Введение к работе
Актуальность темы. Исследования характера и динамики морфологических изменений кардиомиоцитов (КМЦ) при разнообразных экспериментальных воздействиях позволили свести многообразные и семантически многозначные определения дистрофических и некробиотических изменений мышечных клеток сердца (Хехт А., 1975; Korb G., Totovic V., 1963) к единообразной схеме форм острой патологии клетки (Целлариус Ю.Г., Семенова Л.А., 1972; Семенова Л.А., Целлариус Ю.Г., 1978; Непомнящих Л.М., 1981, 1991). Формы альтерации КМЦ описываются как состояния их миофибриллярного аппарата, привязанные, в значительной мере, к их поляризациоііно-оптическому отображению. Основой схемы является выделение четырех пєрвігчньїх и самостоятельных типов пов-реждеігай КМЦ: миоцитолизис, контрактуры миофибрилл, первичный глыбчатый распад и цитолиз с исходом в колликвациош'шй или коагуля-ционный некроз (Целлариус Ю.Г., Семенова Л.А., Непомнящих Л.М., 1980).
Изложенная трактовка морфологических проявлений ранних повреждений КМЦ является в сущности описанием картины качественной упорядоченности или дезориеіггарованности их миофибриллярного аппарата - состояния двулучепреломления миофибриллярного аппарата продольно ориентированных мышечных клеток сердца. Этот метод накладывает ограничения как на выявление и исследование поперечно срезанных мышечных клеток сердца, так и на анализ количественных характеристик состояния КМЦ.
При исследовании срезов тканей было обнаружено, что после облучения коротковолновым ультрафиолетом (КУФ), многие гистологические структуры начинают во много раз ярче светиться в видимой области спектра при возбуждении этого свечения длинноволновой ультрафиолетовой (ДУФ) частью спектра. Этот процесс был назван фотохимическим флюорохромированием (Целлариус Ю.Г., 1966) и показан на гистологических препаратах некоторых тканей и отдельных компонентах клеток (Груздев А.Д., Целлариус Ю.Г., 1966). Актуально изучение возможности фотохимического флюорохромирования для исследования процессов повреждения КМЦ в сердечной мышце.
Обычно гистологические препараты обладают слишком слабой интенсивностью свечения (аутолюминесценцией) в видимой части спектра. Достигнутая же в результате КУФ-облучешія интенсивность свечения становится достаточной для визуального микроскопического исследова-шія и количественной регистрации оптичесюгх характеристик свечения элементов препаратов.
Предыдущими иселедоваїшями было установлено, что люминесценция в видимой области белков обнаруживается в некоторых случаях и зависит от строешія, конформациониого и агрегатного состояния (Черницкий Е.А., 1972; Красников В.В. и др., 1987; Longworth J.W., 1971)
и пс имеет устоявшейся интерпретации. Люминесцентные свойства продуктов ультрафиолетовых фотохимических реакций биоорганических соединений весьма редко анализируются в публикациях. Исходя из данных но фотохимии биоорганмческих соединений (Владимиров Ю.А., 1965; Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972; Игаатенко А.В. и др., 1982; Каю-шик Л.П. и др., 1973; Красников В.В. и др., 1987; Мостовішков В.А. и др., 1988; Pokomyj et al., 1975; Tappel A.L., 1973; 1981), можно полагать, что люшшесцирующие хромофорные группы образуются в результате непосредственных, преимущественно окислительных, фотопреобразований белковых и лцпвдных молекул и в результате карбониламинных реакций КУФ-образованных карбонильных групп с аминогруппами компонентов препарата. Еще меньше исследован процесс фотофлюорохроми-рования препаратов животной клетки.
Чувствительность процесса фотохимического флюорохромироваїшя к состоянию облучаемого препарата и независимость свечения исследуемых структур от ориентированности в поле препарата дало возможность предположить, что фотофлюорохромировашіе может быть чувствительным методом выявления состояния миофибриллярного аппарата мышечной клетки сердца для определения ранних проявлений некробиоза кар-диомиоцитов.
Цель и задачи исследования. Цель исследования заключается в выявлении основных особенностей процесса фотохимического флюорохро-мирования основных компонентов мышечной клетки сердца, изучении процесса фотофлюорохромировашш нормального и альтерированного КМЦ и выявлении отличий в их морфологической картине свечения.
Поставлены следующие задачи.
