Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 7
1.1 Индуцированный мутагенез культурных растений 7
1.2. Генетическое и физиологическое действие лазерного и дальнего кранного света на растительный организм 12
1.3 Калий в жизни растения и клетки 24
2 Условия, материал и методика исследований 29
2.1 Агроклиматическая характеристика Кировской области 29
2.2 Метеорологические условия в годы проведения опытов 30
2.3 Почвы опытного участка
2.4 Характеристика исходного материала, используемого в опыте 43
2.5 Мутагенные факторы и методика выделения изменённых форм 44
2.6 Методика цитологических, физиологических и биохимических исследований 47
3 Влияние карбоната калия и излучения красного диапазона на рост и развитие ячменя в первом поколении 49
3.1 Влияние карбоната калия, ЛКС и ДКС на всхожесть семян, продолжительность фенологических фаз и выживаемость растений ячменя в первом поколении (М1) 49
3.2 Изменчивость количественных признаков ячменя в первом поколении 52
4 Изменчивость ячменя во втором поколении 62
4.1 Хлорофилльные мутации, выделенные во втором поколении 62
4.2 Морфологическая и физиологическая изменчивость ячменя во втором поколении 67
5 Мутационная и модификационная изменчивость ячменя в третьем поколении
5.1 Характер наследования хлорофилльных мутаций и морфофизиоло-гических изменений в М3 74
5.2 Частота и спектр мутационной изменчивости ячменя в третьем поколении
6 Изменчивость линии ячменя WAXY под действием карбоната калия и излучения красного дианазона
7 Динамика развития проростков ячменя под влиянием карбоната калия и излучения красного диапазона в лабораторных условиях
7.1 Энергия прорастания и всхожесть семян ячменя 89
7.2 Длина проростков и первичных корешков ячменя сорта Биос 1 90
8 Характеристика мутантов с хозяйственно полезными признаками 95
8.1 Электрофоретические спектры запасных белков у мутантных форм ячменя
8.2 Урожайность мутантных форм ячменя (М4 М6) в контрольном питомнике
8.3 Характеристика мутантов ячменя с хозяйственно-полезными признаками
Выводы
Предложения для селекционно–семеноводческой
Практики .
Список литературы
- Генетическое и физиологическое действие лазерного и дальнего кранного света на растительный организм
- Характеристика исходного материала, используемого в опыте
- Изменчивость количественных признаков ячменя в первом поколении
- Частота и спектр мутационной изменчивости ячменя в третьем поколении
Введение к работе
Актуальность. Наиболее эффективный способ повышения урожайности зерновых культур - это селекция новых сортов. Для успешного проведения селекционной работы необходим соответствующий исходный материал. Существенный вклад в решение этой задачи может внести метод экспериментального мутагенеза.
В настоящее время ведется поиск малотоксичных мутагенов, дающих высокий выход селекционно-ценных мутаций у растений. Таким фактором является лазерное красное излучение (Дудин Г.П. 1981; Володин В.Г., Мостовников В.А., Авраменко Б.И. и др., 1984) и некогерентный дальний красный свет (Дудин Г.П., Кривошеина О.С., 1994; Кривошеина О.С., 1998, Устюгов И.И., 2003).
По наиболее обоснованной гипотезе мутагенное действие излучения красного диапазона происходит не напрямую на молекулу ДНК, а косвенно через фитохромную систему растений (Кузнецов Е.Д., Сечняк Л.К., Киндрук Н.А., 1986; Дудин Г.П., 1989).
В результате фотохимического возбуждения фитохрома красным светом происходит активация мембранного транспорта ионов, в связи с этим представляет интерес изучение влияния экзогенного калия на наследственность растений ячменя.
Актуальными в этом плане представляются исследования по мутагенному действию карбоната калия и излучений красного диапазона в различных сочетаниях на семена ярового ячменя.
Цель исследований - изучить модификационную и мутационную изменчивость растений ярового ячменя под влиянием карбоната калия, излучения красного диапазона и их совместного действия, выявить наиболее эффективные сочетания изучаемых факторов при создании исходного материала для селекции ячменя.
Задачи исследований:
изучить влияние факторов воздействия на растения ячменя сорта Биос 1 в первом поколении;
определить частоту и спектр хлорофилльных и морфофизиологических мутаций ячменя во втором и третьем поколениях;
выявить изменения waxy-генов пыльцевых зерен ячменя под действием карбоната калия и красного излучения;
отобрать селекционно-ценные мутанты ячменя и провести их оценку на продуктивность.
