Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Теоретические основы использования биотехнологических и биофизических методов в селекции растений
1.1. Культура зародышей in vitro 7
1.2. Культура изолированных меристем in vitro 22
1.3. Использование биофизических методов в селекции плодовых культур 26
ГЛАВА II. Цель, задачи, объекты, методика и условия проведения исследований
2.1 .Цель и задачи исследований 39
2.2.Объекты исследований 39
2.3.Методы исследований 41
2.4.Условия проведения опытов 44
ГЛАВА III. Использование культуры зародышей in vitro в селекци плодовых растений
3.1 . Культура зародышей in vitro, отдаленная гибридизация 49
3.2.Культура зародышей in vitro и мутагенез 65
3.3. Получение полиплоидных растений 72
ГЛАВА IV. Использование микроклонального размножения при селекции и сорторазведении плодовых культур
4.1 . Микроклональное размножение земляники 79
4.1 Производство оздоровленной рассады земляники 85
4.2.Микроклональное размножение черной и красной смородины 90
4.2 Зеленое черенкование черной смородины 92
4.2. Зеленое черенкование красной смородины 94
4.3 .Микроклональное размножение ежевики 96
4.4.Микроклональное размножение стевии 99
4.5.Микроклональное размножение сортов и подвоев вишни 101
4.5.Зеленое черенкование вишни 107
ГЛАВА V. Использование биофизических методов в селекционных программах по плодовым культурам
5.1. Электросепарирование пыльцы 114
5.2. Низкочастотное сопротивление (ИМПЕДАНС) 118
5.3. Обработка биологических объектов физическими факторами воздействия
5.3 Обработка пыльцы и каллусных тканей УФ-излучением 123
5.3 б. Влияние магнитных полей (МП) на биологические системы 126
5.3 в. Информационные торсионные поля (ИТП) и лазерное излучение в селекционной практике 129
5.4.Электробиолюминесценция 135
Основные выводы 145
Практические рекомендации 147
Список использованной литературы 148
Приложения 188
- Использование биофизических методов в селекции плодовых культур
- Культура зародышей in vitro, отдаленная гибридизация
- Микроклональное размножение земляники
- Влияние магнитных полей (МП) на биологические системы
Введение к работе
Решение современных селекционно-генетических задач опирается на новые методы, в которых аккумулированы последние достижения научно-технического прогресса с широким спектром направлений.
Научный подход к проблемам получения высоких устойчивых урожаев плодовых и ягодных растений подкрепляется фундаментальными знаниями в области генетики, биофизики, физиологии, биотехнологии и ряда других дисциплин. Достижения биотехнологии могут быть использованы в решении важных задач селекции.
Использование методов биотехнологии в селекционных целях позволяет: -преодолевать с помощью культуры зародышей in vitro несовместимость
отдаленных видов;
- ускорять размножение ценных генотипов, используя культуру in vitro, что
особенно важно на первых этапах селекции, когда селекционер имеет
единичные растения;
-хранить ценный генофондовый материал в виде пробирочных растений при пониженных температурах и всегда иметь под рукой нужные формы для использования в селекционном процессе;
управлять развитием органов у растений-регенерантов после высадки их в условия in vitro воздействием разнообразных физических условий культивирования, что позволит сдвигать продуктивность растений в сторону увеличения вегетативной массы, если речь идет о питомниках, или в сторону максимальной закладки генеративных органов, когда растения предназначены для получения продукции;
получать каллусную ткань из вегетативных органов плодовых растений и, управляя способностью каллусных тканей к органогенезу, получать новые формы растений с хозяйственно-ценными признаками (Бутенко, Попов, 1970; Высоцкий, 1978);
-оздоравливать сорта методом культуры изолированных меристем, который наряду с эффектом оздоровления, дает самый высокий коэффициент размножения в сравнительно комфортных условиях лаборатории практически круглый год.