-
Выявить и оценить способность к фотофлюорохромированию основных аминокислот - составляющих белковой молекулы. Изучить кинетические и спектральные характеристики процесса фотофлюорохроми-рования отдельных белков, углеводов, нуклеиновых кислот и кофермен-тов - компонентов клеточных структур» а также смеси компонентов миокарда.
-
Изучить кинетические и спектральные характеристики процессе фотофлюорохромирования нормальных и контрактурно поврежденные КМЦ на гистологических препаратах сердечной мышцы.
-
Изучить и сопоставить морфологические картины свечения структур миокарда с соответствующими поляризационно- и свето-оптическими микроскопическими изображениями.
Научная новизна. В данной работе впервые исследована способности аминокислот, белков, животных углеводов, нуклеиновых кислот и кофер ментов пиримидшгового ряда к образованию люминесцирующих продук тов при КУФ-облучении. Показана многоступенчатость и разветвлен ность фотохимических реакций основных компонентов клетки Пр] КУФ-облучении и существенность процессов фотоокисления при обра зовании люминесцирующих хромофоров. Показано, что при КУФ-облу
чепии компонентов клетки образуется с разной скоростью ряд фотопродуктов с близкими по спектру люминесценции хромофорными группами.
Впервые описана и изучена кинетика и спектральные характеристики фотохимического флюорохромирования миокарда - процесса последовательного образования продуктов с хромофорными группами, спектры люминесценции которых смещаются в длинноволновую область спектра. Показана лимитирующая роль темповых стаді!» в процессе образования люминесцирующих хромофорных групп ігри КУФ-облучсшш.
Впервые показано, что на фотофлюорохромированиом гпстологичес-ком препарате морфологическое состояние мышечной клетки сердца определяется картиной свечения его миофибриллярного аппарата. Определена кинетика фотофлюорохромировапия интактных и альтерированных КМЦ, показано совпадение их спектров люминесценции, определены оптимальные условия: для достижения достаточно!! для детального мик-роскопировапия интенсивности свечения и повышения контраста свечения между интактными и поврежденными КМЦ на препарате.
Впервые измерено количество сухого вещества на единицу площади неповрежденного (іштактного) КМЦ (НКМЦ) и КМЦ с контрактурой миофибриллярного аппарата (ККМЦ), проведено измерение интенсивности люминесценции этих же участков клеток посіє КУФ-облучення.
Показано, что интенсивность люминесценции мышечной клетки сердца определяется количеством ее содержимого, т.е. интенсивность свечения с единицы поверхности КМЦ, отнесенная к массе клетки под той же единицей поверхности (удельная интенсивность люминесценции), одинакова для шпаклюй клетки и поврежденной клетки с контрактурой. Различия в интенсивности свечения интактных и альтерированных КМЦ определяются локальным перераспределением кассы их сократительного аппарата - при локальном лизисе миофибрилл выявля-ются участки с пониженной интенсивностью свечения, участки контрактур сопровождаются повышением уровігя люминесценции.
Предложено параллельное использование методов фотохимического флюорохромирования и поляризациоино-оптического исследования в качестве нового методического подхода для анализа начальных стадий некробиоза мышечных клеток сердна.
Практическое аиачеяие исследования. На основании проведенного исследования стало возможным применение фотохимического флюорохромирования для морфологической диагностики предке кроти ческнх изменений и некрозов .миокарда, что имеет важное значение в морфологической практике.
Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждены на Совещании по проблемам соединительной ткани (1966, Новосибирск), Всесоюзном симпозиуме "Общие механизмы клеточных реакций на повреждающие воздействия" (1975, Ленинград), Втором всесоюзном симпозиуме "Острая ишемия органов и ранние иостшиемические расстройства" (1978, Москва), на Конференции "Естественные науки на службе здраво-
охранения" (1980, Новосибирск), Третьей конференции
"Ультраструктурные основы патологии сердца и сосудов" (1985, Цхалту-бо), на семинаре лаборатории клеточной диффереіщировки Института цитологии и генетики СО РАН (1994, Новосибирск), на межлабораторном семинаре Института региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (1994, Новосибирск).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ.
Объем н структура диссертации. Содержание диссертации изложено на 149 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы - 2 главы, характеристики материала и методов исследования - 1 глава, результатов исследования - 3 главы, обсуждения -2 главы, выводов, списка литературы (428 источников). Текст иллюстрирован 3 таблицами, 32 схемами и графиками и 33 микрофотографиями.