Научная новизна. Научно обоснована возможность получения наследственных изменений на культуре ячменя при действии на семена раствором карбоната калия. Изучена мутагенная эффективность К2СО3 с различной концентрацией и в сочетании с лазерным красным и дальним красным светом.
Практическая значимость. Разработаны и предложены для практического применения способы мутагенной обработки семян ярового ячменя с использованием раствора карбоната калия и излучений красного диапазона.
Получены мутантные формы ячменя, которые представляют селекционную ценность по признакам скороспелости и высокой продуктивности. Двенадцать мутантов ячменя, обладающих ценными признаками и свойствами, переданы в ВНИИР им. Н.И. Вавилова.
Основные положения, выносимые на защиту:
закономерности роста и развития растений ячменя в первом поколении после обработки семян карбонатом калия и излучением красного диапазона;
частота и спектр модификационной и мутационной изменчивости во втором и третьем поколениях в зависимости от способа обработки семян;
частота мутирования waxy-гена при обработке семян тестерной линии;
оценка и характеристика мутантных форм;
Достоверность результатов. Эксперименты проведены в соответствии с общепринятыми методическими принципами. Достоверность выводов основывается на статистической обработке данных.
Личный вклад автора. Автор принимала непосредственное участие во всех полевых и лабораторных исследованиях, учетах и наблюдениях. Проводила математическую и статистическую обработку полученных данных в опыте.
Апробация работы. Основные результаты исследований по теме диссертации были доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Инновационные технологии - в практику сельского хозяйства» (Киров, 2009), на научно-практических конференциях молодых ученых, аспирантов и соискателей «Науке нового века - знания молодых» (Киров, 2010, 2011, 2012), на Всероссийской научно-практической конференции «Наука, инновации и образование в современном АПК» (Ижевск, 2014); на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 70-летию агрономического факультета «Актуальные вопросы аграрной науки: теория и практика» (Киров, 2014), на Международной научно-практической конференции «Вклад молодых ученых в инновационное развитие АПК России» (Пенза, 2015).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работах, в т.ч. 2 работы в изданиях, входящих в перечень рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 162 страницах и состоит из введения, 8 глав, выводов, предложений для селекционно-семеноводческой практики. Работа содержит 23 таблицы, 26 рисунков и 13 приложений. Список литературы включает 210 источников, из них 30 - иностранных авторов.
Генетическое и физиологическое действие лазерного и дальнего кранного света на растительный организм
Физический и химический мутагенез наряду с традиционными методами селекции - гибридизацией и отбором - применяется для создания новых сортов сельскохозяйственных растений, характеризующихся высокой продуктивностью, широкой амплитудой приспособляемости к условиям выращивания, высокой питательной ценностью, устойчивостью к болезням и вредителям и т. д. (Прийлин О., 1976).
Индуцированный мутагенез является одним из способов создания генетического разнообразия растений. Большой и быстрый прогресс в селекции растений был достигнут с открытием главных источников генетической изменчивости - генных мутаций и рекомбинаций и возможностью вызывать их искусственно (Ауэрбах Ш, 1968).
Советские ученые A.A. Сапегин и Л.Н. Делоне одними из первых использовали излучения в селекции зерновых культур. Они показали, что искусственные мутанты могут быть хорошим исходным материалом в селекции (Сапегин А.А., 1935 и Делоне Л.Н., 1934). Методика практической мутационной селекции была разработана в 1942... 1943 гг. Фрейслебеном Р. и Лейном А. из Халле (Германия) (Моргун В.В., 1996).
Заинтересованность селекционеров в повышении частоты жизнеспособных мутаций у растений привела к разработке различных приемов экспериментального мутагенеза с использованием физических факторов. Наиболее изученным фактором является ионизирующая радиация, которая оказывает относительно «грубое» воздействие на генетические структуры клеток и физиолого-биохимические процессы в организме. Для искусственного получения мутаций применяют различные источники ионизирующего излучения: гамма-лучи, лучи Рентгена, и - частицы, быстрые и медленные нейтроны, испускаемые радиоактивными элементами (Гуляев Г.В., 1984; Гуляев Г.В., Гужов Ю.Л., 1987).