-биофизические методы, в сочетании с культурой in vitro, позволяют более целенаправленно воздействовать на пыльцу, зародыши, меристематиче-ские и каллусные ткани. Более широкое применение из них получили:
а) использование электростатических полей высокой напряженности 810 в/м -
12 105 в/м с целью разделения пыльцы по уровню плоидности (Остапенко,
Рыжков, 1967; Молотковский, 1956);
б) электросепарирование пыльцы для повышения её оплодотворяющей способ
ности при отдаленных скрещиваниях плодовых растений (Остапенко, Рыжков,
1967);
в) применение магнитных и электромагнитных полей, оказывающих сущест
венное влияние на энергию прорастания зародышей, ростовые процессы мик
рорастений в культуре in vitro и их оплодотворяющую способность (Ланжевен,
1960; Пареелл, 1971; Уколова, 1971; Лю и др., 1979);
г) применение ультрафиолетового (УФ) излучения для обработки пыльцы, рас
тительных тканей, незащищенных покровными чешуями, в культуре in vitro,
используя лучи с X = 2800 - 2500 А характеризующиеся наиболее мутагенным
действием (Франк, 1939; Kimball, 1949, 1955, 1959, 1963; Setlow, 1957; Myers
and De Wolfe, 1964; Гурзадян, 1981; Камшилов, 1963, 1965; Корогодин, 1958,
1963, 1964);
д) использование лазерных, магнито-лазерных аппаратов в растениеводстве применение информационных торсионных полей (ИТП) в селекции (Гурвич, 1945, 1968, 1974; Brown, 1973; Басов, Афанасьев, 1984; Вебер и Хорцигер, 1984; Грезиев, 1979; Девятков, 1978; Рудь, 1974, 1978, 1979; Шахов, 1974; Инюшин, 1974, 1983; Шульгина, 1978; Гаряев, 1994; Бобров, 1997, 2000; Вяйзенен, 2002; Даниловских и др., 2003).
В связи с необходимостью ускорения селекционного процесса и повышения его эффективности испытание биотехнологических и биофизических методов в селекции многолетних плодовых и ягодных культур представляет большой научный и производственный интерес.
Использование биофизических методов в селекции плодовых культур
В теории и практике отдаленной гибридизации особое значение приобретает разработка эффективных приемов и методов преодоления барьера половой несовместимости, который обусловливается как генетическими, так и физиологическими факторами. При этом наряду с общебиологическими подходами к решению проблемы (культура изолированных зародышей, использование смеси пыльцы, полиплоидия, обработка генеративной сферы биологически-активными веществами и т.д.) широкое применение находят лазерное излучение и электрические поля. Представляет интерес использование высокочастотных электромагнитных полей, способных активизировать ростовые процессы в растительных организмах (Лебедев, Бибиков, Ушаков, 1974).
В литературе имеются данные (Остапенко, 1969), что в тех случаях, когда отцовская форма характеризуется большей активностью окислительных ферментов, чем материнская, при скрещивании получается больший процент завязавшихся плодов. Результаты скрещиваний при отдаленной гибридизации не всегда можно объяснить той или иной степенью филогенетической близости исходных форм. Неоднократно отмечалось, что отдаленные в систематическом отношении формы иногда скрещиваются гораздо легче, чем близкие виды. Опыты, проведенные Остапенко (1969) показали, что пыльца определенных видов косточковых растений заметно различается по рН. Наибольшую рН имеет пыльца, персика, миндаля, сливы. Кроме того, все виды косточковых культур характеризующиеся более высокой активностью окислительных ферментов в побегах и листьях, имеют пыльцу с более низким рН и более высоким чН2. Оказалось, что когда отцовская форма по сравнению с материнской характеризуется большей окислительной активностью тканей скрещивания облегчаются и, наоборот, при использовании в качестве материнской формы растения, у которого окислительная активность тканей выше, чем у отцовской, скрещивания затрудняются или совсем не удаются (исключение составила вишня войлочная).
