Введение к работе
Как известно, первичной электрической реакцией постсинаптической мембраны на медиатор в нервно-мышечном синапсе является генерация тока концевой пластинки СТКГО, представляющего собой суммацию токов, протекающих через отдельные ионные каналы холинорецептора [Anderson, Stevens, 1973]. Анализ амплитудно-временных характеристик ТКП позволяет получить информацию о кинетике взаимодействия АХ с холинорецептором и других факторах, определяющих процесс генерации синаптических сигналов [Anderson, Stevens, 1973, Katz, Miledi, 1973, Магазаник и др., 1984]. Однако подавляющее большинство работ, посвященных постсинаптическому электрогенезу, базируется на анализе ТКП, возникающих на секрецию одного (миниатюрный ТКП) или нескольких квантов АХ. Нормальный же акт синаптической передачи основан на появлении в синаптической щели нескольких сот квантов АХ [Katz, Miledi, 1979]. Анализ амплитудно-временных характеристик таких "физиологических" ТКП представляет особый интерес в связи с тем, что в ходе генерации многоквантового ТКП могут возникать процессы, качественно отличающиеся от тех, которые имеют место при генерации низкоквантовых ТКП. Одно из отличий заключается в том, что одновременная секреция множества квантов АХ может приводить к увеличению концентрации эндогенного АХ. Такая возможность ярко проявляется в синапсе с ингибированной АХЭ [Hartzell et al. , 1975], но не исключена и при активной АХЭ. Вместе с тем многочисленные данные, полученные в последнее время при регистрации токов одиночных каналов, свидетельствуют о целом ряде концентрационно-зависимых эффектов экзогенного АХ на кинетику холинорецептора, таких как залповая кинетика ионных каналов в присутствии десенситизирующих концентраций АХ [Sakmann et al. , 1980], изменение времени жизни каналов.tLabarca et al., 1985], блокада ионных каналов самим АХ [Sine, Steinbach, 1984, Ogden, Colquhoun, 1985]. Физиологическая значимость этих эффектов, то
- г -
есть их реализация за счет эндогенного АХ, еще не определена.
Другой, остающийся нераскрытым вопрос касается временного ходг секреции квантов медиатора при генерации одиночного многоквантовогс ТКП. Имеющиеся оценки степени синхронности секреторного процессе базируются на данных, полученных при уменьшении нормального квантового состава ТКП в 50-100 раз [Katz, Miledi, 1965, Barrett, Stevens, 19723. По мнению Katz и Miledi C1979D, при массированном выделении квантов А> асинхронность секреции может быть ведущим фактором, определяющик длительность постсинаптического тока. Актуальность вопроса о вкладе кинетики секреции квантов АХ во временной ход многоквантовых ТКГ связана и с возможными изменениями степени синхронности во врем* активности синапса.
Ритмическая активность является естественным режимок функционирования нервно-мышечного синапса. Реакции, возникающие в ходе ритмической активности, в виде увеличения или снижения амплитуды ТКП, так называемые формы кратковременной пластичности, связывались ранее только с пресинаптическими процессами [Katz, 1966, Zucker, 1989]. Однако можно предполагать, что при высоком квантовом составе ТКП, когда велика вероятность повторной активации одних и тех же участков постсинаптической мембраны, возможны изменения чувствительности этой мембраны к медиатору в результате развития постсинаптической потенциации СПСП) или десенситизации, как это описано для действия экзогенного АХ СKatz, Thesleff, 1957, Feltz, Trautmann, 1980]. He физиологическая роль как ПСП, так и десенситизации остается предметоіу дискуссий.
Кроме того, совершенно не изученным является вопрос с долговременных эффектах десенситизации на функцию нервно-мышечногс синапса, хотя имеются данные о том, что десенситизированные холинорецепторы являются нормальным, компонентом постсинаптической мембраны [Cohen, Strnad, 1987]. Не исключено, что их наличие связано с АХ, выделяемым в неквантовой форме [Katz, Miledi, 1977]. Существует также представление, что эффективную регуляцию процесса десенситизации, а возможно и ПСП, в естественных условиях могут выполнять регуляторные пептиды [Rehav et al. , 1987, Mullе et al. , 1983]. Решение этих вопросов также требует специальных исследований.