В месте поглощения энергии излучения при прямом попадании в молекулу она переходит в возбужденное или ионизированное состояние. Поражающее действия излучения связано с ионизацией молекулы ДНК. Непрямое действие радиации состоит в повреждениях молекул, мембран, органоидов, клеток, вы зываемых продуктами радиолиза воды, количество которых в клетке при облучении очень велико. Кроме того, при взаимодействии радикалов воды с органическими веществами в присутствии кислорода образуются органические перок-сиды, что также способствует лучевому повреждению молекул ДНК и структур клетки (Полевой В.В., 1989).
Точковый характер мутаций позволяет во многих случаях получать сорта из растений-мутантов путем их простого размножения без дополнительной селекционной проработки (Шевелуха B.C., 2000).
Неионизирующим излучением считают ультрафиолетовое. Проникающая способность ультрафиолетового излучения очень мала. Оно имеет длину волны 200…400 нм и вызывает довольно высокую частоту мутаций, особенно в пределах длины волны, которая поглощается дезоксирибонуклеиновыми кислотами (260…265 мм). Фотоны ультрафиолета обладают небольшой энергией, и при их воздействии возникает возбуждение молекул ДНК, что в последующем приводит к их химическому изменению, к образованию димеров тимина, гидратации цитозина и урацила, разрыву водородных связей (Дубинин Н.П., 1986).
Повышенный уровень радиации, высокая и низкая температура, освещенность, недостаток или избыток влаги, механические воздействия относятся к физическим стрессорам (Генкель П.А., 1982).
Первую фазу стресса называют первичной индуктивной стрессовой реакцией. Неспецифические реакции включаются в виде каскада и касаются интегральных процессов. Увеличивается проницаемость мембран в результате изменения молекулярного состава их компонентов. Это приводит к обратимому выходу ионов калия из клетки и входу ионов кальция из клеточной стенки и органелл. Происходит деполяризация мембран. Тормозится синтез белка, процессы транскрипции и репликации. Вслед за фотосинтезом ингибируется дыхание, происходят сдвиги в его структуре, снижается уровень АТФ, активируются свободнорадикальные процессы. А также происходит увеличение синтеза этилена и АБК, торможение деления и роста, поглотительной активности клеток и других процессов (Чиркова Т.В., 2002).
Наряду с радиационным мутагенезом эффективным методом индукции генетического разнообразия является химический мутагенез. Он характеризуется более высокой специфичностью в отношении действия на ДНК, чем ионизирующие излучения. После открытия супермутагенов на химический мутагенез сельскохозяйственных растений возлагались очень большие надежды (Рапопорт И.А., 1971а), которые, оправдались не полностью. Поэтому постоянно идет поиск новых, более эффективных химических мутагенов и вариантов воздействий на семена и растения (Ерошенкова Л.И.,1990, Рудаковская Е.Г., 1993). Вероятно, для повышения эффективности химического мутагенеза следует применять комплекс химических мутагенов, обладающих различными механизмами действия на ДНК.
Относительно низкая частота индукции хозяйственно-ценных форм у зерновых культур объясняется не недостаточной генетической активностью мутагенных факторов, а очень высокой надежностью растительного генома (Свептицкий И.Н., 1990). В настоящее время для повышения частоты мутаций используют различные методы модификации мутационного процесса. Сущность усовершенствования мутационного процесса заключается либо в увеличении чувствительности молекулы ДНК к различным мутационным воздействиям, либо в изменении функционирования репарационных систем, что приведет к сохранению произошедших мутаций на молекулярном и в дальнейшем на фенотипическом уровнях.
В начале 60-х годов прошлого века И.А. Рапопорт (1960) установил мутагенное действие нитрозоалкилмочевин. Особенно сильным мутагенным действием обладают N-нитрозо-N-этилмочевина и N-нитрозо-N-метилмочевина. Благодаря сверхвысокому мутагенному эффекту эти соединения получили название «супермутагены» (Рапопорт И.А., 1966). Выяснилось, что нит-розоалкилмочевины вызывают большой процент мутаций с широким морфологическим спектром (Зоз Н.Н., 1966) и имеют способность индуцировать системные мутации (Макарова С.Н., 1965). К числу супермутагенов относят также нитрозоалкилуретаны, нитрозоалкиламиды, нитрозоалкиламины и другие.
Установлено, что и по выходу полезных мутаций нитрозоалкилмочевины значительно превосходят все остальные сильные мутагены (Рапопорт И.А., 1966; Прийлин О.,1976).
