Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Метод контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений с использованием биосенсоров на основе углеродистых материалов Гумерова Гузель Ильдаровна

Метод контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений с использованием биосенсоров на основе углеродистых материалов
<
Метод контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений с использованием биосенсоров на основе углеродистых материалов Метод контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений с использованием биосенсоров на основе углеродистых материалов Метод контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений с использованием биосенсоров на основе углеродистых материалов Метод контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений с использованием биосенсоров на основе углеродистых материалов Метод контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений с использованием биосенсоров на основе углеродистых материалов Метод контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений с использованием биосенсоров на основе углеродистых материалов Метод контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений с использованием биосенсоров на основе углеродистых материалов Метод контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений с использованием биосенсоров на основе углеродистых материалов Метод контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений с использованием биосенсоров на основе углеродистых материалов Метод контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений с использованием биосенсоров на основе углеродистых материалов Метод контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений с использованием биосенсоров на основе углеродистых материалов Метод контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений с использованием биосенсоров на основе углеродистых материалов
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Гумерова Гузель Ильдаровна. Метод контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений с использованием биосенсоров на основе углеродистых материалов: диссертация ... кандидата технических наук: 05.11.13 / Гумерова Гузель Ильдаровна;[Место защиты: Казанский государственный энергетический университет].- Казань, 2014.- 144 с.

Содержание к диссертации

Введение

1 Методы контроля диоксиноподобных ксенобиотиков 10

1.1 Гибридные методы определения диоксинов 14

1.2 Фотометрический метод определения диоксинов 21

1.3 Иммуноферментные и биологические методы анализа 21

2 Разработка биосенсора для определения полигалогенированных дибензо-п-диоксинов и родственных им соединений . 27

2.1 Обоснование выбора изоформы цитохрома Р4501А1 как биорецептора ПХДД/ПХДФ

2.2 Обоснование выбора материала электрода как основы биосенсора 35

2.3 Выбор способа модифицирования электрода полимерными материалами . 48

2.4 Выбор способа иммобилизации фермента для включения в состав стеклоуглеродного электрода 53

2.4.1 Способ иммобилизации путем смешивания раствора мономера с ферментом 57

2.4.2 Способ иммобилизации фермента на водонерастворимых твердых носителях механическим перемешиванием 58

2.4.3 Способ иммобилизации путем обработки органического носителя водным раствором фермента 59

2.4.4 Иммобилизация фермента путем включения его в структуру полимера 60

2.4.5 Способ фиксации фермента на материале – носителе посредством глутарового альдегида 61

2.4.6 Способ иммобилизации изоформы фермента цитохрома Р4501А1 вакуумированием в парах глутарового альдегида 62

3 Экспериментальная часть 68

3.1 Экспериментальное определение токсичности модельного раствора фенола и раствора, содержащего диоксины 69

3.2 Усовершенствование методики определения фенола вольтамперометрическим методом . 73

3.3 Использование разработанного биосенсора для определения диоксинов 79

4 Разработка виртуального вольтамперометрического анализатора 86

4.1 Описание платы Advantech- 1710L . 95

4.2 Виртуально-ориентированная среда графического программирования LabVIEW 99

4.3 Структура разрабатываемого вольтамперометрического анализатора . 105

4.4 Оценка погрешностей экспериментального определения содержания диоксиноподобных соединений на усовершенствованном вольтамперметре 117

Выводы 123

Список сокращений и условных обозначений . 125

Список использованной литературы

Введение к работе

Актуальность работы. Полигалогенированные дибензо-n-диоксины (ПХДД) и родственные им соединения (полихлорированные дибензофураны (ПХДФ), полиароматические углеводороды (ПАУ)) – одни из самых опасных ксенобиотиков: обладая мутагенными и канцерогенными свойствами, они становятся причиной изменений функционирования и существования экологических систем. В связи с этим необходим постоянный контроль содержания подобных соединений в природной среде.

В основе количественного контроля ПХДД/ПХДФ и ПАУ лежат гибридные методы физико-химического анализа – сочетание хроматографии и масс-спектрометрии. Такое сочетание обеспечивает высокую чувствительность, является способом подтверждения идентичности соединений, но имеет ряд ограничений для целей массового анализа: низкую производительность, невозможность определения некоторых диоксиноподобных соединений, высокую стоимость анализа, зависимость пробоподготовки от происхождения проб объектов природной среды, их компонентного состава и параметров оборудования. Кроме того, среди проблем контроля объектов природной среды есть такие, решить которые затруднительно даже с помощью вышеуказанных методов: аварийные поступления загрязнений от предприятий, арбитражная практика, когда подтвердить аналитическую информации, полученную методами ГХ/МС или ВЭЖХ/МС, необходимо результатами, полученными совершенно иным методом контроля (электрохимическим, биохимическим и пр.).

