условиях, что важно для сравнения отдельных компонентов в соседних спектрах. Преимущество использования тонких пластин геля в том, что для дифференциации образцов применяются только три переменные - количество, относительное положение и интенсивность белковых компонентов в спектрах, что также чрезвычайно важно для обработки информации путем денситометрического сканирования (Мусин, 2004).
Мировой опыт использования белков и изоферментов как генетических маркеров для идентификации и паспортизации генотипов картофеля
В Европейских странах были выпущены каталоги-определители сортов картофеля по белковым и изоферментным маркерам запасных белков клубней, на основании анализов, проведенных по единой стандартной методике (Stegemann, Loeschke, 1976, 1977; Stegemann, 1979; Stegemann, Schnick, 1983, 1985 и др.). В 2005 г. издан каталог сортов Института картофелеводства НАН Беларуси, в котором приведены биохимические паспорта 38 белорусских сортов картофеля (Волощина и др., 2005). В каталогах все сорта представлены в виде денситограмм.
Ряд работ посвящен изучению возможности идентификации сортов, выведенных клоновым отбором - соматических мутантов, сомаклональных вариантов, протоклонов - при помощи белковых и изоферментных маркеров (Stegemann et al., 1979; Smith, 1986; Groza et al., 1991; Douches, Ludlam, 1991; Torres-Lopez, 1994; Gavrilenko et al., 1999; Waara et al., 1989; Uijtewaal et al., 1987; Rasmussen, Rasmussen, 1995 и др.).
Анализируя методом гель-электрофореза растворимые белки и изо-ферменты пероксидазы, эстеразы и малатдегидрогеназы сорта Russet Burbank и протоклонов, отобранных методами клеточной селекции на устойчивость к Alternaria solani, Stegemann et al. (1979) обнаружили качественные и количественные различия. Один из изозимов малатдегидрогеназы был присущ только двум восприимчивым к A. solani клонам и исходному сорту, также восприимчивому. Авторы предположили, что этот изозим может служить генетическим маркером восприимчивости к A. solani. Дополнительные различия наблюдались по общему белку и зимограммам пероксидаз при использовании двумерного фракционирования (ЭФ+ИЭФ) между сортом Russet Burbank и клонами 419 (высоковосприимчивый) и 747 (устойчивый).
D.B. Smith (1986) изучал изменчивость протоклонов картофеля на основе электрофореза в 60% полиакриламидном геле полиморфных белков клубней. Исследовав 175 клонов 3-х сортов картофеля, автор обнаружил, что 7 клонов сорта Фокстон и родительская линия имели идентичные спектры, 34 клона сорта Мэрис Пипер, а также протоклоны сорта Фетвелл, выявляли 2 типа спектров, один из которых идентичен родительской форме. У некоторых клонов наблюдали отсутствие отдельных компонентов, появление новых или устойчивые отличия в интенсивности отдельных полос спектра. У 3 клонов наблюдали отсутствие очень интенсивных, главных белковых компонентов в спектрах. Это свидетельствовало, по мнению автора, о фундаментальных изменениях генетического материала при регенерации растений из про-токлонов.
В работе D.S. Douches и К. Lundlam. (1991) 16 использованных изо-зимных локусов при исследовании в крахмальном геле не позволили установить различия между сортами-мутантами и вариантными линиями и исходными сортами. Как отмечают авторы, 16 локусов кодируют очень малую долю генома картофеля, и вероятность того, что изменения изозимов будут коррелировать с мутациями кожуры или другими физиологическими различиями, очень мала. Тем не менее, R.I. Torres-Lopez (1994), используя электрофорез белков в полиакриламидном геле, в отличие от предыдущих авторов, нашел незначительные отличия в изоферментных спектрах исходного сорта Norgold Russet и двух его вариантных линий. Как отмечает в этой связи Miller с соавт. (1995), вариантные линии могут значительно отличаться от оригинального сорта, при этом наблюдающиеся различия являются чаще всего результатом минорных изменений нуклеотидной последовательности ДНК и могут быть индуцированы влиянием условий выращивания и стадии развития, но пока генетическая основа их отличий не установлена, определение этих вариантов как новых сортов еще невозможно. Поэтому здесь необходимо использование методов ДНК-маркирования.