В качестве химических мутагенов широко используются алкилирующие соединения, акридиновые красители, ингибиторы предшественников нуклеиновых кислот, аналоги азотистых оснований (Жученко А.А., 2003).
Использование метода экспериментального мутагенеза весьма эффективно в селекции растений. Как прямое использование мутантов, так и включение их в скрещивания позволяют на основе сочетания мутационной и рекомбинационной изменчивости существенно повысить уровень генетического разнообразия, реорганизовать генотип растений в нужном для генетика и селекционера направлении (Рапопорт И.А., 1971б).
На основе искусственного мутагенеза созданы и внедрены в производство высокоурожайные сорта ячменя, фасоли, безалколоидные формы люпина, высокоолеиновые мутанты подсолнечника, ультраскороспелые и позднеспелые мутанты зерновых культур (Ауэрбах Ш., 1978).
В Краснодарском НИИ выведены ценные сорта озимого ячменя Дебют и Новатор. На основе мутантных форм созданы короткостебельные сорта озимой ржи Белорусская 23, Ярославна, Харьковская 78. Выведены мутантные сорта ячменя Темп и Каскад (Гужов Ю.Л., Фукс А., Валичек П., 1991). При скрещивании двух мутантных форм получен сорт зернового сорго Волжское-4 (Костина Г.И., 1999).
Характеристика исходного материала, используемого в опыте
В опыте использовали углекислый калий (К2СОз) чистотой 99% (ГОСТ 4221-65). Лазерный красный свет (ЛКС) получали на лазерной гелий-неоновой установке ОКГ-12-1, плотность мощности излучения 0,1 мВт/см2, длина волны 632,8 нм. Дальний красный свет (ДКС) с длиной волны 754±10 нм получен при прохождении света от электрической лампы накаливания через интерференционный светофильтр с применением осветителя ОИ-1, плотность мощности излучения 0,3 мВт/см2. Экспозиция облучения семян 60 мин. Контроль плотности луча осуществляли с помощью прибора ИПМ-1.
Замачивание семян в дистиллированной воде и водном растворе карбоната калия проводилось в течение 12 ч. Использовалось индивидуальное и совместное применение факторов. Повторность опыта 4-кратная. Семена обрабатывали в соответствии со схемой опыта по 500 зерен в каждом варианте (125 зерен на делянку).
Схема опыта включает следующие варианты: 1 - Контроль (с. з. - семена, замоченные в дистиллированной воде), 2 - К2СО3 0,01 М, 3 - К2СО 0,1 М, 4 -К2СО3 1 М, 5 - с. з. + ЛКС, 6 - с. з. + ДКС, 7 - К2СО3 0,1 М + ЛКС, 8 - ЛКС + К2СО3 0,1 М, 9 - К2СО3 0,1 М + ДКС, 10 - ДКС + К2СО3 0,1 М, 11 - ЛКС + К2СО3 0,1 М + ДКС, 12 - ДКС + К2СО3 0,1 М + ЛКС
Посев проводился вручную, расстояние между рядками 15 см, площадь делянки 1м2. Размещение делянок систематическое в 2 яруса, со смещением на 6 номеров.
В первом поколении (Мi) проводились фенологические наблюдения, учитывалась полевая всхожесть семян, выживаемость растений ячменя. После уборки у 60 растений анализировали элементы структуры продуктивности (общая и продуктивная кустистость, длина стебля и колоса, число зерен в колосе и масса зерна с колоса), определялся коэффициент изменчивости признаков (СV, %). Суммарный характер воздействия факторов оценивали с помощью коэффициента депрессии (D,%) - стимуляции (St,%), который рассчитывали по пяти признакам: полевая всхожесть семян, длина стебля и колоса, количество зерен в колосе, масса зерна с колоса. (Володин В.Г., Лисовская З.И., 1979).
Во втором поколении (М2) посемейно высевали семена с главного колоса растений первого поколения. На протяжении всего периода вегетации выделялись семьи с хлорофилльными мутациями по классификатору и описанию, разработанному Ю. Калам, Т. Орав (1974). Проводился отбор растений с видимыми морфологическими (кустистость, форма куста, длина стебля и колоса, плотность колоса, число зерен в колосе, зазубренность остей) и физиологическими (сроки наступления фенологических фаз, окраска стебля, колоса, остей, наличие или отсутствие воскового налета) отклонениями от исходного сорта. Растения с изменениями отмечались и убирались отдельно. В М2 проводили группировку выделенных растений по измененным признакам, определялась частота изменений ячменя по отношению количества семей с изменениями к общему количеству семей в варианте. Анализ элементов структуры продуктивности проводился у всех растений в выделенной семье с изменениями (Лысиков В.Н., 1975).
