Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Рис: характеристика, распространение 7
1.2. Влияние засоления на рост и развитие риса 11
1.3. Генетика солеустойчивости 20
1.4. Селекции риса на солеустойчивость 32
2. Условия, материал и методика проведения исследований 40
2.1 Почвенные и климатические условия 40
2.2. Материал и методика проведения исследований 45
3. Результаты исследований 55
3.1 Изучение коллекционных сортообразцов риса 55
3.1.1 Определение всхожести в условиях хлоридного засоления 55
3.1.2. Определение солеустойчивости коллекционных сортообразцов риса по относительной длине ростков и корешков, анализ взаимных связей 59
3.2. Анализ гибридных форм риса 65
3.2.1. Наследование солеустойчивости риса в F2 65
3.2.2. Наследование количественных признаков у гибридов F2 NSIC Rc 106 Новатор 72
3.2.3. Анализ наследования высоты растений у гибридов риса F2-F3 79
3.2.4. Изменчивость гибридных линий F4 83
3.3. Анализ солеустойчивости гибридов 87
3.3.1. Оценка устойчивости к засолению гибридов риса F3 87
3.3.2. Солеустойчивость образцов риса четвертого поколения 89
3.3.3. Изучение солеустойчивости риса F4 в микрочеках 93
3.3.4. Анализ солеустойчивости у гибридов F5 98
3.3.4. Изучение солеустойчивости риса F6 на генеративной стадии развития 105
3.4. Маркерный анализ солеустойчивых форм риса 112
3.5. Изучение солеустойчивых линий на урожайность в контрольном питомнике 122
4. Экономическая эффективность солеустойчивых линий риса 124
Заключение 126
Предложения селекции 128
Литература 129
Приложения 146
- Влияние засоления на рост и развитие риса
- Определение всхожести в условиях хлоридного засоления
- Солеустойчивость образцов риса четвертого поколения
- Маркерный анализ солеустойчивых форм риса
Влияние засоления на рост и развитие риса
Засоление – это избыточное количество растворимых солей в почвенном растворе, являющееся основным стрессом, который ограничивает выращивание сельскохозяйственных культур. За счет снижения осмотического потенциала почвенного раствора вызывается дефицит воды даже в хорошо увлажненной почве. Это затрудняет извлечение влаги корнями растений из окружающей среды. Влияние высоких концентраций солей на растение можно наблюдать от снижения размеров всходов до полной гибели растений (Parida A.K., 2004).
Засоление влияет на рост и развитие риса на всех стадиях в разной степени, начиная от прорастания семян и до их созревания. Растения могут реагировать на различные стрессы как отдельными клетками, так и синергиче-ски в целом организмом, что и происходит на засолении у неустойчивых форм риса (Roy S.J. et al., 2014).
В научной литературе многократно отмечался факт, что в условиях засоления рост растений существенно угнетается, причем тем сильнее, чем выше уровень засоления субстрата (Purnendu G.et al., 2004; Zheng L. et al., 2000). Это приводит к тому, что на засоленном фоне заметно снижается величина всех параметров, характеризующих ростовые процессы. При этом исследованиями Г.В. Удовенко и его коллег было установлено, что при одинаковых условиях интенсивность торможения ростовых процессов избытком солей имеет отчетливую обратную корреляцию со степенью солеустойчиво-сти различных культур и сортов (Удовенко Г. В., 1976).
Строганов Б.П. (1962) отмечал биологический тип солеустойчивости (фактически солевыносливость), когда при предельном засолении почвы растения завершают ростовые процессы и сорт способен дать полноценный урожай семян; агрономический тип солеустойчивости показывает, насколько растения того или иного сорта на засоленных почвах могут сдерживать снижение количественных показателей формирования урожайности.