Аналогичные результаты были получены Groza et al. (1991), исследовавших методом электрофореза в крахмальном геле 57 спонтанных или индуцированных in vitro мутантов семи сортов по изозимным системам алко-гольдегидрогеназы, глутамат-оксалоацетат-аминотрансферазы (аспартатами 27 нотрансферазы - GOT), аконитазы, дегидрогеназы изолимонной кислоты, малатдегидрогеназы, 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, фосфоглюкоизомера-зы, фосфоглюкомутазы из экстрактов клубней. Было показано, что, в отличие от дифференциации сортов, спектры изозимов редко различают морфологические мутации сортов. Незначительные различия были обнаружены лишь по системе GOT-2 у мутантной линии сорта Атлантик и 6 PGDH у сорта Russet Burbank.
В то же время при интерпретации биохимических различий в составе белков регенерантов только генетический подход может обезопасить от неадекватных выводов. Так, E.V. Metakowsky с соавт. (1987), обсуждая проблемы интерпретации изменчивости глиадинов пшеницы, представили убедительные доводы, что изменения спектров вряд ли можно рассматривать как доказательство мутаций глиадиновых генов, т.к. такие варианты должны были возникнуть за счет направленных мутационных изменений в нескольких локусах одновременно, что маловероятно.
Изоферментный анализ может быть полезен при идентификации соматических гибридов картофеля. Методика использования изоферментов для скрининга и отбора соматических гибридов заключается в поиске биохимических генетических детерминант, представленных у исходных родительских форм в альтернативной форме и выявлении их в гибридном геноме. Однако, часты случаи «потери» некоторых компонентов спектров исходных родителей или появления совершенно не типичных для них компонентов после слияния изолированных протопластов. При этом маркеры позволяют проконтролировать уровень интрогрессии генетического материала от разных родителей в гибридном геноме. Так, изоферментная система малатдегидрогеназы была с успехом использована В.А. Uijtewaal с соавт. (1987), J.O. Rasmussen., O.S. Rasmussen (1995), S. Waara с соавт. (1989) для идентификации соматических гибридов между дигаплоидами, полученными из пыльников, анализируя изоферменты эстеразы, кислой фосфатазы, фосфоглюкомутазы, 6-фосфоглюконатдегидрогеназы, изоцитратдегидрогеназы и малатдегидрогеназы.
Документация результатов и статистическая обработка данных
При разделении методом изоэлектрофокусирования в диапазоне рН 3,5-9,5 компактная группа изоэстераз располагалась в анодной зоне, соответствуя самым кислым, тесно примыкающим друг к другу компонентам в спектрах запасных белков клубней. На рис. 3,3.5, отражающем результаты анализа, проведенного с целью сравнения спектров ИЭФ, окрашенных кумасси и на эстеразную активность, видно, что наиболее кислые белки клубней обладают эстеразной активностью. Зона анодных компонентов в спектрах ИЭФ белков клубней соответствует практически один к одному зстеразным. По-видимому, именно этот комплекс называют «пататином» (Racusen, Weller, 1984).
Систематизировать электрофоретические варианты эстеразы клубней было трудно, так как изоморфы располагались очень близко друг к другу, и в их взаимном расположении трудно усмотреть какую-то упорядоченность. Не случайно, наверное, в европейских каталогах-определителях сортов исследователи также ограничились лишь демонстрацией изоэстеразного «портрета», что и является фактором сортовой идентификации без какой-либо классификации изоэстеразных спектров (Stegemann, Loeschke, 1976). 12 3 4 5 6 7 8 9 10 1)
Соответствие спектров ИЭФ запасных белков (а) и изоэстераз (б) клубней. I-5. - белки-маркеры изозлектрических точек, 6-Н.- спектры запасных белков, 9-!I. - спектры изоэстераз.