В третьем поколении (Мз) посемейно высевали семена с главного колоса измененных растений второго поколения. В Мз проверялось наследование из мененных признаков, выявленных в Мг.
Процент наследования мутаций в Мз определяли по отношению числа семей с мутантными признаками в Мз к количеству выделенных семей с изменениями в М2. Частоту мутаций в Мз определяли по числу семей с мутантными признаками к количеству семей, проанализированных в Мг (Володин В.Г., 1975). Проводился учет новообразований, возникших в третьем поколении.
В М2 и Мз проводили фенологические наблюдения, отмечали фазы всходов, кущения, выход в трубку, колошения, восковой и полной спелости; сравнивали измененные формы ячменя по элементам продуктивности растений с исходным сортов Биос 1, определяли массу 1000 зерен.
В Мь М5 и М6 мутантные формы с хозяйственно-ценными признаками, представляющие интерес для селекции, оценивали на урожайность по методике контрольного питомника (КП) (Гужов Ю.Л., Фукс А., Валичек П., 1991). В контрольном питомнике площадь делянок 1 м2, размещение систематическое со смещением, повторность трехкратная, норма высева - 500 зерен на 1 м2. Измененные формы ячменя сравнивали по урожайности и элементам структуры продуктивности с исходным сортом Биос 1 и со стандартным сортом Нур.
Для оценки изменчивости количественных признаков проводили статистическую обработку данных, определяли характеристики: среднюю арифметическую (х),ошибку средней арифметической (Sx), коэффициент вариации (Cv, %) и другие (Доспехов Б.А., 1985; Моисейченко В.Ф., Трифонова М.Ф., Заверюха А.Х. и др., 1996) (приложение 1).
Существенность различий между опытными вариациями и контролем устанавливали с помощью критерия Стьюдента (tst) (Моисейченко В.Ф., Трифонова М.Ф., Заверюха А.Х. и др., 1996) (приложение 2).
При оценке показателей альтернативной (качественной) изменчивости определяли долю признака (Рi Р2 и т.д.) и стандартную ошибку доли (Sp) (Вольф В.Г., 1966) (приложение 3).
Данные, полученные в опыте, варианты (выборки), которые связаны п-количеством повторений, обрабатывали с помощью дисперсионного анализа для однофакторных экспериментов. По критерию Фишера (F) устанавливали наличие вариантов, существенно отличающихся от остальных, а критерий наименьшей существенной разницы НСР = tst показывал предельную ошибку разности двух выборочных средних (Доспехов Б. А., 1985). Математическую обработку цифрового материала проводили с помощью компьютерной программы Microsoft Excel.
Методика выявления изменений Waxy-генов в пыльцевых зёрнах разработана Г. Эриксоном в 60-е годы XX века (Eriksson G. 1962, 1969) и улучшена Е.Р. Виленским и Б.К. Щербаковым (1985).
Для изучения генетического действия используемых факторов обрабатывали семена ячменя линии Waxy. В период созревания пыльников колосья с главных стеблей срезали и фиксировали в 70 % этиловом спирте, высушивали и хранили в холодильнике.
Для приготовления препаратов пыльцевых зерен у каждого колоса из средней части извлекали пыльники и окрашивали пыльцу раствором Люголя (150 мг J и 400 мг KJ на 100 мл воды). Просмотр препаратов вели на микроскопе « Biolar» при увеличении 480. Выборка с каждого варианта составляла 73-88 тыс., а в контроле 107 тыс. пыльцевых зерен.
Частоту Waxy-мутаций определяли как количество мутантных пыльцевых зерен (мутантов), отнесенных к общему числу просмотренных и выражали в процентах.
Определение энергии прорастания и всхожести семян в лабораторном опыте проводили методом рулонной культуры (Таланов И.П., 2008). При проращивании семян в рулонах на двух слоях увлажненной бумаги размером 10100 см раскладывали одну пробу семян зародышами вниз по линии, проведенной на расстоянии 2-3 см от верхнего края бумаги. Полосы сворачивали в рулон и в вертикальном положении помещали в растильню.
