Введение к работе
Актуальность проблемы. Как известно, патологические изменения при действии раэиичных экстремальных и патогенных факторов начинаются на суоклеточном уровне. В настоящее время, в связи с научно-техническим прогрессом, появляется всё больше экстремальных воздействий (радиация, электромагнитные и лазерные излучения, невесомость, гипербарооксигенация и др.), к которым живые организмы не могли приспособиться в процессе эволюции (Холодов. 1975. 1992; Агаджанян, 1982, 1987; Ефуни, 1986; Сисабеков, ГІ389; Наточин и др., 1995; Серова. 1996). Во многих случаях неизвестны механизмы и клеточные мишени этих воздействий. Чтобы судить о патогенном воздействии факторов внешней среды на организм человека надо знать, как они действуют на клеточные органеллы. Необходимо также уметь отдифференцировать действие "новых" (непривычных) факторов от действия факторов внешней среды к которым организм в процессе эволюции приспособился (гипоксия, температура и др.). На примере реакции органелл клетки к действию возрастающего адекватного фактора можно выяснить предел устойчивости этих структур.
В' начальный период действия различных факторов нарушается внутриклеточное ионное осмотическое равновесие (Сотников, 1976; 1985). Поддержание гомеостаза при этом неизбежно вызывает потребление энергии, которое могло бы найти своё отражение в ультраструктурных-перестройках таких органелл. как митохондрии и пластиды. В этом плане изучение ультраструктурных изменений клеток при различных функциональных состояниях, вызванных действием факторов внешней среды, обретает особую актуаль-
- 4 -ность. Действительно, выявляя последовательно корреляции ыели: структурой и функцией отдельных органелл, возможно, в конечної счёте сложить истину» картину скрытых механизмов деструктивны: процессов, а также их купирования.
Однако, использование изменений ультраструктуры в качеств показателей функционального состояния затруднено в силу ряд обстоятельств. Так, многие авторы показывают разные изменени клеточных органелл в сходных тканях при сходных условиях (За московский и др., 1972; Коган и др., 1974, 1981; Казанский др., 1979; Меркулова и др., 1982; Авдеева и др., 1987). Автор ке всегда учитывали фазу ответной реакции клетки, в которс они фиксировались, а также природу и силу воздействующего ста мула.
Большинство работ представленных, как исследования і клеточном уровне организации выполнены при действии экстр* мальных факторов на организм. Неясно, что является в тага случаях повреждающим фактором - действие самого агента или їй рушение контролирующих механизмов более высоких уровней орп низации. Поэтому, актуальна проблема, связанная с выбором об' екта, позволяющего локально воздействовать на клетку, прич очень важно иметь возможность оценки её функционального сост яния.
Особенностью изучение структурных реакций клеток высок организованных животных, включая человека, является то, v в связи со сложной дифференциацией различных тканевых сист воздействующий агент способен влиять на клетку не только х посредственно, но и опосредовано, через систему нейро-гуь ральной регуляции. Поэтому, выявление связи между дєйстві
- Б -
«тора меняющего функциональное состояние клетки и первичной тенью его действия в некоторых случаях удобно проводить на ідеє простых объектах, так как реакция простейших и клеток >имитивных многоклето-яых организмов (растений) возникает в вет на непосредственное действие факторов внешней среды.
Выявление корреляций между структурой и функцией в такой юокодифференцированнои клетке, как нейрон, затруднено в силу >лифункциональности его отдельных органелл. В этом плане пер-іективно сопоставление данных о тонком строении нейрональных зганелл с данными полученными на объектах с более высокой гепенью их специализации. Такими являются, например, знерго-5разующие органеллы митохондрии и пластиды растений, которые злее автономны, чем митохондрии клеток животных организмов, в *лу своей особой генетической природы (Attardi et. al. , 1982; layton, 1982). Разработка вышеперечисленных вопросов является дуальной задачей не только для изучения клеточных механизмов зйствия экстремальных факторов внешней среды, но и для прог-эза процессов деструкции, а также для коррекции патологий, эзникающих при действии этих факторов.