Агрономическая солеустойчивость определяется при помощи искусственно создаваемых фонов засоления – проращивания семян в солевом растворе, вегетационных и полевых опытов на разных концентрациях почвенного засоления, при помощи физиологических методов – плазмолитический, метод выцветания хлорофилла и т.д. (Воробьев Н.В., Журба Т.П., 1989; Воробьев Н.В., 1991). Низкий успех селекции солеустойчивости риса (Oryza sativa L.), по крайней мере, частично обусловлен низкой эффективностью отбора с использованием общих агрономических признаков, отсутствием эффективных методов оценки солеустойчивости среди генотипов и сложностью отбора толерантных фенотипов на засолении. Дифференциальная чувствительность к засолению на разных стадиях роста является одним из факторов, влияющих на фенотип солеустойчивости (Zeng L. et al., 2003). На солеустойчивость влияют любые изменения в окружающей среде, а также такие факторы, как температура и влажность воздуха, которые оказывают влияние на транспи-рацию воды и транспорт ионов в клетках растений, что затрудняет оценку фенотипов в полевых условиях (Shannon M.C., 1997).
Manney B. (2004) сообщил, что соли связывают большое количество воды в почве и препятствуют ее поглощению растениями из-за осмотического давления. Проростки наиболее чувствительны к водному солевому стрессу, а у взрослых растений урожайность сокращается из-за стерильности семян и низкого урожая, соли накапливаются до токсических уровней, тем самым повышая скорость старения листьев. Он установил, что как кратковременные первоначальные, так и долгосрочные эффекты солевого стресса приводят к уменьшенной фотосинтетической способности растения за счет уменьшения площади листьев, содержания хлорофилла и устьичной проводимости и, в конечном счете, низкой продуктивности биомассы. Более того, это также отрицательно сказывается на процессах, связанных с прорастанием семян, ростом растений, цветением и созреванием семян.
Параллельно данные подтвердились другими учеными (Австралия): рис очень чувствителен во время прорастания семян, а затем и на репродуктивных стадиях, однако он сравнительно устойчив во время активного кущения (Laftte H.R. et al., 2004). Ранее было установлено, что засоление влияет на такие компоненты как длина метелки, количество колосков в метелке, урожайность зерен, а также задерживает выметывание и цветение (Zeng L., 2000). Данные подтверждаются и по многочисленным публикациям азиатских ученых, полученным годами ранее: растения риса очень чувствительны к засолению на стадии всходов и на репродуктивных стадиях (Flowers T.J. et al., 1981; Lutts S. et al., 1995). Ранние репродуктивные стадии: формирование метелки (Heenan D.P. et al., 1988; Zeng L. et al., 2001), опыление (Khatun S. et al., 1995) являются наиболее чувствительными к засолению стадиями роста, влияющими на формирование компонентов урожая и в итоге на урожайность зерна (Khan M.S.A. et al., 1997). В связи с этим, в данной работе проведены исследования по солеустойчивости гибридных комбинаций риса, как для проростков, так и взрослых растений.
Резкое изменение биологических показателей риса, замедленные ростовые процессы и снижение урожайности – следствие нарушения работы метаболического режима растений и использования минеральных элементов в условиях засоления воды и почвы. Все изменения, происходящие с растениями на засолении, связаны с влиянием ионов на клеточные мембраны и фосфорилированием, а также с необратимыми изменениями в углеводном обмене и дыхании растений (Negrao S. et al., 2011).
На засоленных почвах у растений меняется характер обмена веществ – наблюдаются изменения нуклеинового, белкового, углеводного и фосфорного обмена (Гишева Н.Г., 1998; Гишева Н.Г., Шеуджен А.Х., 1999).
Оросительные воды, содержащие ионы Na+ и Cl-, оказывают нежелательное воздействие на физические свойства почв, поскольку связаны с накоплением ионов натрия на почвенном обменном комплексе. Это в конечном итоге влияет на нестабильность почвенных ресурсов, так как приводит к дисперсии частиц почвы, засорению почвенных пор и угнетению сельскохозяйственных культур. Грунтовая вода, содержащая растворимые соли, в основном выносится на поверхность транспирацией, после чего растворимые соли осаждаются на поверхности почвы, образуя белую корку, которая является индикатором наличия засоления. Этот процесс сильно повлиял на сельское хозяйство в рисосеющих странах, где производители страдают от неблагоприятного воздействия этого процесса на продуктивность их сельскохозяйственных культур (Siyal A.A. et al., 2002; Carden D.E. et al., 2003). Избыток этих солей удерживает почву в хлопьевидном состоянии, так что они обычно имеют хорошую физическую структуру, характеристики обработки почвы и проницаемость для воды, даже лучше, чем у незасоленных почв. В этих почвах засоление не влияет на физические свойства почв, но вредно потому, что повышенные концентрации растворимых солей в почвенном растворе уменьшают доступность почвенной влаги для растений (Moradi F.et al., 2003).