В этой связи разработка ферментных методов определения полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений является актуальной.

Настоящая работа посвящена усовершенствованию метода качественного и количественного определения ПХДД/ПХДФ. Автором предложен биохимический метод, который может комбинироваться с методами ГХ/МС или ВЭЖХ/МС, либо использоваться для экспресс-анализа. Он основан на каталитических свойствах монооксигеназных ферментных систем цитохромов Р450. В его основе лежит биохимическая реакция, в ходе которой ПХДД/ПХДФ разрушаются под действием закрепленной на электрохимическом модифицированном нафионом стеклоуглеродном датчике изоформы фермента цитохрома Р4501А1. В процессе каталитической деградации диоксинов (ПХДД) образуется фенол, концентрация которого измеряется методом инверсионной вольтамперометрии и прямо пропорциональна концентрации диоксинов в исходной смеси. Предложенный метод не требует сложной пробоподготовки и дает возможность во много раз упростить и удешевить контроль диоксинов в объектах природной среды.

Объектом исследования является усовершенствование метода и аппаратных средств контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений в природной среде.

Предметом исследования является методическое обеспечение и приборная реализация метода биохимического контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений.

Цель работы: разработка и реализация метода контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений с использованием биосенсоров на основе углеродистых материалов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

– изучить токсические свойства полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений, механизм их образования и трансформации в объектах природной среды и методы аналитического контроля;

– подобрать фермент, участвующий в процессе биохимического разложения полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений в объектах природной среды;

– обосновать выбор материала для изготовления биосенсора;

– разработать способ иммобилизации (закрепления) фермента на поверхности биосенсора;

– усовершенствовать метод электрохимического измерения массовых концентраций фенола;

– обосновать метод определения диоксинов в объектах природной среды путем их биохимического разложения до фенолов;

– усовершенствовать систему обработки сигналов биосенсора посредством виртуально– ориентированной среды (виртуального вольтамперометрического анализатора).

Методы исследования. Исследование базируется на электро– и биохимических методах контроля объектов природной среды, методах биотестирования, методах планирования эксперимента, методах графического программирования, методах математической статистики.

Новые научные результаты.

  1. Получены модельные растворы полигалогенированных дибензо-n-диоксинов на основе механизма образования их из прекурсоров и трансформации данных соединений в объектах природной среды.

  2. Выбран фермент применительно к условиям изготовления биосенсора для контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов.

  3. Разработан способ иммобилизации цитохрома Р450 на стеклоуглеродном электроде.

  4. Усовершенствована методика измерения концентраций фенола методом инверсионной вольтамперометрии.

  5. Создана система обработки сигналов биосенсора с иммобилизованным цитохромом Р450 посредством виртуального вольтамперометрического анализатора.

Практическую значимость работы составляют:

  1. Разработанный биосенсор позволяет количественно определить полигалогенированные дибензо-n-диоксины на основании концентрации фенола, образующегося в ходе их ферментативной деградации.

  2. Результаты исследований способов иммобилизации ферментов позволили предложить способ закрепления цитохрома Р450 на модифицированной нафионом поверхности стеклоуглеродного электрода.

  3. Усовершенствована методика вольтамперометрического измерения концентраций фенола, что привело к более точным и воспроизводимым результатам.

4. Создание системы сбора и управления данными электрохимической ячейки в виртуально-графической среде LabVIEW позволяет уменьшить предел определяемых концентраций и дает возможность проводить экспресс – анализы в составе передвижной лаборатории.

На защиту выносятся следующие положения:

  1. Для комбинированного или предварительного экспресс-контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений в объектах природной среды предложено использование биосенсора, предполагающего сочетание физико-химического датчика (сенсора) и биообъекта (фермента).

  2. Обоснован выбор фермента и материала электрода применительно к условиям изготовления биосенсора для контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов.

  3. Разработан способ иммобилизации цитохрома Р450 на стеклоуглеродном электроде, модифицированном ионообменным полимером нафионом.

  4. Предложено усовершенствование вольтамперометрической методики измерения концентраций фенола путем изменения процедуры электрохимических измерений.