Изменчивость количественных признаков ячменя в первом поколении
Вариационная изменчивость количества колосков в колосе в большинстве вариантов была достоверно меньше контрольного варианта (Сv = 12,6 %) или на уровне контроля отмечена в вариантах К2СО3 1 М (Сv = 12,6 %), с. з. + ЛКС (Сv = 11,2 %), ДКС + К2СО3 0,1М + ЛКС (Сv = 10,1 %).
Наибольшая вариабельность числа зерен в колосе наблюдалась в варианте ДКС + К2СОз 0,1М (Сv = 15,8 %), что существенно превысило контрольный вариант (Сv = 10,5 %). Увеличение коэффициент вариации данного признака наблюдалось и в вариантах: К2СОз 1 М (Сv = 12,5 %), ЛКС + К2СОз 0,1 М + ДКС (Сv = 10,8 %), с. з. + ЛКС (Сv = 11,7 %).
Коэффициент вариации массы зерна с колоса был максимальным в тройных комплексных вариантах - ЛКС + К2СО3 0,1М + ДКС (Сv = 22,0 %), ДКС + К2СОз 0,1М + ЛКС (Сv = 20,4 %). В остальных вариантах был не существенно ниже или выше контроля. Минимальное значение данного показателя по сравнению с контролем (Сv = 17,9 %) наблюдалось в варианте К2СО3 0,1 М + ДКС (Сv = 13,9 %).
Применение раствора К2СО3 в концентрации 0,01 М снизило изменчивость общей и продуктивной кустистости, длины колоса, количества зерен в колосе, облучение лазерным красным светом увеличило вариабельность признаков длины колоса, количества зерен в колосе, массы зерна с колоса. Обработка семян ячменя лазерным красным излучением, дальним красным светом, комплексные тройные варианты снизили коэффициент вариации (CV, %) общей и продуктивной кустистости, длины стебля.
На основании изменения показателей количественных признаков относительно контроля: длины стебля и колоса, количества зерен в колосе, массы зерна с колоса и всхожести семян под действием карбоната калия и излучения красного диапазона была рассчитана реакция растений ячменя на воздействие изучаемых факторов в первом поколении, определен стимулирующий или угнетающий эффект (приложение 6) и построен график (рисунок 4).
Применение изучаемых факторов стимулировало рост и развитие растений во всех вариантах опыта за исключением К2СО3 1 М, где отмечен коэффи циент депрессии (D) 1,4. При понижении концентрации К2СО3 от 1 до 0,01 М наблюдается возрастание стимулирующего эффекта за счет увеличения всхожести семян, длины стебля и колоса, количества зерен в колосе.
При совместной обработке семян ячменя К2СО3 0,1 М и ЛКС в прямом и обратном сочетании отмечен аддитивный стимулирующий эффект (S = 4,8 % и 4,5 %), по сравнению с индивидуальным применением данных факторов по отдельности (S = 0,2 и 0,29 %). Наблюдается достоверное увеличение длины колоса, количества зерен в колосе.
Обработка растений совместно К2СО3 0,1 М + ДКС вызвала также хорошо выраженный стимулирующий эффект на растения ячменя (S = 3,3 %), но при обратном сочетании факторов ДКС + К2СО3 0,1 М (S = 0,1 %) данный эффект отсутствует. В комплексных вариантах также наблюдается стимулирую щее действие на развитие растений (S = 2,33…3,15 %), при завершающей обработке ДКС значение стимуляции выше.
Таким образом, максимальный стимулирующий эффект на растения в первом поколении оказывает применение К2СО3 0,1 М и ЛКС в прямом и обратном сочетании. Красный лазерный свет в результате фотохимической активации фитохрома активирует мембранный транспорт ионов, регулирует проницаемость клеточных мембран для калия и положительно влияет на рост и развитие растения ячменя. Дальний красный свет, наоборот, снижает миграцию калия через мембрану в клетку и в парном варианте ДКС + К2СО3 0,1 М наблюдается минимальный стимулирующий эффект на растения ячменя (S = 0,15 %). На протяжении всего вегетационного периода в М2 велась работа по отбору измененных растений по признакам, отличающимся от исходного сорта Биос 1.
С момента появления массовых всходов во втором поколении определяли тип и провели подсчеты хлорофилльных мутаций.