Далью настоящей работы было исследование методами элект-
онной микроскопии, цитохимии и морфом'етрии модификации орга-
елл клеток животных и растительных организмов при адекватных
экстремальных вбздействиях. Это определило постановку слэду-
щих задач:
1. В плане изучения "эйствия адекватного фактора выяснить льтраструктурные изменения пирамидных нейронов и окружающей лии 5-го слоя коры мозга кошки в разные ф; зц естественного лкла бодрствования - сон с помощью специально разработанного
- б -
малотравматичного способа забора ткани мозга для электрс но-микроскопического исследования и обеспечивающего надёжн электрофизиологический контроль, исследуемых фаз.
-
Для изучения действия экстремального* фактора, исслег вать изменение ультраструктуры и цитохимических показател (изменение активности "маркерного" митохондриального фермен МАО) крупных пирамидных нейронов коры больших полушарий крь при гипероарооксии и холодовом воздействии.
-
Провести анализ ультраструктурной организации изолир ванного механорецепторного нейрона речного рака (МНРР) п адекватном раздражении:
а) вызванного действием механического стимула;
б) апликацией тормозным медиатором ГАЫК;
с регистрацией импульсов электрической активности, как марке его функционального состояния.
-
Изучить изменения ультраструктуры различных бон со МИРР при микрооблучении гелий-кадмиевым лазером с регистраци импульсной активности, как показателя его функционального со тояния.
-
Дэовести исследование ультраструктурнрй организан неточных органелл растительных объектов (листьев горчицы подсолнечника) при экстремальных воздействиях - водном дефии те и хлоридном засолении с целью сравнения с выявленными изм ненйямн ультраструктуры клеток животных при различных функци нальных состоиниях.
G. Разработать аппаратную базу и пакет оригинальных про рамм для автоматизированного анализа ультраструктурных изобр
КЄІІИЙ.
- 7 -Основные положен»! выносммые на защиту.
-
Действие адекватных и экстремальных факторов на клетку еывает структурную модификацию клеточных органелд энергети-ского и белкового метаболизма, а также цитоскелета
-
Действие непрерывного лазерного микрооОлучения характе-гауется фазной реакцией клетки, которая отражается в опре->лённой модификации энергообразуюших органелл, а также в им-гльсном электрическом ответе.
3. Отсутствие специализированных регулирующих систем в
ютениях, а также относительная автономия знергообразующих
іганелл (пластид) позволяет использовать их для выявления ми
шей прямого действий экстремального фактора на клетку.
Научная повязка и гаучго-праятнческоо значение результатов.
Выдвинута гипотеза об избирательном включении отдельных іганелл, которое носит вероятностный характер, в процессы іутриклеточного метаболизма и этим, очевидно, обеспечивает ідбжность и пластичность работы нейрона. Показано электронно-ікроскопическим и цитохимическим изучением клеток с различной епеньв специализации их структуры, что в основе вероятностно характера деятельности органелд лежит их способность к ідификашш своей ультраструктуры при переходе на новый уро-!нь функциональной активности. Выявлено, что при действии ікторов внешней среды основу такой модификации составляют подстройки двух типов: изменения внутреннего строения органелл первый тип, и их пространственное перераспределение в клетке второй тип. .
Впервые с применением ультраструктурных, цитохимических, а ікне компьютерно-морфометрических методик, исследованы нейро-
- 8 -ны мозга кошки в цикле бодрствование - сон с использование] специально разработанного устройства малотравматического забора ткани мозга. Получены данные об изменении внутреннего стро ения и пространственного распределения органелл крупных пира мидных нейронов коры в разные фазы сна. Эти результаты внося вклад в изучение роли ультраструктурных перестроек органел центрального нейрона при изменении функционального состояния вызванного естественным тормолоэниеы в процессе сна Кроме то го, они способствуют пониманию механизмов субклеточного мета болизма сна, что углубляет представление о его биологическс смысле, а также вносят вклад в решение проблем нейро-глиальнь отношений.