  5. Предложена система обработки сигналов биосенсора с иммобили– зованным цитохромом Р450 посредством виртуального вольтамперо– метрического анализатора, обеспечивающая высокую скорость передачи, регистрации и обработки данных электрохимической ячейки с программным вычитанием фонового тока.

Достоверность полученных результатов и обоснованность выводов диссертационной работы обеспечивается совпадением полученных в работе результатов с результатами известных теоретических и численно-модельных исследований других авторов, а также совпадением найденных результатов с известными из литературы данными по влиянию изоформы цитохрома Р4501А1 на полигалогенированные дибензо-n-диоксины и родственные им соединения и подтверждением теории экспериментом. Достоверность также подтверждается использованием апробированных математических методов и оценок, использованных при проведении эксперимента, обработке и анализе регистрируемых данных.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на следующих международных научных конференциях: XVI – XX «Туполевские чтения», 2008 – 2012, КНИТУ-КАИ, Казань; VII Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2009», МарГУ, Йошкар-Ола, 2009; Международный научно-технический конгресс «Экология и безопасность жизнедеятельности промышленно-транспортных комплексов» ELPIT-2009, ТГУ, Тольятти, 2009; I Международная научно-практическая конференция «Экологическая безопасность и устойчивое развитие территорий», Чебоксары, 2011; III Международный экологический конгресс (V Международная научно-техническая конференция, научный симпозиум «Экологический мониторинг промышленно-транспортных комплексов») «ELPIT 2011. Экология и опасность жизнедеятельности промышленно-транспортных комплексов» ТГУ, Тольятти, 2011; II Международная заочная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы науки», Тамбов, 2011.

Реализация результатов работы.

Результаты исследований по созданию биосенсоров используются при выполнении лабораторных работ по курсу «Методы и приборы контроля окружающей среды», исследования по механизмам биотрансформации и токсического действия ксенобиотиков на живые организмы используются при чтении курса «Экологическая химия», принципы конструирования измерительных приборов на базе виртуально-ориентированной среды графического программирования используются в курсе «Разработка и проектирование приборов и техники контроля объектов окружающей среды» основной образовательной программы подготовки бакалавров и магистров техники и технологии направления 280700 «Техносферная безопасность» на кафедре «Общей химии и экологии» КНИТУ-КАИ им. А.Н. Туполева, о чем имеются соответствующие акты.

Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 12 научных публикациях, включая 3 статьи в ведущих научных изданиях, входящих в перечень ВАК, 8 материалов докладов международных конференций, 1 материал доклада на всероссийской конференции.

Личный вклад автора. Результаты, представленные в диссертации и публикациях, получены при непосредственном участии автора работы. Автором лично осуществлены анализ литературных источников, выбор объектов исследования с учетом их специфики, проведение экспериментальных исследований, разработка основных блоков усовершенствуемого вольтамперметра, интерпретация и анализ полученных результатов.

Соответствие диссертации научной специальности.

Диссертация соответствует специальности 05.11.13 – Приборы и методы контроля природной среды, веществ, материалов и изделий.

Разработка биосенсора для количественного определения диоксинов и способа иммобилизации изоформы фермента цитохрома Р4501А1 соответствует п. 1 «Научное обоснование новых и усовершенствование существующих методов аналитического и неразрушающего контроля природной среды, веществ, материалов и изделий» и п. 4. «Разработка методического, технического, приборного и информационного обеспечения для локальных, региональных и глобальных систем экологического мониторинга природных и техногенных объектов» Паспорта специальности.

Разработка системы обработки сигнала биосенсора с иммобилизованным цитохромом Р4501А1 посредством виртуального вольтамперометрического анализатора, созданного в среде графического программирования, соответствует п. 6 «Разработка алгоритмического и программно-технического обеспечения процессов обработки информативных сигналов и представление результатов в приборах и средствах контроля, автоматизация приборов контроля» Паспорта специальности.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и списка использованных источников, включающего 165 наименований. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, включая 43 рисунка и 22 таблицы.

Фотометрический метод определения диоксинов

Вещества, содержащиеся в окружающей среде, но не входящие в биотический круговорот (чуждые живым организмам) называют «ксенобиотиками». Эти химические вещества, содержащиеся в объектах окружающей среды, можно рассматривать как источники формирования ксенобиотического профиля экосистемы [1], оказывающего токсическое действие на живые организмы, в связи с чем возникает необходимость его качественного и количественного экологического контроля [2]. Наиболее опасные ксенобиотики называют приоритетными, к их числу относят диоксины [3].