Таким образом, в результате работы было выявлено, что исследованные генетические системы картофеля (растворимые запасные белки клубней, изопероксидазы и изоэстеразы из разных тканей растений картофеля) демонстрируют высокий полиморфизм на всех уровнях при исследовании их методами электрофореза и изоэлектрофокусирования. Электрофоретические спектры изопероксидаз характеризуются стабильностью при определенных строго контролируемых условиях выращивания растений и с успехом могут быть использованы в качестве генетических маркеров для биохимической идентификации генотипов картофеля на всех уровнях. Дифференциальная экспрессия генов, контролирующих изоферменты пероксидазы, позволяет в динамике, на разных фазах онтогенеза, с разных позиций и многопланово охарактеризовать изучаемые генотипы.
Электрофоретические спектры изоэстераз и растворимых белков удовлетворяют всем требованиям для паспортизации на уровне микроклубней и клубней как высокополиморфные, сортоспецифичные и стабильные в течение длительного периода покоя клубней. На уровне пробирочных растений изоэстеразная система характеризуется достаточно выраженной лабильностью в зависимости от физиологического состояния растения, что выражается в усилении эстеразнои активности в зоне проявления пататина - основного белка клубней, обладающего эстеразнои активностью. Усиление эстеразнои активности, очевидно, связано с экспрессией генов, отвечающих за синтез пататиновых белков при начинающемся спонтанном микроклубнеобразова-нии. Вследствие ярко выраженной нестабильности электрофоретических спектров изоэстераз на уровне пробирочных растений они не могут быть использованы для идентификации и паспортизации генотипов картофеля. А сам феномен нестабильности требует дополнительного изучения.
Однако, с нашей точки зрения, анализ отдельных изоферментов - не самый лучший путь идентификации генотипов картофеля. Вместо того, чтобы проводить раздельный анализ более десятка изоферментных систем одного и того же сорта, гораздо проще и разумнее провести один анализ: исследовать растворимые белки клубней. В этом случае в спектрах белков клубней представлены одновременно многие ферментные системы, обильные в паренхиме клубней, и затруднений в сортовой идентификации сортов разного происхождения обычно не возникает. Это также подтверждается литературными данными, согласно которым тысячи сортов европейских каталогов (Stegemann, Schnick, 1982; 1985 и др.) и еще большее количество образцов гермоплазмы Международного центра по картофелю CIP, Лима, Перу (Huamann, Stegemann, 1989) были идентифицированы за один этап на основе спектров белков и изоэстераз клубней.
Поэтому наиболее надежным и эффективным методом выявления сортовой принадлежности считается идентификация сортов по составу запасных белков клубней путем электрофореза или изоэлектрофокусирования в поли-акриламидном геле. Поскольку каждый сорт обладает определенным, присущим только ему белковым спектром, независимым от условий выращивания и хранения клубней картофеля.
Характеристика вариабельности соматических мутантов, клоно вых вариантов и сомаклональных вариантных линий
Был сделан вывод, что этот генотип не может быть ни вариантной, ни мутантной линией сорта Волжанин, а представляет собой образец совершенно другого сорта, сходного по морфологии клубня. Как оказалось впоследствии, это был своеобразный контроль возможностей используемой нами методики со стороны заказчика работы, который намерено предоставил на анализ вместе с необходимыми образцы клубней и пробирочных растений другого генотипа. Таким образом, в нашей работе было еще раз экспериментально подтверждено, что такие ситуации легко разрешаются на основе маркеров: если спектр неизвестного образца значительно отличается от спектра сравниваемого сорта, с абсолютной гарантией можно утверждать, что анализируется сортовая примесь. И наоборот, очень близкие или неразличимые спектры белков и изоферментов двух или более генотипов и малые генетические дистанции между ними служат подтверждением мутантной природы вторых генотипов в каждой паре.
Полученные экспериментальные данные по вариабельности соматических мутантов и клоновых вариантов полностью согласуются с литературными, согласно которым маркеры позволяют с абсолютной уверенностью отличить в посадках чистосортного картофеля мутантную или вариантную форму от примеси другого сорта. D. Douches, К. Lundlam (1991), используя горизонтальный электрофорез в крахмальном геле, не обнаружили различий в изоферментных спектрах исходного сорта Norgold Russet и двух его вариантных линий. Тем не менее, R.I. Torres-Lopez (1994), используя электрофорез белков в полиакриламидном геле с более высокой разрешающей способностью, различия в этом же материале нашел. Они были весьма незначительными, но стабильными при репродукции вариантных клонов и полностью воспроизводимыми в электрофоретических анализах.