Токсичность солей – одна из основных причин частичного повреждения или гибели растений на почве хлоридного, сульфатного и карбонатного засоления (Гишева Е.Г., 1999) Устойчивость к засолению повышают путм адаптации семян растений в соответствующих солевых растворах (намачивание семян). С ее помощью происходит снижение проницаемости протоплазмы для солей, повышается порог е коагуляции солями.
Ранние литературные источники указывают на то, что по мере повышения уровня засоленности в почвах концентрация Na+ и Cl- в побегах увеличивается, а рост растений уменьшается (Flowers T.J. et al., 1981; Qadar A., 1995; Shannon M.C. et al., 1998). Происходящее увеличение осмотического давления почвенного раствора приводит к накоплению опасной концентрации ионов и нарушению обмена веществ растений (Rubio F.et al., 1995; Rus A.et al., 2001; Grattan S.et al., 2002). Если сосущая сила семян превышает осмотическое давление почвенного раствора, то такие растения способны использовать влагу из таких почв, если нет, то впоследствии растения гибнут (Тур Н.С., 1976). В более поздних советских исследованиях Б.П. Строганова (1989) и Н.В. Воробьева (1991) говорится о гибели растений на засолении по причине избыточного накопления ионов Сl-, которые оказывают токсическое воздействие на растительные клетки. Высокая засоленность субстрата отрицательно сказывается на их физических, химических, и биологических свойствах. Высокое содержание засоляющих ионов в субстрате создает неблагоприятные условия для поступления в растения элементов питания. В опытах с различными видами растений при засолении тормозится не только поглощение, но еще и в большей степени – метаболическое использование минеральных веществ и транспорт их в надземные органы. В связи с этим некоторые ученые (Б.П. Строганов, 1976; Харитонов Е.М., Досеева О.А., Шеуджен А.Х., 2009) пришли к выводу, что причиной замедленного поглощения питательных элементов корнями при засолении является снижение интенсивности их использования в обмене веществ, общее подавление метаболизма, в то время как именно последнее оказывает прямое влияние на поглотительную способность растений и на коллоидные свойства протоплазмы.
Ранее, в 1962 году Б.П. Строгановым на основании многолетних данных проведена классификация типов засоления: сульфатное, хлоридное, содовое, солонцеватое и солончаковое. Поэтому многие ученые стали изучать различные виды засоления и его влияние на рост растений, установив, что обезвоживание клеток является следствием влияния одних солей, а токсическое воздействие и ухудшение обмена веществ – других солей, при этом в разные периоды онтогенеза риса проявляются различные реакции на соли (Строганов Б.П., 1962; Воробьев Н.В., Журба Т.П., 1989; Воробьев Н.В., 1991;Тарчевский И.А., 2001; Жученко А.А., 2001; Харитонов Е.М., Досеева О.А., Шеуджен А.Х., 2009). По их мнению, самая низкая устойчивость к засолению на стадии проростков, что связано с недостаточной адаптацией молодых растений к избытку солей и в фазу цветения, которая перестраивает физиологические процессы в растении к плодоношению и оно становится уязвимым к воздействию абиотических стресс факторов (Гончарова Ю.К., Иванов А.Н., 2014). Повышенная буферность растительного организма обеспечивает более высокую солеустойчивость растений и включает защитные реакции синтеза резистентного механизма при уровне опасных концентраций солей (Удовенко Г.В., 1972).
Определение всхожести в условиях хлоридного засоления
Для отбора лучших форм необходим скрининг коллекционных образцов. Так, в 2012 году были изучены 88 образцов селекции России (ВНИИ риса, АНЦ «Донской»), Филиппин (IRRI), Японии, Китая, Узбекистана, Чили, Венгрии (приложение 1). В результате оценки всхожести на солевом растворе и в дистиллированной воде с последующим сравнением установлено, что солеустойчивость варьировала от 50 до 100% (рисунок 16).
Распределение образцов было асимметричным, с преобладанием устойчивых форм. Это связано с тем, что изучаемые образцы отличались достаточно высокой солеустойчивостью и многие из них являются суходольными (Чили, Ан-Юн-Хо), способными создавать высокое осмотическое давление. В таблице 2 представлены лучшие образцы риса.