Таким образом, целый ряд ключевых вопросов функционирования синапса в условиях, приближенных к физиологическим Свысокий уровень
квантового состава ТКП, ритмический характер активности, наличие неквантовой секреции, действие эндогенных веществ-регуляторов и т.д.), остается малоизученным. Подходы к оценке кинетики пре- и постсинаптических процессов в большинстве случаев являются разобщенными. Не решены вопросы пространственно-временной организации секреции при высоком уровне выделения медиатора. Поэтому для получения более полного представления о механизмах синаптической передачи в естественных условиях в настоящем исследовании проводился комплексный анализ как пресинаптических, так и постсинаптических факторов, участвующих в генерации многоквантового ТКП у холоднокровных и теплокровных животных.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Іель работы: Исследование пре- и постсинаптических факторов, зпределяющих амплитуду и длительность многоквантовых токов концевой їластинки в условиях одиночного и ритмического раздражения. Задачи: 1. Исследовать значение временного хода секреции квантов «едиатора для формирования амплитуды и длительности многоквантового 'КП при одиночном и ритмическом раздражении. Провести "анализ (еханизмов синхронизации процесса секреции квантов медиатора. ;. Исследовать вклад постсинаптической потенциации во временной ход 'КП при одиночном и ритмическом раздражении. Провести анализ (еханизмов постсинаптической потенциации.
!. Исследовать роль десенситизации как фактора, определяющего мплитуду и длительность одиночного ТКП, и выяснить возможность азвития десенситизации под влиянием эндогенного АХ в ходе ритмической ктивности синапса. Провести анализ механизмов десенситизации к ндогенному АХ.
. Исследовать влияние неквантовой секреции медиатора на амплитуду и лительность одиночных ТКП.
. Изучить особенности эффектов блокирования АХ-активируемых ионных аналов на амплитуду и временной ход многоквантовых ТКП. Провести нализ механизмов действия заряженных и незаряженных блокаторов аналов.
. Сравнить вероятность развития десенситизации и постсинаптической этенциации у холоднокровных и теплокровных. . Изучить молекулярные механизмы процессов, возникающих в синапсе
после нарушения гидролиза медиатора с целью детализации функций АХЭ.
Впервые проведен комплексный анализ факторов, определяющих амплитуду и длительность ТКП при высоком, близком к физиологическому, уровне секреции медиатора, что позволило раскрыть новые механизмы передачи двигательных команд и полнее представить процессы, происходящие в синапсе в естественных условиях. Предложенное в работе представление о постсинаптических формах кратковременной пластичности открывает новые контуры регуляции и саморегуляции функции химического синапса.
Впервые описан феномен постсинаптической потенциации как следового процесса, способного участвовать в механизмах кратковременной пластичности, ^изучены его механизмы. Впервые показана возможность постсинаптического взаимодействия квантов АХ при активной АХЭ.
Установлена возможность развития десенситизации в ходе ритмической активности синапса при физиологическом Сне- модифицированном снижение* или увеличением) уровне квантового состава. Показано совместите развитие при этом и постсинаптической потенциации, причем установлено, что последняя маскирует проявления десенситизации. Сформулирована гипотеза о роли десенситизированных холинорецепторов как "ловушек" длі свободного медиатора, что позволяет по-новому взглянуть на роль этогс явления в процессе генерации одиночного синаптического сигнала. Описана способность ускорять десенситизации к эндогенному АХ у ряд; фармакологических агентов (верапамил, винбластин, форсколин) ] биологически активных соединений (субстанция Р).
Разработана модель, позволяющая проанализировать кинетику секрециі квантов АХ в ходе генерации многоквантового ТКП и сопоставить кинетик; пре- и постсинаптических событий для оценки эффекта снижения амплитуд: из-за асинхронности секреции квантов АХ. Описаны различные проявлени асинхронности, наблюдаемые после блока К-каналов нервных окончаний
Обнаружена способность, блокировать открытый ионный канал п быстрому типу у реактиватора АХЭ дипироксима. Показана зависимост проявлений блока каналов от квантового состава ТКП. Описан новы гомологический ряд незаряженных блокаторов ионных каналов.
Показана функциональная роль АХЭ в синапсе как фактора регулирующего выраженность постсинаптической пластичности. Показан
большая значимость этого фермента в синапсах теплокровных.