Диоксины или диоксиноподобные соединения – собирательный термин для галогенированных шестичленных ароматических углеводородов, содержащих в своем составе два атома кислорода. Наибольшую опасность из этого класса соединений представляют полихлорированные дибензо-п-диоксины (ПХДД), такие как 2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксин, полихлорированные дибензофураны (ПХДФ) и полихлорированные бифенилы (ПХБ) (рисунок 1.1.) [4]. Диоксины относятся к стойким органическим загрязнителям благодаря их канцерогенности, мутагенности, длительному периоду полураспада, способностью к биоаккумуляции из-за липофильности (или гидрофобных свойств) и трансграничному переносу [5].

В гомологический ряд полихлордибензо-n-диоксина входят 75 соединений, а полихлордибензофурана – 135. Кроме того, существуют 75 различных конгенеров бромпроизводных дибензо-п-диоксинов и 135 конгенеров бромпроизводных дибензофуранов. Только 7 из 75 конгенеров хлор- и бромпроизводных обладают диоксиноподобной активностью, т.е. особо токсичны для окружающей среды. Из 135 возможных конгенеров хлор- и бромпроизводных дибензофуранов только 10 имеют сходную активность. А из 209 конгенеров ПХБ 13 обладают диоксиноподобной токсичностью [6].

Все соединения диоксинового ряда характеризуются высокой температурой плавления ( 800 С), низкой растворимостью в воде (0,2 мкг/л) и хорошей растворимостью в неполярных растворителях, устойчивостью к агрессивным средам и окислителям в отсутствии катализаторов, высокой способностью к адгезии к любым поверхностям. Как следствие, накопление или адсорбция этих веществ происходит в донных отложениях, взвешенных твердых частицах, золе, саже и жировых тканях организма, тогда как в водных средах в значительных количествах они не обнаруживаются. Эти свойства важны для прогнозирования образования диоксинов в ряде производственных процессов, а так же для определения методов анализа и очистки [7].

Диоксины присутствуют в природной среде в виде сложных смесей, каждый из компонентов которых имеет разную токсичность, в связи с чем в пробах реальных объектов природной среды сложно определить их общую токсичность и оценить экологическую опасность смеси.

Согласно стандартам ВОЗ токсичность каждого соединения ряда диоксинов определяется фактором токсической эквивалентности (ФТЭ) по отношению к наиболее токсичной форме (2,3,7,8-ТХДД) и называется диоксиновым эквивалентом (ДЭ) размерностью нг/кг [8], который рассчитывается сложением сумм факторов токсической эквивалентности (ФТЭ) (таблица 1.1.), умноженных на концентрацию того или иного диоксиноподобного соединения, определяемую аналитически (формула (1.1.)).

Научной основой методов аналитического контроля качества объектов природной среды является механизм поступления и трансформации в них ксенобиотиков. Диоксины являются побочными продуктами производственных процессов (пиролиза, отбеливания целлюлозы и пр.) химической, нефтехимической и металлургической промышленностей, образуются при горении полимеров (бытовых и медицинских отходов, древесины). Рассеивание в атмосфере способствует трансграничному переносу диоксинов, поэтому их распространение в природной среде носит глобальный характер: диоксины обнаруживаются во всем мире в пробах почв, донных отложений, продуктах питания, воды и воздуха [9]. Воздействие диоксинов и фуранов опасно для живого организма: единовременное поступление в организм человека более 10-12 г диоксинов может привести к патологическим изменениям кожи, таким как хлоракне, очаговое потемнение кожи и нарушение функции печени. Длительное воздействие малых доз (менее 10-12 г/кг) приводит к поражениям иммунной, нервной, эндокринной систем, репродуктивных функций и развитию нескольких типов рака [10]. Фоновое воздействие диоксинов, попадающих в природную среду естественным путем (например, с лесными пожарами и извержениями вулканов) не влияет на здоровье человека [11]. Из-за высокой канцерогенности и мутагенности этого класса соединений, должны быть предприняты меры для снижения антропогенного вклада в фоновый уровень диоксинов и регулярного контроля их содержания в природной среде.