Сходные результаты были получены при анализе сортов при помощи ДНК-маркеров. Используя 84 RAPD-маркера, К. Hosaka et al (1994) некото 88 рые пары сортов не удалось различить: Irish Cobbler и Shirobana-danshaku, Nemuro-murasaki и Murasakiimo, Rankaku 3 и Rankaku 5, а также группу образцов Neodelicious (Red Andes, Jaga Kids Red 90, Jaga Kids Purple 90). Был сделан вывод, что Shirobana-danshaku действительно является спортом (соматическим мутантом) Irish Cobbler, так как по маркерам не было обнаружено различий между ними. Однако, Bansei-danshaku, также считающийся мутантом Irish Cobbler, значительно отличается по спектрам от последнего. Было сделано заключение, что представление о мутантном происхождении Bansei-danshaku ошибочно, так как мутанты не могут иметь значительно отличающиеся от исходных генотипов спектры. А вследствие того, что некоторые RAPD-маркеры, присутствующие у Bansei-danshaku, не были обнаружены у Irish Cobbler, и учитывая стерильность пыльцы последнего, самоопыление также не может быть правдоподобным объяснением происхождения Bansei-danshaku от Irish Cobbler, и по мнению авторов, первый должен иметь гибридное происхождение. Тот факт, что сорт Neodelicious не отличался от Red Andes и его протоклональных вариантов даже при использовании 84 RAPD-маркеров, доказывает, что второй в паре является синонимом или вариантной линией первого.
Сорт Amisk внесен в Реестр Канады в 1993 году и является клоновым вариантом сорта Ranger Russet. Анализ морфологии листьев и клубней не выявил различий между двумя клонами. Тем не менее, четырехлетние полевые испытания показали, что по урожайности и количеству клубней размером более 88 мм сорт Amisk превосходил исходный сорт. Кроме того, гораздо реже наблюдался вторичный рост, а также была отмечена более высокая устойчивость к заражению клубней фитофторозом, вертициллезному и фуза-ризному увяданию. Однако даже детальные анализы с использованием RFLP-проб (Gebhardt et al., 1989) и RAPD-маркеров (Demeke et al., 1993), демонстрирующих более 1000 фрагментов ДНК, не выявили полиморфизма между исходным сортом и его клоновым вариантом. В. May с соавт. (1982) изучали возможность идентификации на основе маркеров сортов, выведенных клоновым отбором. Проанализированные изо-зимные системы не позволили различать сорта-мутанты и вариантные линии от исходных сортов. Как замечают авторы, изученные 16 локусов кодируют очень малую долю генома картофеля, и вероятность того, что изменения изо-зимов будут коррелировать с мутациями кожуры или другими физиологическими различиями, очень мала или ничтожна. Однако, при исследовании предполагаемых мутантов, выявленных в посадках сорта Red Pontiac, авторами был сделан вывод, что наблюдалось примешивание других сортов с красной кожурой к красноклубневому сорту Red Pontiac, поскольку между ними были выявлены значительные различия, а следовательно было констатировано, что это сортовая примесь, а не мутанты.
Таким образом, как полученные экспериментальные данные, так и анализ литературных источников позволяют сделать вывод, что соматические мутанты и клоновые варианты отличаются от исходных сортов по маркерам весьма незначительно. Вероятно, величина генетической дистанции в 0,05 единиц является условной границей при идентификации соматических мутантов. Во всяком случае, во всех проанализированных нами парах сорт / мутант различия были ниже этого порогового значения. Однако часто му-тантные и вариантные формы могут иметь совершенно не отличимые от исходных генотипов спектры при анализе методами изоэлектрофокусирования и вертикального диск-электрофореза, даже при наличии некоторых явных морфологических различий. Очевидно, различия таких генотипов следует искать на уровне ДНК-маркеров.