Рядом авторов установлено, что под влиянием даже сравнительно небольшой дозы ультрафиолетовых лучей окислительные свойства пыльцы возрастали. Существенных различий жизнеспособности облученной и контрольной пыльцы при окраске ацетокармином обнаружено не было, однако изучение жизнеспособности другим способом показало возрастание жизнеспособности при облучении, возрастала и интенсивность роста пыльцевых трубок. Оптимальная доза ультрафиолетовых лучей, необходимая для максимального повышения оплодотворяющей способности пыльцы разных видов косточковых растений неодинакова. Остапенко (1958) установлено, что оплодотворяющая способность пыльцы находится в прямой коррелятивной связи с ее окислительными свойствами.
Изменение биофизических и физико-химических свойств пыльцы изучавшихся сортов и видов косточковых растений под влиянием возбуждающего У Ф„ч по мере увеличения дозы возрастали, хотя и непропорционально величине дозы (Остапенко, Рыжков, 1973). Как отмечают Остапенко, Рыжков (1967) под влиянием УФ-излучения отрицательная величина электрического заряда микроспор персика, сливы и миндаля заметно снижалась и как утверждают авторы, характер электрофизиологических изменений в пыльце под действием УФ-излучения связан с природой самого воздействия и обусловлен как радиохимическими, так и радиофизическими эффектами в структурах микроспор (накопление свободных радикалов, изменение соотношения окислителей и восстановителей). Рыжков, Остапенко (1967) свидетельствуют, что отрицательный заряд пыльцы косточковых растений под воздействием УФ-излучения изменяется, снижаясь в соответствии с ростом доз ионизирующих излучений, примерно в 1,5-2 раза и увеличивает их оплодотворяющую способность (Остапенко, Рыжков, 1971).
На основании полученных данных авторы делают вывод, изменения, полученные в результате обработки УФ-излучением, обеспечивают возможность направленного влияния на репродуктивный процесс с целью повышения эффективности селекционной работы. Данные Остапенко, Харитоновой, (1980, 1984) свидетельствуют о том, что с помощью УФ-излучения повышался окислительно-восстановительный потенциал пыльцевых зерен, увеличивалась активность протекающих в них процессов окисления. Это сопровождалось значительным (в несколько раз) повышением оплодотворяющей способности пыльцы, как при межсортовых, так и при отдаленных скрещиваниях.
Как установлено в ходе исследований (Стент, 1965) механизм биологического действия ультрафиолетового излучения связан с молекулярной природой биологических эффектов, с ДНК, где преобладающим оказываются различного рода сшивки пиримидиновых оснований, приводящие к образованию димеров тимина, цитозина, урацила и смешанных димеров. Получены доказательства (Самойлова, 1964, 1965, 1966), что димеры тимина - не единственный фотопродукт, ответственный за повреждение биологических объектов УФЛ. Известную роль играют также другие структурные нарушения ДНК и, по-видимому, нарушения РНК и белков. Электросепарирование пыльцы
Известно, что мужские и женские гаметофиты высших цветковых растений разнокачественны по знаку и величине электрического заряда (Остапенко, Рыжков, 1967) и эта разнокачественность определяет многие стороны избирательности оплодотворения (Рыжков, 1972; Остапенко, 1974; Рыжков, Мокро-усова, 1981). Изучение особенностей электрогенеза генеративной сферы и связи этого явления с процессами опыления представляет не только теоретический, но и практический интерес.
При отдаленной гибридизации пыльца, прорастая, дает начало пыльцевым трубкам. Их совместимость или несовместимость с чужеродными тканями пестика контролируется специальными генами.