Пищевая цепь является основным путём поступления диоксинов в живые организмы. Многие страны (ЕС, США, Япония, Россия и др.) контролируют пищевые продукты на наличие диоксиноподобных токсикантов. В ряде стран приняты допустимые суточные дозы диоксиноподобных соединений, которые выражаются в пг на кг массы тела (ДСД): в Нидерландах – 4 пг/кг, Германии – 1 пг/кг, Канаде – 10 пг/кг, Дании – 5 пг/кг, в Скандинавских странах – 5 пг/кг, рекомендация ВОЗ – 10 пг/кг, в Японии – 100 пг/кг [12]. Исходя из этого были разработаны максимально допустимые уровни (МДУ) содержания диоксинов в продуктах питания. По данным агентства по охране окружающей среды США суточное поступление диоксинов составляет 1 пг на кг массы тела взрослого человека. Допустимая суточная доза диоксинов в России установлена на уровне 10 пг/кг массы тела человека. Уровни допустимого содержания диоксинов (в пересчете на 2,3,7,8-ТХДД) в питьевой воде, грунтовых водах, поверхностных водах в местах водозабора – 20 пг/л (№142-9/105 от 05.06.1991г., утв. МЗ СССР). Этим же документом установлены уровни допустимого содержания диоксина (в пересчете на 2,3,7,8-ТХДД) для следующих основных групп продуктов: молоко и молочные продукты (в пересчете на жир) – 5,2 нг/кг; рыба и рыбопродукты (съедобная часть) – 11,0 нг/кг; в пересчете на жир – 88,0 нг/кг; мясо и мясопродукты – мясо (съедобная часть) – 0,900 нг/кг в пересчете на жир – 3,3 нг/кг. Эти нормы уже устарели, так как диоксиноподобные соединения опасны и в меньших дозах.

Обоснование выбора материала электрода как основы биосенсора

Методы контроля содержания диоксинов в природной среде, использующие биосенсоры, могут быть перспективными для наблюдения за ксенобиотическими профилями экосистем в режиме реального времени. Биосенсоры могут быть использованы для определения диоксинов и ПХБ во всей пищевой цепи, включающей разные образцы, таких как вода, воздух, почва, корма, ткани животных и конечные продукты. Биосенсоры способны отражать не только количественные характеристики компонентов пробы, но и биотоксичность диоксинов и ПХБ, что дает возможность получения адекватной оценки их воздействия на живые системы, однако чувствительность у них ниже по сравнению с гибридными методами.

К преимуществам биосенсоров, помимо вышеперечисленного, относят также минимальное количество отходов производства, низкую стоимость энергии, миниатюрность, минимум использования химических реагентов, отсутствие потребности в выделенной лаборатории и сложном оборудовании, возможность проведения измерений в режиме реального времени «на месте» и объединения анализов с использованием технологии мультиплексирования [33, 34]. С точки зрения избирательности и точности биологические методы сравнимы с гибридными [35, 36].

Упоминание о применении физических сенсоров для обнаружения диоксинов и ПХБ в литературе встречается редко. Успешно используются одностенные углеродные нанотрубки для скринингового анализа на наличие диоксиноподобных соединений в пробе [37]. Преимущества физических датчиков – высокая чувствительность и специфичность. К недостаткам можно отнести то, что они не показывают уровень биологической токсичности и все еще находятся в стадии разработки.

Иммуносенсоры или биосенсоры на основе антител очень разнообразны [38]. Успешно были проведены использования иммуносенсоров для обнаружения полихлорированных бифенилов производных ТХДД с достаточно низким пределом обнаружения – 1 ppt – в образцах пищевых продуктов [39]. Однако, установлено, что при применение для анализа реальных проб, антитела иммуносенсоров могут связываться с другими, кроме ПХБ, химическими соединениями или загрязняющими веществами, давая погрешность [40, 41], кроме того, процедура длительной пробоподготовки играет ключевую роль в корректности полученных данных.

Целые клетки или ткани могут быть также использованы в качестве чувствительного элемента биосенсоров [42]. Существует метод анализа на базе биотестеров CALUX, который заключается в использовании линии рекомбинантных клеток со встроенным геном люциферазы светлячка [43, 44]. При наличии диоксиноподобных соединений культура клеток начинает люминесцировать. В таких рекомбинантных клетках имеется последовательность ДНК, называемая DRE (dioxin-responsive element). DRE служит связывающим участком для активирующегося диоксиноподбными соединениями углеводородного рецептора, который, в свою очередь, является медиатором токсических эффектов диоксинов. Таким образом, культура клеток, подверженная действию субстратов Ah-рецептора, способствует его активации, что далее приводит к экспрессии гена люциферазы через DRE. Люцифераза является источником люминесценции, которая и фиксируется детектором. По способности увеличивать подвижность гена люциферазы, входящего в состав AhR, определяется индекс общего эквивалента токсичности диоксиноподобных соединений. Этот метод позволяет оценить общий токсический эквивалент смеси, но не определяет концентрации отдельных компонентов, то есть, является полуколичественным. Как и для других методов, отбор проб и очистка образцов является важным и трудоемким этапом CALUX анализа. CALUX может служить дополнением к основным методам определения соединений диоксинового ряда [45] и позволяет проводить контроль объектов окружающей среды с производительностью анализа около сотни проб в неделю [46].