Впервые в результате сопоставления данных по изменеш "маркерного" митохондриального фермента ЫАО и ультраструктуї нейрона показан характер модификации клеточных органелл щ воздействии стрессовых факторов: гипероксии и гипотермии.
Впервые изучена динамика изменения ультраструктуры механі рецепторного нейрона речного рака (ЫНРР) при адекватном раз, ражений, действии тормозного медиатора ГАЫК с чётким фикс рованием уровня функционального состояния по показаниям элек рической импульсной активности.
Показано, что непрерывное лазерное микрооблучение характ ризуется фазной реакцией клетки, которая отражается в импуг сном электрическом ответе, а также в определённой модификаи знергообразугсдос органелл. -
Впервые для выявления мишеней прямого действия экстрема! ного фактора на клотку проведено сравнительное структурно-1 тохимическое исследование вьюокоднфференцировакиых клеток ;
- 9 -этных .и клеток растительных организмов, так как для последних арактерно отсутствие специализированных регуляторних клеточ-ах систем и органеллы обладают относительной автономностью. В целом, полученные в работе данные, вПосят вклад в знания пределах выносливости и характере модификаций клеточных ор-анелл при действии как адекватных, так и экстремальных фак-эров и позволяют выявить мишени их действия. Помимо теорети-зского, полученные данные имеют самостоятельное практическое яачение. Они могут быть использованы в качестве ультраструк-урных показателей функционального состояния при раннем диаг-эстировании некоторых патологий и коррекции их лечения в ме-ицине, а также для выявления признаков устойчивости к дейст-кю вредных факторов среды у исходных растительных форм при эздании .высокоэффективного .целенаправленного селекционного роцесса в сельском хозяйстве.
Научные результаты диссертации используются при чтении спец-урсов на биолого-почвенном факультете и ФПК "Биология" РГУ.
Апробация д&жертацнотэтго ютернала. Результаты нсследо-аяий были представленны на: Всесоюзном сьезде "Применение редств и методов лазерной техники в биологии и медицине", 381 (Киев); 1 Всесоюзном сешшаре "Ультраструктура нейронов и эрмакологические воздействия", 1981 (Путино на Оке); 1 Между-ародном симпозиуме "Нейробиология цикла бодрствование-сон". В86 (Тбилиси); 5 сьезде ВОГИС, 1987 (Москва) 1987; Междуна-одНой конференции "Персгктивные иформашюнные технологии в нализе изображений", 1992 (Ташкент); Международной конферен-ии "Проблемы нейрокибернетики," 1992 (Ростов-на-Дону); 1 сь-зде ВОГИС, 1994 (Волгоград); международной конференции "Проб-
леми нейрокибернетики",. 1995 (Ростов-на-Дону); 4 Word congres on addaption medicine, India, 1995.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 16 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзор литературы, описания материалов и методов исследований, че тырёх глав с изложением результатов собственных исследования заключения, выводов и библиографического указателя. Работа ид лхктрирова.а 56 рисунками и 12 таблицами.
Материалы и методы исследования Экспериментальные исследования проведены на животных: кои ках, лабораторных крысах, речных раках и на некоторых высшн растениях (масличных): подсолнечнике (линия 8629) и горчии сарептской (Донская - 5).
1.1. Эксперименты по ультраструктурному и авторадиографиче< кому исследованию нейронов коры мозга конки. Использовано і животных обоего пола весом 1,5-2 кг. в одно и то же время cj ток (19 час). Разработан способ, защищенный авторским свиде тельством (йедоренко и др.; 1982). который позволяет в разш фазы цикла бодрствование - сон: медленноволновой фазы с} (MBK), парадоксальной фазы сна .(ШС), состояния бодрствоваш (ЕС), контролируемые показаниями элелектрокортикограммы, ок; лологрммы и миограммы, проводить малотравматическую биопсі подэлектродного участка коры мозга животного..