Рыжковым, Остапенко (1974) установлено, что эпидермис боковой части рыльца, эпидермальные и субэпидермальные ткани столбика и завязи электроположительны, а проводящие ткани столбика и семяпочка - электроотрицательны. Микроспоры и пыльцевые трубки разнокачественны не только по знаку, но и величине заряда. Авторами установлено, что прорастание пыльцы и последующий поступательный рост ее пыльцевых трубок в значительной мере могут определяться биоэлектрическими свойствами микроспор опылителя и женского генеративного аппарата материнской исходной формы. При этом пространственная ориентация пыльцевой трубки в пестике осуществляется взаимодействием между заряженной поверхностью пыльцевой трубки и двойным электрическим слоем в тканях пестичного столбика.
Подавляющее большинство работ в области электрофизиологии полового размножения у растений посвящено изучению роли биоэлектрических потенциалов и зарядов в процессах опыления и оплодотворения (Остапенко, Рыжков, 1967; Рыжков, Остапенко, 1968, 1969, 1971; Рыжков, 1972). Значительно меньше работ в области изучения качественных и количественных изменений в динамике генерации заряда пыльцевым зерном и связи указанного показателя с жизнеспособностью микроспор.
Культура зародышей in vitro, отдаленная гибридизация
Межвидовые и межродовые скрещивания, проведенные в контролируемых условиях, давно используются селекционерами в,рего Мира. Часто с целью использования полученных таким образом отдаленных гибридов для дальнейших опытов по полиплоидии, цитогенетике и др. требуется их размножение.
Особое значение отдаленная гибридизация приобретает из-за того, что она позволяет сочетать гены различных таксонов. Этой проблеме уделяли внимание Мичурин (1948), Вавилов (1935), Цицин (1970), Еремин (1985), Корсаков (1986), Жуков, Харитонова (1988) и др. Следует подчеркнуть значение использования в этом направлении культуры тканей in vitro. С помощью эмбрио-культуры уже сейчас получены новые межвидовые и межродовые гибриды по многим породам, в частности - Курсаковым (1973, 1981), Кравцовым, Кравцовой (1974), Здруйковской-Рихтер (1981) и др. Получение недоразвитых зародышей при отдаленной гибридизации и введение их в культуру in vitro повышает положительный результат отдаленных скрещиваний. Одним из основных вопросов, стоящих перед селекцией вишни является выведение сортов на новой генетической основе с использованием видов С. tomentosa, С. glandulosa, С. ju-dii, обладающих устойчивостью к грибным болезням.
Методом, способствующим получению растений, несущих в себе гены устойчивости к грибным болезням, может служить культура зародышей in vitro. В результате широкого использования культуры изолированных зародышей получено много ценных для практики форм растений (Здруйковская-Рихтер, 1970, 1979; Плотникова, 1986, Курсаков, 1986 и т.д.).
Этот метод позволяет повысить эффективность отдаленных скрещиваний, получить новые ценные гибриды растений, которые в естественных условиях не удаются. Нами с 1986 метод культуры изолированных зародышей используется для получения новых форм косточковых культур, в частности вишни, которые в дальнейшем могут послужить исходным материалом в селекции на иммунитет.
Во ВНИИСПК с 1986 по 1999 гг. проводили работу по введению в культуру зародышей отдаленных гибридов различных видов вишни, с целью получения генетически разнообразного материала и использования его в дальнейшей селекции. В нашей работе были использованы зародыши отдаленных гибридов, полученных селекционерами не только от скрещивания тетраплоидных видов вишни с диплоидными видами (F[), но и от использования гибридов их первого поколения в возвратных скрещиваниях (F2).
Посев зародышей проводили на питательные среды Смирнова и Мураси-ге и Скуга. После вычленения пробирки с зародышами помещали на стратификацию в холодильник при t +2-3С, где они находились весь период прохождения стратификации, которая у косточковых обычно длится не менее 90 дней. Затем пробирки с зародышами вынимали из холодильника и помещали в лю-миностат при t +25С, через неделю отмечали число зародышей пошедших в рост и уровень их развития. Наряду с доращиванием отдаленных гибридов в культуре in vitro проводили цитологическую оценку, что позволило разделить их по уровню плоидности.