Для обнаружения загрязнения ПХБ в экстрактах образцов почв разработан биосенсор на основе целых клеток [47]. Авторы использовали Pseudomonas Sp. P2 в качестве биораспознающего элемента, закрепленного на оптическом датчике. Этот датчик может обнаружить ПХБ в экстрактах образцов почвы. В неэкстрагированной пробе почвы авторам не удалось обнаружить загрязнение. Таким образом, клеточные биосенсоры в сочетании с методами экстракции могут быть использованы в качестве скрининг-теста (ответ «есть/нет» искомое вещество в экстракте). Преимуществами данного метода – получения качественного отклика биосенсора на присутствие ПХДД/ПХДФ в экстрактах почв и донных отложений – являются его простота изготовления и методы измерения, которые позволяют использовать недорогое оборудование. К недостаткам можно отнести низкий предел обнаружения и сопутствующее определение других метаболитов, которые могут препятствовать точности измерений.

Инуямой с соавторами [48] разработан способ определения диоксинов посредством применения искусственного диоксин-связывающего белка в качестве детектора для обнаружения загрязнения в образцах почвы. Концентрация диоксинов была рассчитана по измеренной интенсивности флуоресценции, которая уменьшалась при увеличении концентрации диоксинов. Был продемонстрирован предел обнаружения до 0,2 нг ТХДД/мл. Однако этот способ требует длительного отбора и очистки проб.

Hong с соавторами [49] использовал в качестве биологического элемента распознавания для обнаружения ПХБ в водных растворах цитохром С (Cyt С), содержащий искусственный металлопротеин, участвующий в процессе передачи электронов. Детектирование проводилось с использованием поверхностной плазменно-резонансной спектроскопии. Предел обнаружение этого метода 0,1 ppb (0,1 частей на миллиард), время реакции – не более 10 минут.

В методике EPA 4425 используется аналогичный CALUX системе принцип определения, основанный на индукции соединениями типа ПХДД/ПХДФ цитохромов семейства Р450. Методика ЕРА 4020 была разработана для иммуносенсорного определения планарных ПХБ в пробах окружающей природной среды. Специфичность данного подхода зависит от способности ксенобиотиков вызывать индукцию цитохромов семейства Р450, т.е. соединения должны обладать высоким сродством к арилуглеводородному рецептору [50].

Способ фиксации фермента на материале – носителе посредством глутарового альдегида

Чтобы избежать указанных проблем, нами была взята методика, разработанная [128], сочетающая приемы, использованные при изготовлении накладных мембран, и описанных для одноразовых биосенсоров на основе планарных электродов. Используя указанную методику иммобилизации, нами были проведены исследования, нацеленные на иммобилизацию ферментов на конструируемый биосенсор данным способом и подборку необходимых условий.

Данная методика была модифицирована под требуемые характеристики разрабатываемого датчика, такие как: иммобилизация фермента на объемные стеклоуглеродные электроды многоразового использования и использование в качестве ферментов изоформы цитохрома Р4501А1. Модифицированный способ состоит в том, что иммобилизация раствора фермента в буфере производится на химически модифицированную полимером поверхность электрода с закреплением фермента вакуумированием в парах 3% глутарового альдегида, что позволяет сохранить высокую ферментативную активность и снизить расход фермента. В качестве полимера использовалась перфторированная ионообменная мембрана нафион, разработанная компанией DuPont.

Иммобилизацию фермента на рабочей части биосенсора размером 10x3 мм проводили путем кросс-сшивки парами глутарового альдегида. Для этого на рабочую поверхность сначала наносили 2 мкл 0,5 - 0,05 % суспензии нафиона в этаноле, давали высохнуть при комнатной температуре в течение суток. На следующий день растворяли 0,9 мг исходного препарата фермента, 600 Е/мг, в 1 мл 0,002 М фосфатного буферного раствора, содержавшего 0,1 М Na2SO4 , рН 7,8, и наносили по 2 мкл полученного раствора на электрод. В результате расход фермента составлял менее 0,001 мг на каждый биосенсор, а активность фермента в расчете на каждый электрод 0,1 – 5,3 Е. Капле раствора давали подсохнуть до образования равномерной пленки. Затем электрод закрепляли в держателе на расстоянии 1 см над поверхностью 3 % раствора глутарового альдегида. Включали вакуумный насос и проводили иммобилизацию парами глутарового альдегида в течение 1 мин. После этого электрод подсушивали при комнатной температуре и далее отмывали избыток глутарового альдегида дистиллированной водой до полного исчезновения запаха. Электроды вымачивали в рабочем фосфатном буферном растворе и после высыхания заворачивали в алюминиевую фольгу. Изготовленные биосенсоры хранили в холодильнике при 4 оС.