Впервые описан и проанализирован эффект развития десенситизации под влиянием неквантового АХ. изучено влияние ряда факторов, способных повлиять на чувствительность постсинаптической мембраны к медиатору через модуляцию уровня неквантовой секреции АХ.
-
Асинхронность секреции квантов медиатора из нервного окончания увеличивает время роста, снижает амплитуду, но не влияет на длительность спада одиночного многоквантового ТКП. Усиление асинхронности секреторного процесса является одним из компонентов депрессии синаптических сигналов во время ритмической активности синапса.
-
Превышение длительности спада многоквантового ТКП над длительностью одноквантового ответа при активной АХЭ является результатом перекрытия зон действия квантов медиатора на постсинаптической мембране, приводящего к усилению повторной активации рецепторов медиатором. Вероятность повторной активации рецепторов ограничивается за счет гидролиза медиатора и связывания свободного АХ в синаптической щели десенситизированными рецепторами.
-
Противоположные по функциональному значению формы кратковременной постсинаптической пластичности - постсинаптическая потенциация и десенситизация - параллельно развиваются в ходе ритмической серии многоквантовых ТКП. Прекращение активности приводит к быстрому исчезновению потенциации и более медленному устранению десенситизации. Основой постсинаптической пластичности служат вариации временного хода концентрации АХ в синапсе и соответствующие конформационные изменения холинорецептора.
-
Одна'из функций фермента ацетилхолинэстеразы в нервно-мышечном синапсе заключается в регуляции выраженности кратковременной постсинаптической пластичности.
-
Нервно-мышечные синапсы разных животных различаются по способности проявлять постсинаптическую пластичность в ходе ритмической активности. Одним из наиболее чувствительных критериев этой способности является превышение длительности многоквантового ТКП над длительностью одноквантового ответа', которое наблюдается при определенном и разном у разных животных уровне секреции медиатора.
- є -
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ
Основное теоретическое значение имеет разработанное представление о комплексе факторов, определяющих процесс генерации постсинаптического тока в химическом синапсе. Эти данные являются основой для анализа работы синапса в естественных условиях и могуі быть использованы при исследовании сигналов в других типах химически* синапсов, а также для трактовки процессов, происходящих в синапсе і онтогенезе. Разработанное представление о постсинаптических формаї кратковременной пластичности вскрывает новые механизмы регуляции і саморегуляции синаптической передачи и открывает перспективы длі целенаправленной модуляции функции синапса через посгсинаптическос звено. Полученные данные служат основой для построения обобщенно! модели функционирования химического синапса.
В работе предложены новые тесты для оценки развития в синапсе постсинаптической потенциации и десенситизации, которые могут был использованы в практике электрофизиологического и фармакологической эксперимента. Разработана математическая модель для оценки временноп хода секреции медиатора в ходе генерации многоквантового ТКП позволяющая оценить эффект "потери" амплитуды ТКП из-за асинхронност; секреции при разных воздействиях на кинетику пре- и постсинаптически: событий. Эти данные могут быть использованы для более корректны способов расчета уровня . вызванной секреции медиатора. Обнаружен способность ускорять десенсйтизацию у ряда широко используемы лекарственных средств,' что следует учитывать в клинической практике Установлена способность АХ, выделяемого в неквантовой форме, вызыват десенсйтизацию и роль десенситизированных рецепторов как фактора компенсирующего функциональную недостаточную активность АХЭ, что може служить основой для разработки новых принципов терапии при отравления ингибиторами АХЭ. Полученные данные могут способствовать раскрыта патогенеза ряда заболеваний нервно-мышечной системы.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Результаты работы были доложены на: Всесоюзном симпозиум "Нейромедиаторы в норме и патологии" С Казань, 1979), Всесоюзнь конференциях по физиологии и биохимии медиаторов, посвященных памят Х.С.Коштоянца (Москва, 1980, 1985, 1990), Всесоюзном I биофизическс съезде СМосква, 1982), II Всесоюзном семинаре "Молекулярные механиз»
регуляции синаптической передачи" (Пущино, 1983), Всесоюзном симпозиуме "Физиология медиаторов" (Казань, 1984), Координационных рабочих совещаниях по периферическому синапсу (Киев, 1983, Казань, 1986), Международном симпозиуме по холинэстеразаы (Блад; Югославия, 1984), Всесоюзных симпозиумах по одиночным ионным каналам (Пущино, 1985, 1987), Всесоюзных съездах физиологического общества им. И.П.Павлова (Алма-Ата, 1979, Баку, 1983, Кишенев, 1987), Поволжской конференции по вегетативной нервной- системе (Куйбышев, 1988), Всесоюзной конференции "Механизмы действия гормонов и медиаторов" (Суздаль, 1989), Всесоюзных симпозиумах по ионным каналам (Кара-Даг, 1989, 1990), Международном симпозиуме "Механизмы образования памяти" (Майнц, Германия, 1989), Международном симпозиуме "Пластичность мотонейрона" (Бонн, Германия, 1990), Научных семинарах отдела ИЭФБ им. И.М.Сеченова (Ленинград, 1987, 1988, 1989), Международном конгрессе по физиологическим наукам (Прага, Чехословакия, 1991), заседании Татарского отделения Всесоюзного физиологического общества им.И. П.Павлова (Казань, 1992).