Данные мутации являются индикатором эффективности мутагенных факторов. Хлорофилльные мутации, вызванные мутагенами, практического значения не имеют, однако высокая частота и простота учета делают их очень удобными для оценки мутабильности сортов и эффективности мутагена уже во втором поколении (Калам Ю., Орав Т., 1974; Володин В.Г., Мостовиков В.И., 1984). Некоторые авторы считают, что причиной возникновения хлорофилль-ных мутаций являются крупные хромосомные перестройки (Хвостова В.В., Соколова В.А., 1973). По мнению других исследователей, в большинстве случаев это точковые мутации, представляющие собой внутригенные изменения (Володин В.Г., Колосенцева Н.В., Лисовская З.И., 1989).
Во время проведения эксперимента во всех вариантах опыта было выделено 54 семьи с хлорофилльными нарушениями (табл. 11). Наибольшее их количество было отобрано в варианте ЛКС + К2СО3 0,1 М + ДКС – 8 семей, 7 семей отмечено в варианте карбонат калия 0,01 М. По 6 семей с хлорофилльными мутациями выделено в вариантах К2СО3 1 М и с. з. + +ДКС. В варианте ДКС + К2СО30,1 М и К2СО3 0,1 М было отмечено по 5 семей. Обработка семян по схемам ЛКС + К2СО3 0,1 М и К2СО3 0,1 М + ДКС индуцировали по 4 семьи с хлорофилльными нарушениями. Таблица 11 – Частота хлорофилльных мутаций в М Вариант Проанализировано семей Частота хлорофилльных мутаций
Частота и спектр мутационной изменчивости ячменя в третьем поколении
Определение энергии прорастания, всхожести семян, площади листа, динамики роста растений в лабораторных условиях позволяет более точно оценить действие изучаемых факторов на ранних этапах развития растений. При этом возможно нивелировать воздействие неблагоприятных климатических факторов и неоднородность почвенных условий, присутствующих при проведении полевых опытов.
X. Гауль (1965) считал более простым методом быстрого определения ранних эффектов от воздействия мутагенных факторов сравнительное измерение величины проростка, первого листа, или корня на определенный день развития растения.
Обработка семян растворами К2СО3 0,01; 0,1; 1 М и облучение красным светом различной длины волны не оказали стимулирующего влияния на энергию прорастания и всхожесть семян ячменя (табл. 20).
Достоверное снижение энергии прорастания семян наблюдалось в вариантах К2СО3 1 М – 45 % и ЛКС + К2СО3 0,1 М – 72 %.
При облучении семян красным и дальним красным светом энергия прорастания семян при применении ЛКС (91,5 %) выше, чем при облучении ДКС (87,5 %). В парных вариантах энергия прорастания семян зависела от порядка обработки семян. Более высокое значение показателя было отмечено при завершающем воздействии красного света – в вариантах К2СО3 0,1 М + ЛКС – 92,5 %, К2СО3 0,1 М + ДКС – 90,5 %, при обратном сочетании факторов ЛКС + + К2СО3 0,1 М и ДКС + К2СО3 0,1 М – 72,0 и 87,5 %, соответственно. В комплексных тройных вариантах ЛКС + К2СО3 0,1 М + ДКС и ДКС + К2СО3 0,1 М + ЛКС показатель энергии прорастания семян не зависел от порядка обработки семян и составил, соответственно, 87,5 % и 87,0 %.
Показатель всхожести семян по сравнению с энергией прорастания незначительно снизился в вариантах с. з. + ЛКС, К2СО3 0,1 М + ЛКС на 0,5 %, остался на прежнем уровне в вариантах ДКС + К2СО3 0,1 М и К2СО3 0,1 М, в остальных вариантах повысился на 1,0…41,6
При замачивании семян в растворы К2СО3 всхожесть семян уменьшилась с увеличением концентрации раствора соли с 90,0 до 77,0 %. В парных вариантах завершающее применение химического фактора (К2СО3) существенно снизило всхожесть семян на 6,5 % по сравнению с контролем, а также на 3,5 % и 4,5 % по сравнению с индивидуальным использованием ЛКС и ДКС. В трой ных вариантах показатель всхожести семян оказался на уровне вариантов с индивидуальным применением факторов.
Калийная соль К2СО3 и красное излучение оказали стимулирующее влияние на длину проростков (рисунок 16) и корешков (рисунок 17) ячменя, но динамика их роста имела особенности в зависимости от природы воздействующего фактора и порядка обработки семян (приложение 10).