Самая крупная группа по солеустойчивости – 48% сортообразцов находилась в классе 95-100%, что составляет фактически половину исходного материала, затем 26% – в классе 90-95%, и 13% – в классе 85-90%.
В деляночный посев 2013 года были включены образцы, выделившиеся в 2012 году и дополнительные формы для более масштабного скрининга селекционного материала (приложение 2). В общей сложности были изучены 186 сортов и сортообразцов. В исследованиях этого года выявлено, что соле-устойчивость образцов варьировала от 20 до 100% (рисунок 17).
Среди изученных образцов 18% имели устойчивость до 20-50%, 30 – обладали устойчивостью 50-70%, у 38% устойчивость к засолению варьировала в пределах 70-90%. Только у 15% образцов солеустойчивость была более 90%, именно они и представляют наибольшую ценность для селекции.
Много сортообразцов, показавших максимальную солеустойчивость, родом из стран Азии. Среднее значение солеустойчивости во всей совокупности данных составило 69%, стандартное отклонение от средней – 19%.
Результаты исследований показали, что максимальной солеустойчиво-стью обладают 27 образцов риса, среди них такие как: 7454 (Дончак Бахус), 7298 (Бахус Дончак), 7261 (Чили 22-3), 7415 (Чан-Чунь-Ман), 7292 (Ан-Юн-Хо), 7275 (Карлик) и другие (таблица 3).
В результате исследований установлено, что некоторые образцы проявили стабильную устойчивость к засолению за 2 года, данные о них представлены в таблице 4.
Выделено 9 лучших образцов по солеустойчивости, из них 3 с устойчивостью свыше 95%: IRAT 133 – 98,1%; 22-3 Чили – 97,2%; Хазар Южанин – 95%, превышение над стандартом (Боярин – 59,6%) составило 38,5%; 37,6%; соответственно. Также отличные результаты показали сорта и сорто-образцы: Чан-Чунь-Ман (Китай) – 94,6%, Айсберг – 94,5%, Ан-Юн-Хо (Китай) – 93,7%, 45-1-1 Чили – 92,4%.
Солеустойчивость образцов риса четвертого поколения
В 2016 году объектами исследований являлись 213 гибридных линий четвертого поколения, выращенных на ОС «Пролетарская» АНЦ «Донской» в Пролетарском районе Ростовской области. Семена проращивали лабораторным методом в пластиковых контейнерах по 50 штук в 1,5%-растворе NaCl (опыт) и в дистиллированной воде (контроль) в течение 14 дней при температуре 24С. Степень солеустойчивости определяли как отношение всхожести семян и массы проростков в опыте к контролю, выраженное в процентах (приложение 4). При оценке солеустойчивости по соотношению всхожести семян на солевом растворе к таковой на контроле, которая в определенной степени характеризует устойчивость линий риса, выявлено широкое варьирование этого признака от 0 до 100% (рисунок 46).
При этом 30% изученных форм имели устойчивость к засолению от 60 до 80%, а 21% – обладали устойчивостью 80-100%. Выделены 43 линии с со-леустойчивостью свыше 80%. У 10% гибридов солеустойчивость была от 90 до 100%, среди них наибольшую ценность представляют: №7084, №7345, №7198, №7401, №7312, у которых взошло равное количество семян на опыте и контроле, хотя не у каждого из них взошли все 50 семян.
Также солеустойчивость определяли по массе одного растения, как отношение массы растения с опыта к контролю (рисунок 47).
Основная масса образцов (78%) имела близкую к средней солеустойчи-вость – от 30 до 50%. Около 3% образцов оказались совершенно неустойчивым, 44% – слабоустойчивыми, 42% – среднеустойчивыми, 7% – устойчивыми, 3% (7 образцов) показали высокую устойчивость к засолению – соотношение массы проростков в соленой и пресной воде у них превышало 80%.
Лучшие устойчивые и высоко устойчивые образцы представлены в таблице 9. У стандартного сорта Новатор солеустойчивость, определенная по соотношение масса одного проростка в опыте к контролю, составила 41,9%, тогда как у лучших образцов она достигала 97,8%. При этом ранги соле-устойчивости, определенной по всхожести семян и массе проростка, не всегда совпадали.