Первый этап работы включал в себя введение в культуру in vitro зародышей гибридов 1-го поколения (Fi), полученных от скрещиваний тетраплоидных сортов вишни обыкновенной (2n = 32) с диплоидными видами вишни железистой и вишни войлочной, и гибридов от скрещиваний этих же сортов с тетрап-лоидным видом - вишней пенсильванской. Вишня железистая (2n = 16) отнесена (Юшев, 1993) к роду микровишни, подроду спирееопсис. Установлено, что достоверных гибридов с типичными вишнями ранее никем не было получено. Этот вид генетически ближе расположен к роду Primus L. (слива) и легко скрещивается с видами сливы.
Вишня войлочная (2п =16) также, как и железистая относится к роду Микровишни, но к другому подроду - микровишни, генетически близкому с родом Lonniseania и отдаленному от видов рода сливы. Достоверных гибридов вишни войлочной с типичными вишнями не получено.
Вишня пенсильванская (2п = 32) недавно (Юшев, 1993) включена в род Падоцерус. Известны гибриды этого вида с типичными вишнями в ряде поколений (Жуков, Харитонова, 1988)
Использование в нашей работе культуры in vitro недоразвитых зародышей отдаленных гибридов между сортами вишни обыкновенной и названными видами позволило вырастить растения (табл. 2).
Из таблицы 2 видно, что зародыши в культуре in vitro в среднем дали растений: в комбинациях сортов с вишней железистой -40,3%, в комбинациях сортов с вишней войлочной - 33,7%), между сортами и вишней пенсильванской -62,0%). Итак, зародыши гибридов от двух тетраплоидных видов проявили более высокую жизнеспособность. В связи с малым числом выращенных растений, показать преимущество отдельных комбинаций (сорт х вид) не представляется возможным.
В этом опыте мы пытались выявить влияние сепарированной пыльцы, анодной и катодной фракций, в комбинациях: Памяти Вавилова х железистая, Памяти Вавилова х войлочная, Жуковская х войлочная. Мы получали несколько больший процент выращенных растений лишь в комбинации Памяти Вавилова х железистая при использовании анодной фракции пыльцы (53,8%) против 50,0%о), но из-за малого числа растений это математически не доказано.
В комбинациях сорта Жуковская х вишня войлочная без сепарирования пыльцы было выращено из зародышей несколько десятков растений, но все они оказались матроклинного типа. Та же картина отмечена в комбинации сортов Памяти Вавилова и Тургеневка с вишней войлочной. При скрещивании сорта Любская с вишней войлочной, наблюдалось раскрытие семядолей, появление зачаточных листочков, но дальнейшего развития не происходило. Попытка изолировать и ввести зачаточные листочки в культуру in vitro не дала положительных результатов, так как происходила полная гибель меристемной ткани. В результате использования в скрещиваниях диплоидных видов вишни железистой и войлочной без сепарирования пыльцы с сортами Памяти Вавилова, Любская, Тургеневка, Жуковская, в основном, были получены растения матроклинного типа. Анодная фракция пыльцы позволила получить гибридные растения с проявлением признаков обоих родителей.
Микроклональное размножение земляники
Метод асептической культуры меристематических верхушек широко известен как способ оздоровления от вирусных заболеваний вегетативно размножаемых растений.
Исследованиями было показано, что изолированные меристемы на средах с 6-бензиламинопурином (6-БАП), снимающим апикальное доминирование, продуцируют множество боковых почек и что этот эффект может быть использован для целей размножения (Giles, 1974).
К настоящему времени технология размножения земляники разработана достаточно хорошо и поставлена на промышленную основу (Попов, Трушеч-кин, 1970; Джигадло, 1989). Однако не всегда, следуя этим указаниям, удается получать желаемые результаты. И дело здесь не в том, что эти рекомендации неверны, а в том, что они разработаны конкретно для тех сортов, с которыми велись исследования и они могут не сработать, если будут взяты другие сорта.