На рисунках 2.14. и 2.15. представлены зависимости отклика биосенсора от условий нанесения нафионного покрытия – объема раствора полимера и его концентрации. Как видно, при увеличении толщины покровного слоя при увеличении объема раствора (рисунок 2.14.) либо его концентрации (рисунок 2.15.) на рабочей поверхности электрода происходит уменьшение отклика биосенсора на субстрат. Очевидно, это связано с диффузионным ограничением массопереноса продукта реакции, образующегося в ферментной пленке, к электроду. Оптимальное количество нафиона, не вызывающее изменений в токе окисления субстрата, но сохраняющее стабилизирующее действие на сенсор, соответствует 2 мкл 0,05 % раствора на электроде.

Возможно, нафион улучшает адгезию ферментного слоя на поверхности электрода из-за электростатического взаимодействия с положительно заряженными молекулами фермента. Кроме того, он составляет пассивный барьер, снижающий скорость вымывания графитовых частиц. Стабилизирующий эффект нафиона ранее был использован при конструировании глюкозного и лизинового биосенсоров [94].

При меньшей нагрузке нафиона либо при полном его отсутствии воспроизводимость результатов и время жизни биосенсора резко снижаются.

Одной из главных характеристик биосенсоров, модифицированных разработанным способом иммобилизации фермента является то что, следы анализируемых компонентов или каталитических продуктов могут быть непосредственно и моментально измерены, в то время как большинство иммунохимических методов представляют собой сложный многостадийный процесс.

Результативность работы биосенсора проверялась следующим образом: раствор фенола помещали в 2 ячейки, в одну из них добавляли хлорид железа (III), а в другую – индикатор на основе азотистых соединений. Хлорид железа в присутствии фенола дает сиреневую окраску раствора, при добавление же индикатора на основе азотистых соединений изменения окраски не наблюдается. Далее раствор фенола обрабатывался газообразным хлором в присутствии катализаторов (хлорида меди) и при облучении ультрафиолетом, что способствует трансформированию фенола в диоксиноподобные соединения. После чего раствор снова разливался по двум ячейкам и добавлялись вышеуказанные реагенты. В ячейке, куда был добавлен индикатор на основе азотистых соединений, раствор окрасился в желтый цвет, что подтверждает образование диоксинов. Введение хлорида железа не привело к изменению окраски, что свидетельствует о том, что фенол полностью прореагировал, образовав диоксины. Далее в ячейки помещались в темное место и в них опускались сконструированные ферментативные датчики при постоянном перемешивании растворов. Это делалось для того, чтобы исключить образование нежелательных соединений с хлором и удалить его из ячейки. После окончания ферментативной реакции в растворы снова добавляли оба индикатора. Оба раствора давали цветовую реакцию только с хлоридом железа. Это доказывает, что диоксины под действием ферментов, иммобилизованных на датчик, полность разложились с образованием фенола.

Усовершенствование методики определения фенола вольтамперометрическим методом

Соответственно в цикле происходит сложение значений снимаемого АЦП напряжения сум =сум + U. После этого находится среднее значение, которое передается в значение [i]= сум/100. Это значение передается на следующий этап для формирования массива чисел в виде y[i]= [i]. При этом значение [i] передается в массив x: x[i]= [i] . После этого «i» увеличивается на 1 и цикл повторяется. При этом напряжение на электроде растет до условия «i=a». После этого цикл заканчивается.

Таким образом, получаются массивы чисел x[a] и y[a], т.е. напряжения и величины, пропорциональной току, так как ИП снимает напряжение, пропорциональное току в цепи. Открывается файл, эти данные записываются в файл и изображаются на экране в виде графика, представляющего собой зависимость y[a] от x[a], т.е. вольтамперную зависимость. После этого цикл повторяется, но теперь переменная «i» уменьшается от «а» до 0, т.е. в этом случае напряжение на электроде падает, т.е. получается вольтамперная зависимость y1[a] от x1[a] на обратном ходе. Эти данные тоже изображаются на графике и записываются в файле. После чего, если нет необходимости повтора, файл закрывается, драйверы закрываются, программа останавливается. Подобного рода операции производятся как для фонового тока, так и для тока с анализируемым образцом. После проведения всех измерений соответствующие величины фонового тока вычитаются из тока с образцом. В результате получается вольтамперная зависимость окисления определяемого вещества.