- Подготовку ткани для последующих ультраструктурных и аі торадиографических исследований проводили по специально paapj ботанной методике (Фельдман, йедоренко и др.; 1979). Биопсир ванные кусочки юзга делились на 2 Части: для электронно-ми; роскопичосюос исследований и для авторадиографии.
Цзи авторадиографическом исследовании ткань инкубировали Н-лейцином (фирма Amersham. уд. акт. 1мКи/мл), затем многок-1Тно промывали охлажденной инкубационной средой для удаления связанного %-лейцина и фиксировали смесью Бродского. Изго-)вляли парафиновые срезы толщиной 5 мкм. которые затем депа-іфинировали и покрывали фотоэмульсией типа М. Через 45 суток >епараты подвергали стандартной фотообработке, докрашивали ;ыатоксилином Караччи и подсчитывали число автографов в пяти )нах крупных пирамидных нейронов: у основания апикального и 5оих базальных дендритов. над ядром и областью отхождения ак-жа.
Дальнейшая подготовка объектов для электронномикроскопичес-зго исследования, включающая б себя этапы обезвоживания тка-і, пропитку её заливочными смолами типа эпон 812 и аралдит. энтрастирования в спиртовом растворе солями тяжелых металлов фанилацетатом), полимеризации эпоново-аралдитовых блоков, в эторых была заключена исследуемая ткань, проводилась общепри-ітьіми методическими приёмами (Гайэр, 1981). Крупные пирамид-je нейроны 5-го слоя идентифицировали на полутонких срезах, крашенных метиленовой синью, под светооптическич контролем, пьтратонкие срезы этих клеток готовили на ультрамикротоме BS 30 A (Tesla), дополнительно контрастировали в солях тьжёлых эталлов и фотографировали в электронных микроскопах ПЭМ-100 ХСР), Phillips (Голландия).
, 2 Исследоваита ультраструктури и активности иоіюамююксидазм 'МО) коры мозга крыс при гкпвроксии и холодово» воздейст-!«. Объектом исследования служили около 150 взрослых белых рыс обоего пола массой 150-280Г. Первую серию животных поме-
- 12 -пали в холодную камеру при 2С на і. 3 и 45 суток. На 3-й сут ки наиболее выражена стрессовая реакция. К 45-м суткам наст> пала адаптация к холоду (Горопшнская и др., 1981). Контроле служили крысы, взятые из этой же группы и .содержащиеся такс же время в условиях вивария при температуре 20-22 С. ОС группы крыс получали одинаковый рацион. Опыты проводили в зиі ний период (январь - март).
Другую серию животных подвергали действию гипербарооксшч нации: использовали три режима гипероксии: 0,2Ша Оц в течені 1 часа, 0,3 МПа 0а в течении 2 ч. и 0,7 МПа до наступления с: дорог (в среднем 30 мин.). Заданные условия гипероксии созд вали в специальной барокамере, снабженной щелочным поглотит лем углекислоты при постоянное, режиме компрессии и декомпре сии 0,2 МПа в 1 мин. В обеих зксперементальных серигтх и в ко трольной группе животных декапитировали в одно и то же вре суток (9-10 часов утра), и всю дальнейшую обработку ткани мс га проводили на холоду.
Митохондрии выделяли методом дифференциального центров гирования (москвитина, 1977). Активность маркерного митохо* риального фермента (МАО) определяли в митохондриальной фращ и супернатанте, содержащем микросомы, лизосомы и растворю компонента О дезаминировании серотонина и глюкоаамина суді по образованию аммиака после инкубации суспензий митохонд] или супернатанта с одним из субстратов. Серотонинкреатинсу. фат использовали в конечной концентрации 2,5 мМ, глюка мин-гидрохлорид -10 мМ. Инкубацию проводили в воздушной ср при 37,5." С и рН 7,45 в течение 30 мин. (Горкин и др., 196 Содержание аммиака определяли спектрофлуориметрическим мето
- 13 -іа флуориметре "Hitachi 650-60" (Sugawara К. , Oyama F.J. ,1981) юсле изотермической отгонки (Seligson D. a. al. ,1951). При зодготовке материала к ультраструктурному^исследованию использовали методические пргемы, описанные в п. 1.1.