Сопоставление данных по солеустойчивости и наличию QTL Saltol, выявленному с помощью ПЦР-анализа, позволило установить положительную связь между ними и тенденцию повышения толерантности к засолению при увеличении числа доминантных аллелей (рисунок 48).
Рецессивные гомозиготы показали солеустойчивость в среднем 41,5%, гетерозиготы – несколько выше – 42,4%, доминантные гомозиготы – 47,5%. Таким образом, наличие гена Saltol повышало солеустойчивость на 6%. Небольшие различия между тремя группами образцов свидетельствуют о наличии других механизмов устойчивости к засолению, контролируемой различ ными полигенами.
Помимо устойчивости к засолению выделившиеся образцы отличались по массе проростков, это дает возможность установить связи между этим признаком и солеустойчивостью с помощью корреляционного анализа. Он показал, что при объме выборки N=213 существует сильная положительная связь между массой проростков и солеустойчивостью r=0,83±0,07 на 95% уровне вероятности.
На рисунке 49 показано влияние солеустойчивости образцов на массу 1 проростка риса в среднем в растворе NaCl.
Регрессионный анализ позволяет установить, насколько сильно влияет солеустойчивость на величину результативного признака: массу проростков. При увеличении солеустойчивости на 10%, согласно уравнению регрессии, масса проростков у гибридов изменяется в среднем на 5,14 мг. Основное количество образцов варьировало по массе одного проростка от 30 до 50 мг.
Среди всего массива один образец (7375) имел существенное преимущество – масса его проростка составила 109 мг при солеустойчивости 98%.
Маркерный анализ солеустойчивых форм риса
Оценка гибридных форм риса F2.
Из растений второго поколения в 2014 году были отобраны 90 скороспелых, хорошо озерненных образцов (по 30 в каждой комбинации), которые проанализировали методом ПЦР на наличие аллелей QTL Saltol.
Для анализа отбирали листья с растений, зерно которых созрело к началу сентября, при этом было безостым и не осыпалось. Таким образом, к гибридным популяциям был применен селекционный отбор, поэтому они не могут быть репрезентативными для генетического анализа расщепления. В общей сложности было проверено 90 растений второго поколения, по 30 в каждой комбинации. Поскольку вьетнамские образцы были очень позднеспелыми, а сорт Новатор – скороспелым, то гибридное потомство отличалось широким диапазоном вегетационного периода. Большая часть растений вообще не вызревала в условиях Ростовской области.
Локус количественного Saltol представлен значительным участком первой хромосомы, включающий более 4500 тысяч пар нуклеотидов. Одними из полиморфных микросателлитных локусов, связанных с Saltol, являются RM493 и RM7075 (Linh L.H. et al., 2012). Длина данных микросателлитов отличается у родительских форм на 20-25 п.н., в связи с чем у гибридов F2 можно легко провести анализ наследования QTL Saltol. Кривые плавления SSR-маркеров имели четкие различия. Пики кривых плавления продуктов амплификации локусов RM493 и RM7075 у сорта Новатор составили 84,5±0,1С и 78,1±0,2С, а у сорта NSIC Rc 106 – 82,5±0,1С и 80,1±0,2С, соответственно. HRM-анализ показал, что гибридное потомство F2 расщепляется в числовых соотношениях, отличающихся от классического Менделевско-го 1: 2: 1, с преобладанием рецессивных гомозигот (рисунок 60-61).
В таблице 21 приведены результаты оценки наличия генов Saltol у гибридных растений риса с помощью ПЦР-анализа.
В гибридной комбинации IR 52713-2B-8-2B-1-2 Новатор было выявлено всего одно растение AA (№70), гомозиготное по гену Saltol, одновременно по двум маркерам. Еще 2 растения (№65 и 79) имели генотип АА лишь по одному из маркеров. Семнадцать растений были гетерозиготными (Аа), 9 – гомозиготными по гену Новатора (аа) и 1 растение с нетипичными бэндами. Таким образом, расщепление было далеко от Менделевского 1:2:1.
Число гетерозигот было близко к статистически вероятному, но количество гомозигот АА существенно ниже ожидаемого, а аа – наоборот, значительно выше.