Объектами наших исследований были перспективные сорта земляники Фестивальная, Зенга-Зенгана, Редгонтлет, Кулон, Надежда, Зенит, Золушка, Рубиновый Кулон, Алый Парус, Светлячок, Фламинго, Гора Эверест, Тенира, Trubadur, Tristar, Кардинал, Лировидная, Рапорт.
По данным Попова, Трушечкина (1970) сезон вычленения эксплантов не влияет существенным образом на способность земляники к регенерации. Применение данной методики в прежние годы позволило нам установить, что изоляцию стеблевых верхушек лучше проводить с растущих столонов с июня по август. С усов или рожков земляники следует срезать верхушки длиной 1,5 -2,0 см, промыть водопроводной водой, очистить почки от кроющих листьев и чешуи. В асептическом боксе верхушки простерилизовать раствором сулемы (0,1 %) в течение пяти минут с последующей трехкратной промывкой стерильной водой по пять минут.
Экспланты, размером до 200 мкм, состоящие из меристематического купола и одного - двух листовых примордий, высаживают на питательную среду размножения. Она включает в себя макро- и микросоли по Мурасиге и Скугу, глюкозу - 2%, аскорбиновую кислоту - 1 мг/л, витамины В і и В6 и никотиновую кислоту по 0,5 мг/л, агара - 0,7% и цитокинин-6-бензиламинопурин -0,8мг/л (БАП). При отсутствии БАП его заменяют кинетином в концентрации 5,0 мг/л.
Эффект размножения на такой среде обуславливается снятием апикального доминирования под влиянием цитокинина. Нами предложено образовавшиеся конгломераты почек пересаживать из 16 мм пробирок без разделения в 19 или 21 мм пробирки или колбы Эрленмейера объемом 100 - 250 мл. Это сокращает время получения целого растения.
Коэффициенты размножения у различных сортов земляники приведены в табл. 7. При соблюдении всех требований методики меристемы в пробирках развивались как обычно, то есть проходили стадии общего увеличения, вытягивания точки роста и разворачивания листьев. Затем основание развернувшихся листьев начинали увеличиваться в объеме, белеть и вскоре в их пазухах показывались пучки листьев, принадлежащих закладывающимся и прорастающим там почкам. В пазухах этих новых листьев вновь закладывались и прорастали боковые почки. Процессы почкообразования наиболее интенсивно протекали при наличии в среде БАП - 0,07 - 0,1 мг/л. Для получения полностью развитых пробирочных растений мы пересаживали их на среду укоренения, где 6-БАП исключался и вводились вещества ауксиновой группы ИМК или ИУК в концентрации 1 - 2 мг/л. Для земляники лучшим индуктором ризо-генеза оказалась ИМК. Процент укоренившихся растений достигал 85-90 %. Начало образования корней отмечали на 7-9-ый день, массовое - на 10 - 12-ый день после посадки на питательную среду (рисунок 20).
Оптимальным сроком пересадки оказался зимний период. В это время процент приживаемости наиболее высокий и в зависимости от культуры составляет 80-100.
Растения высаживаются в вазоны, заполненные торфом, а сверху крупнозернистым промытым песком. Субстрат автоклавировали. Вазоны помещали в адаптационную комнату, где влажность составляла 90 - 95 % при 12-часовом световом дне. Освещенность 8-9 тыс. лк.
В растениях, полученных этим методом, не обнаружено земляничной и стеблевой нематод, земляничного клеща и других вредителей и болезней. Пробирки с высаженными меристемами соответствующим образом маркировали. На этикетке обозначали название сорта и срок посадки. Все пробирки одного сорта в культуральной камере помещали на определенное место, что исключает смешивание сортов при дальнейших манипуляциях с пробирками.