Далее производилась отладка прибора на реальных пробах с использованием предлагаемого биосенсора в качестве индикаторного электрода. Ход эксперимента проводился аналогично описанному в главе 3.

В результате были получены вольтамперные пики, характеристики которых сравнивались с полученными ранее на существующем вольтамперометрическом комплексе СТА-1. Вольтамперная кривая, при наименьшем регистрируемом токе представлена на рисунке 4.13. Кривая имеет такой вид потому что, программа записывает в памяти оригинальный вид вольтамперной зависимости, а на экран выводится амплитуда полезного тока для удобства визуальной фиксации.

Параметры электрических сигналов можно изменять в широких пределах, добиваясь оптимальных значений для различного состава исследуемых растворов. Параметры могут задаваться в интерфейсной программе прибора перед каждым экспериментом.

Был проведен анализ сходимости результатов, полученных на усовершенствованном вольтамперметре и существующем вольтамперометрическом комплексе СТА-1 (рисунок 4.14). В качестве объекта исследования в данном эксперименте были взяты серия модельных проб диоксиноподобных соединений, приготовленных из их прекурсора – фенола (см. гл. 3).

Регистрируемые токи при проведении экспериментального определения диоксиноподобных соединений на вольтамперметре СТА-1 и усовершенствованном вольтамперметре.

Как видно из полученных данных сходимость результатов усовершенствованного вольтамперметра по сравнению с имеющимся СТА-1 достаточно хорошая. Недостаточно хорошая сходимость результатов каждого прибора в отдельности объясняется широким диапазоном показанных измерений и, следовательно, большим разбросом значений.

Т.о. применение современных технологий позволяет создать более современную компоновку вольтамперометрического анализатора с большим, чем у существующих приборов диапазоном определяемых концентраций, и дает возможность использовать его не только в лаборатории стационарно, но и для экспресс - анализов в составе передвижной лаборатории.

Оценка погрешностей экспериментального определения содержания диоксиноподобных соединений на усовершенствованном вольтамперметре Качество измерений характеризуется: точностью, достоверностью, правильностью, сходимостью и воспроизводимостью измерений. Точность измерительного прибора это - метрологическая характеристика прибора, определяемая погрешностью измерения, в пределах которой можно обеспечить использование данного прибора.

Класс точности средства измерений (ГОСТ 8.401-80) является обобщенной характеристикой средства измерений, определяемой пределами основных и дополнительных погрешностей, а также другими свойствами, влияющими на точность, значения которых устанавливаются в стандартах на отдельные виды средств измерения.

Класс точности характеризует свойства средства измерения, но не является показателем точности выполненных измерений, поскольку при определении погрешности измерения необходимо учитывать погрешности метода, настройки и др. Количественная оценка точности - обратная величина модуля относительной погрешности [165].

Поверкой средств измерений называют совокупность действий, выполняемых для определения и оценки погрешностей средств измерений. В основу классификации применяемых методов поверки положены следующие признаки, в соответствии с которыми средства измерения могут быть поверены: - без использования компаратора (прибора сравнения), т.е. непосредственным сличением поверяемого средства измерений с образцовым средством измерений того же вида; - сличением поверяемого средства измерений с образцовым средством измерений того же вида с помощью компаратора; 118 - прямым измерением поверяемым измерительным прибором величины, воспроизводимой образцовой мерой; - прямым измерением образцовым измерительным прибором величины, воспроизводимой подвергаемой поверке мерой; - косвенным измерением величины, воспроизводимой мерой или измеряемой прибором, подвергаемым поверке.

Завершающей стадией количественного определения фенола образовавшегося в результате ферментативного разложения диоксиноподобных соединений является сличение погрешностей результатов измерений (по ГОСТ Р ИСО 5725-2002 (ч. 1-6)), полученных на усовершенствованном вольтамперметре (поверяемый прибор) и существующем вольтамперометрическом комплексе СТА-1 (образцовый прибор). Количественное содержание фенола в модельных растворах устанавливали по пяти параллельным измерениям в одинаковых условиях. Далее вычислялось среднее арифметическое х (4.5) из n одинаковых измерений.

Похожие диссертации на Метод контроля полигалогенированных дибензо-n-диоксинов и родственных им соединений с использованием биосенсоров на основе углеродистых материалов