Аналогичные результаты были получены и по двум другим комбинациям скрещивания. Так, у гибрида IR 74099-3R-3-3-3R-3-3 Новатор оказалось 2 АА, 8 Аа и 14 аа; у гибрида NSIC Rc 106 Новатор – 2 АА, 13 Аа и 15 аа. В целом при изучении генотипов было выявлено 5 форм, гомозиготных по аллелю Saltol. Они были высеяны в поле на F3, из которого отобрали лучшие формы для размножения и дальнейшего изучения.
На отклонения в результатах повлиял искусственный отбор лучших по морфотипу скороспелых растений.
Оценка гибридных форм риса F3.
Семена с проанализированных растений второго поколения были высеяны в 2015 году в поле для получения 3 поколения. Для очередного ПЦР-анализа из них взяли лучшие кустистые растения с хорошо озерннной метелкой и вызревшим зерном.
Гомозиготы, как по рецессивным, так и по доминантным аллелям Saltol, подтвердились, т.е. не расщеплялись. Анализ гетерозиготных линий показал, что расщепление по гену Saltol опять не укладывалось в рамки Мен-делевского.
Наблюдалась аналогичная закономерность, как и в 2014 году. В каждой гибридной комбинации преобладали растения с рецессивными аллелями гена (17-24), существенно меньше было гетерозигот (11-19), а солеустойчивых гомозигот – меньше всех (2-4). Суммарное расщепление по трем комбинациям произошло в соотношении 9 SS: 42 Ss: 60 ss.
Из 111 проанализированных растений F3, полученных из гетерозиготных линий F2, только 9 (8,1%) имели ген Saltol в гомозиготном состоянии вместо ожидаемых 25%. Это связано со сцеплением генов Saltol с неблагоприятными для растений в наших условиях генами и влиянием искусственного отбора (таблица 22).
Далее эти образцы продолжили размножать и изучать в селекционном питомнике, позже они были проанализированы лабораторными методами в условиях 1,5%-ного засоления NaCl. Гетерозиготные комбинации пересевались на следующий год и анализировались дополнительно с целью выявления искомого генотипа.
Оценка гибридных форм риса F4.
Из третьего поколения лучшие растения вошли в посев 2016 года для репродуцирования четвертого поколения. Таким образом, была получена 221 линия.
Из данного массива 213 линий прошли проверку на хлоридном засолении (в связи с нехваткой семян) и у 205 гибридных образцов удалось идентифицировать QTL Saltol (приложение 6).
По результатам ПЦР – анализа в лабораторных условиях АНЦ «Донской» была выделена 41 линия четвертого поколения с двумя доминантными аллелями Saltol (таблица 23).
Из 205 проанализированных растений F4, только 41 (20%) образец имел QTL Saltol в гомозиготном доминантном состоянии, 29 – в гетерозиготном состоянии (14%) и 135 – в гомозиготном рецессивном состоянии (66%).
Это расщепление связано с тем, что образцы подвергались влиянию искусственного отбора и с поля отбирались прежде всего наилучшие формы по признаку среднерослости, безостости, неосыпаемости, сжатости метлки, устойчивости к полеганию и лучшие по генетичексому анализу количественных признаков, проведенных по предшествующему поколению.
Оценка гибридных форм риса F5.
В результате SSR-анализа 198 образцов риса пятого поколения, отобранных на ОС «Пролетарская» по маркерам RM493 и RM7075 удалось идентифицировать наличие локуса Saltol только у 99 гибридных форм. Исследование проводилось в лаборатории маркерной селекции Аграрного научного центра «Донской». В качестве стандарта без гена Saltol использовали местный сорт Южанин, в качестве стандартного солеустойчивого генотипа – сорт IR-74 селекции Международного института риса. На электрофоре-граммах было обнаружено, что у некоторых образцов маркированные участки ДНК имеют разную молекулярную массу, в связи с чем удается отличить доминантные и рецессивные гомозиготы.
Бэнды ДНК доминантных гомозигот находились ниже, а рецессивных – выше, поскольку под действием электрического тока они двигались быстрее.
Различия среди линий по результатам проведения ПЦР – анализа представлены в приложении 7.
Данные по гомозиготам 2016 года подтвердились, среди гетерозигот происходило расщепление. Гомозиготные по доминантному локусу генотипы F5 представлены в таблице 24.