Для того чтобы получить из одной меристемы большее число растений, проводли до пяти пассажей, с каждым разом увеличивая объем культурально-го сосуда. Со среды размножения растения переносили на среду укоренения, где через 2-3 недели они образуют корневую систему. При этом обязательно на всех сосудах сохраняли этикетки, удостоверяющие сортовую принадлежность.
Мы выявили, что на данном этапе развития сортовые различия выражены не ясно, все растения по внешнему виду напоминают сеянцы в возрасте нескольких недель, то есть наблюдается возврат к ювенильной стадии развития, и только некоторые сорта имеют определенные отличия. Так, у сорта Редгонт-лит корни красно-малиновые, в определенный период розовыми черешками выделяются сорта Надежда и Светлячок. Остальные сорта, таких особенностей лишены, поэтому четкое этикетирование, раздельное размещение выращиваемых сортов служат основой сохранения чистосортности.
Влияние магнитных полей (МП) на биологические системы
Стевия (Stevia rebaudiana Bertoni), или двулистник сладкий, представляет интерес, как продуцент сладких соединений, которые могут использоваться в качестве подсластителей, т.е. веществ с таким же сладким вкусом, как у сахара, но низкой калорийностью.
Сладкие свойства стевии обусловлены стевиозидом - комплексом ди-терпеновых гликозидов сложного состава, сладость которого оценивается 300 единицами по отношению к сахару. Установлено, что как стевиозид, так и экстракт из стевии не обладают токсичными свойствами. Они не оказывают мутагенного и канцерогенного действия, не влияют на репродуктивные функции и обладают примерно такими же консервирующими качествами, что и сахароза.
В последние годы появилось много работ, посвященных различным аспектам культивирования стевии. Использование биотехнологических методов при интродукции стевии позволяет не только быстро получать необходимый объем посадочного материала, но и разрабатывать новые способы извлечения стевиозида, вести селекцию в культуре на устойчивость к неблагоприятным факторам среды и, прежде всего, на повышенную холодостойкость. С 1995 года во ВНИИСПК нами велись работы по введению в культуру стевии. Культивирование эксплантов стевии проводили на питательной среде Мурасиге-Скуга по общепринятой методике (1996).
Для укоренения побегов использовали среду Мурасиге-Скуга, разбавленную вдвое с добавлением 15 г/л сахарозы и индолилмасляной кислоты в концентрации 0,5 - 0,8 мг/л. В качестве индукторов ризогенеза использовали ИУК и НУК в тех же концентрациях.
В результате экспериментов, было выявлено, что на этапе введения сте-вии в культуру предпочтительнее проводить микрочеренкование, т.к. наиболее оптимальным размером эксплантов является 3-8 мм. Лучшим стерилизатором оказалась сулема в концентрации 0,1 %, а время обработки растительного материала в ней 5-6 минут с последующей двукратной промывкой в проавтоклавированной дистиллированной воде. Микрочеренки стевии помещали в питательную среду, содержащую 0,5 - 0,8 мг/л 6-БАП. где они в течение месяца формировали розеточку листьев. Во втором пассаже экспланты развивали побег длиной 20-35 мм. К этому времени в пазухах листьев отдельных побегов наблюдалось пробуждение почек, из которых развивались боковые побеги. У некоторых эксплантов при соприкосновении листьев с питательной средой на центральной жилке появлялись почки, при отделении которых и рекультивировании на свежей питательной среде отмечалось образование побегов. В дальнейшем, побеги, развившиеся из таких почек, ничем не отличались от побегов, образовавшихся из пазушных почек. По всей вероятности, закладка почек непосредственно на листьях является следствием мор-фогенетического действия 6-БАП на ткани, обладающие меристематической активностью. Повышение концентрации БАП в среде после первых трех пассажей приводило к массовой закладке и прорастанию дополнительных почек без снижения темпа роста основных побегов. Коэффициент размножения достигал 8 - 10 за один пассаж. Следует отметить, что повышение концентрации 6-БАП более 1,5 мг/л приводило к аномальному развитию апексов. На таких средах они не формировали побегов, основание их разрасталось, экспланты приобретали шаровидную форму и теряли способность к развитию. По-видимому, ткани стевии имеют высокую чувствительность к вводимому в среду препарату.