1.3. Злектрошіо-мжроскопкческое и злеісгро$шиологнчесігое ^следование мехашрецзпторного нейрона речного рака. Исследование проведено на 50 половозрелых раках преимущественно в летне-осенний период. Для эксперимента использовали изолированные сенсорные нейроны медленкоадаптирующегося рецептора растяжения речного рака (МБРР), способные при неизменном адекватном растяжении рецепторной мышцы длительное время генерировать потенциалы действия (ПД) с постоянной частотой. Выделение рецепторного органа, дозированное растяжение мышцы осуществлялось с использованием приёмов и устройств, специально разработанных для этой цели в нашей лаборатории (Загускин, 1965, Коган и др., 1974).
Электрофизиологический контроль функционального состояния осуществлялся путём униполярного отведения электрических потенциалов аксона нейрона с , помощью серебряных электродов и последующей регистрацией на усилителе биопотенциалов (УБП-2). Один из двух симметричных нейронов приводили в состояния покоя (отсутствие импульсной активности) - контроль, другой соответственно - в состояние слабого возбуждения (5-бгц.) и после выдерживания в физиологическом растворе (Harreveld. 1936) в течение 10 и 120 минут поме али в фиксирующую смесь. Торможение импульсной активности достигалось перфузией, растворенной в физрастворе ГАМК в концентрации 2,5x10'/. М в течение 10 и 120 минут.
- 14 -В опытах с лазерным воздействием использовалось излучен» гелий-кадмиевого лазера ЛГ-70 с длиной волны 441,6 нм. В мс мент, соответствующий изучаемой стадии импульсной реакции неї рона на лазерное микрооОлучение, осуществлялась его фиксавд для исследования в электронном микроскопе. Последующая обре Сотка ткани рецептора проводилась по ранее разработанной схе ме, как в п. 1.1.
1.4. ^следование ультраструктури энергопродуцируюцих о] ганелл клеток растений. Обьектом исследования служили листі высших растений (масличных) - подсолнечника и горчица Ді изучения влияния водного дефицита растения выращивали в экс периментальных условиях (Белецкий и др. ,1988). Почвень^ю засэ ху создавали путём прекращения полива и доведения влажности ; 30 от поливной влагоёмкости (60%) в условную фазу развит! 5-6 пары листьев. Заданный режим влажности поддерживали дальнейшем' на постоянном уровне путем полива сосудов по веез Фиксацию материала осуществляли спустя неделю и две неде: после заданного режима влажнбети.
При изучении действия засоления, в качестве критерия ее леустойчивоети использована всхожесть семян на фоне хлоридної засоления. Опыты проводили по методике, разработанной в нанк лаборатории Белецким КХ Д. с сотрудниками (Белецкий и др. 1S90).' Изучали сортовую популяцию Донская-5. Всхожесть опред< ляли на'вторые сутки, режим засоления - 1% (Na СІ). Для улі траструктурного исследования клеток растений была применеї модификация метода глутаро-осмиевой фиксации (Лященко, Фед< ренко Г. М. , 1981). Содержание пигментов в клетках растений оі роделялось методом. Гавриленко (Гавриленко и др., 1975).
- 15 -морфометрическая обработка включала в сеия подсчет на ед.
-5 Z
лошади среза цитоплазмы 4x10 см. числа рибосом, митохондрий измерение площади митохондриальных профилей. На единицу пло-ади пластид подсчитывали число гран, тилакоидов етромы, плас-эглобул, число тилакоидов в гране. Для оценки параметров, ис-педуемых органелл, использовалась специально разработанная в элей лабораторій; диалоговая автоматизированная система обра-этки ультраструктурных изображений (Федоренко, 1992). Досто-грность численных различий в контроле и опыте определяли по ритерию Стьюдента (Бейли, 1973).