Длина проростков на 3 сутки развития оказалась на уровне контроля (2,17 см) только при облучении семян лазерным красным светом (2,23 см), в остальных вариантах показатель был ниже. В вариантах К2СО3 1 М – 0,22 см, ДКС + К2СО3 0,1 М – 1,61 см, ЛКС + К2СО3 0,1 М – 1,76 см, К2СО3 0,1 М – 1,85 см наблюдалось достоверное снижение данного показателя. В парных вариантах при завершающем действии химического фактора длина проростов была ниже на 14 % (ЛКС + К2СО3 0,1 М) и на 20 % (ДКС + К2СО3 0,1 М), чем при обратном порядке обработки.
На 7 сутки длина проростков во всех вариантах опыта достоверно превышала контроль (11,72 см), кроме варианта К2СО3 0,01 М (12,49 см), где превышение было не существенным. Максимальное значение длины проростков отмечено в варианте К2СО3 0,1М + ДКС – 15,12 см. В итоге с 3 по 7 сутки наблюдалось увеличение длины проростка в 5,3…8,3 раза. В варианте К2СО3 1 М, где длина проростка увеличилась в 72 раза (с 0,22 до 14,47 см).
Через 15 дней после обработки семян во всех вариантах опыта длина проростков достоверно превысила контроль (13,83 см) на 3,45…10,51 см. Максимальное значение длины проростка семени отмечено в варианте К2СО3 1 М (24,34 см). При увеличении концентрации раствора К2СО3 с 0,01 до 1 М увеличивается и длина проростка с 18,28 до 24,34 см.
На 15 сутки развития ячменя отмечено, что длина проростков при замачивании семян в растворы К2СО3 или в сочетании с красным излучением выше, чем при индивидуальном облучении лазерным красным или дальним красным светом семян, замоченных в воде.
Длина корешков на 3 сутки имеет сильную корреляционную зависимость с длиной проростков на 3 сутки (r = 0,93) на 0,1 %-ном уровне значимости (приложение 11). Существенное угнетение роста корешков по сравнению с контролем (5,26 см) было отмечена в вариантах К2СО3 1 М – 1,66 см, ДКС + К2СО3 0,1 М – 4,36 см, ЛКС + К2СО3 0,1 М – 4,58 см. В остальных вариантах длина корешка не значительно отличалась от контроля. Несколько ниже она была в вариантах К2СО3 0,1 М (5,00 см) и К2СО3 0,01 М (5,16 см), в остальных вариантах длина первичного корешка варьировала од 5,30 до 5,55 см.
На 7 сутки длина корешков достоверно выше контрольного варианта (10,03 см) наблюдалась в вариантах: К2СО3 0,01 и 1 М (11,06 см и 11,15 см соответственно), с. з. + ЛКС – 11,20 см, с. з. + ДКС – 11,58 см, К2СО3 0,1М + ЛКС – 11,66 см, ЛКС + К2СО3 0,1М + ДКС – 11,44 см. Наименьший показатель отмечен в вариантах – ДКС + К2СО3 0,1 М (9,58 см), ЛКС + К2СО3 0,1 М (9,62 см).
Длина корешков ячменя на 15 сутки во всех вариантах существенно больше контроля (11,07 см), кроме варианта ДКС + К2СО3 0,1 М, где превышение было в пределах ошибки опыта. При этом в контрольном варианте прирост длины корешка составил 1,04 см, а в опытных вариантах 1,75…3,66 см.
Длина проростков на 15 сутки находилась в сильной корреляционной связи (r = 0,98) с площадью листовой пластики на 15 сутки на 0,1 %-ном уровне значимости.
Наименьшая площадь листа отмечена в контрольном варианте (3,47 см2) (рисунок 18). В варианте К2СО3 1 М площадь листовой пластинки у проростков наибольшая – 5,95 см2. При уменьшении концентрации раствора К2СО3 с 1 до 0,01 М площадь листа снижается на 1,55 см2.
Облучение лазерным красным (4,85 см2) и дальним красным светом (4,50 см2) семян, замоченных в воде, стимулировало рост листовой пластинки на одном уровне с замачиванием в растворе К2СО3 0,1 (4,89 см2) и 0,01 М (4,40 см2). В парных и комплексных вариантах площадь листовой пластинки зафиксирована выше (5,0…5,38 см2), чем при индивидуальном применении факторов, кроме варианта ДКС + К2СО3 0,1 М, в котором площадь листа составила 4,64 см2.