Развитие корневой системы происходило в течение 20 - 25 дней и мало отличалось в зависимости от примененных препаратов. Спустя месяц после пересадки на среду укоренения, растения высаживали в предварительно про-автоклавированный почвенный субстрат, состоящий из 3 частей перегноя, 1 части торфа и 1 части крупнозернистого песка. Наряду с этим опыты показали, что укоренение побегов стевии можно проводить в субстрате, минуя этап укоренения в пробирке, если базальные части побегов обработать раствором ИМК или препаратом "ЮКА-4". Это значительно удешевляет процесс получения пробирочных растений стевии.
Значительную роль в решении производства посадочного материала косточковых культур, свободного от комплекса болезней и вредителей приобретают технологии и способы ускоренного размножения. Одним из них является клональное микроразмножение на искусственных питательных средах. Этот способ позволяет повысить коэффициент размножения в тысячи раз, исключает вероятность повторного заражения (Олешко, Трушечкин, Высоцкий, 1983; Олешко, 1986; Свитайло, 1986; Высоцкий, 1983; 1994).
Перечисленные преимущества послужили основанием для изучения метода клонального микроразмножения сортов и подвоев вишни селекции ВНИИСПК и других научно-исследовательских учреждений страны.
Для размножения методом верхушечных меристем были выбраны следующие сорта и подвои вишни: Тургеневка, Тихоновская, Шоколадница, Алексеевка, Самородок, Жуковская и подвои: ВП-1, В-2-180, В-2-230, В-5-88, В-5-172иЦ-8-101. Верхушечные почки, взятые от материнских растений, очищали от кроющих чешуи, поверхностно стерилизовали 70 % этанолом 8 секунд и промывали в течение часа проточной водой. В ламинар-боксах почки стерилизовали 0,1 % раствором сулемы или 0,01 % раствором мертиолата в течение 3 мин. при активном перемешивании стерилизующего раствора. Затем проводили двукратную промывку авто-клавированной дистиллированной водой в течение 7 минут. Применение двойной стерилизации снижает процент инфицирования искусственной среды. Вычленение верхушечной меристемы проводили с использованием микроскопа МБС-9, при 24-48 кратном увеличении, применяя набор микроинструментов, созданных в лаборатории. Апексы размером в 250-300 мкм высаживали в 16-мм. пробирки, содержащие 10 мл. питательной агаризованной среды на основе минеральных солей по Мурасиге-Скуга с добавлением 2 % сахарозы без добавок витаминов и веществ цитокининовой группы. Через 1-1,5 недели тронувшиеся в рост апексы пересаживались на среду, содержащую аскорбиновую кислоту -1,0 мг/л, пиридоксин, тиамин и никотиновую кислоту - 0,5 мг/л, гликокол-10 мг/л, мезоинозит - 100 мг/л, сахарозу -30 г/л, 6-БАП - 0,2 - 2,0 мг/л в зависимости от пассажа. Пробирки с апексами помещались в культуральную комнату с верхнебоковым освещением лампами ЛДЦ-80, ДДЦ-40, ЛФР-180. Освещенность составила 4,5 - 5,0 тыс. люкс при 16-часовом световом дне и относительной влажности 70 - 75 %. Температура днем 26С, ночью 24С. Заданные режимы поддерживались автоматически. Образовавшиеся конгломераты почек пересаживали без разделения в колбы объемом 100 - 200 мл, содержащие 50 мл агаризованной питательной среды (рис. 24).