Результаты проведенных экспериментов включены в лекционный курс по физиологии и биофизике для студентов Казанского медицинского института и Казанского университета и используются в научных исследованиях в институтах эволюционной физиологии и биохимии (Санкт-Петербург), токсикологии (Санкт-Петербург), органической и физической химии (Казань), институте физиологии (Прага, Чехословакия).
По теме диссертации опубликовано 65 научных работ (35 статей и 30 коротких сообщений). Обзорные статьи [13,37,59] вошли в книги "Холинэстеразы" (ФРГ, 1984), "Основы памяти" (ФРГ, 1989), "Холинергические основы терапии болезни Альцгеймера" (США, 1991).
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты проводили на изолированных нервно-мышечных препаратах мыши (диафрагма), крысы (диафрагма) и лягушки (портняжная мышца). Для получения ТКП с высоким, близким к физиологическому, уровнем секреции медиатбра блокирование мышечных сокращений осуществляли поперечным рассечением мышечных волокон (Barstad, Lilleheil, 1962, Волкова и др..
1975) или детубуляцией с помощью глицерина CGage, Eizenberg, 1967). ТКП, отводимые в этих препаратах далее именовали "многоквантовые ТКП", а ТКП, регистрируемые в мышцах, в которых блокирование осуществляли за счет снижения квантового состава ионами магния - "низкоквантовые ТКП".
В работе использовали различные электрофизиологические методы регистрации синаптических токов и потенциалов: а) внутриклеточное отведение вызванных стимуляцией нерва ТКП и МТКП с помощью двух микроэлектродов в условиях фиксации потенциала, б) внеклеточное отведение ТКП и МТКП, в) фокальную регистрацию ПД двигательных нервных окончаний; г) определение времени жизни ионных каналов постсинаптической мембраны методом анализа автокорреляционной функции ацетилхолинового шума, д) величину "Н-эффекта" - гиперполяризации, вызванной d-тубокурарином при блокированном гидролизе медиатора для определения уровня неквантовой секреции АХ, е) аппликацию АХ из микропипетки для оценки чувствительности постсинаптической мембраны.
С помощью компьютера С"Электроника ДЗ-28", IBM PC/AT) решали следующие задачи: а) накопление, усреднение и вычисление амплитудно-временных. характеристик синаптических сигналов: времени роста, максимальной амплитуды, постоянной времени спада, б) проверку характера спада на соответствие экспоненте и при необходимости -расчет количества экспонент и их параметров, в) стимуляция нерва в заданном режиме, г) моделирование ТКП на базе заданного распределения временного хода секреции медиатора и реконструкция этого распределения исходя из параметров ТКП и МТКП, д) моделирование действия блокаторов ионных каналов неї базе математической модели МТКП, е) статистическую обработку данных.
В части опытов блокировали гидролиз АХ. Для этого использовали ингибиторы АХЭ армии С экспозиция в растворе 10 - 10 моль/л в течение 30 мин с последующей отмывкой свободного армина), прозерин СЗ-10" моль/л). Ряд фармакологических агентов использовали для целенаправленного воздействия на разные звенья синаптической передачи: агонисты ХР карбахолин и АХ, блокаторы холинорецепторов d-тубокурарин и oL-бунгаротоксин, различные блокаторы ионных каналов холинорецептора, блокатор Ыа+-каналов тётродотоксин, К+-каналов - 4-аминопиридин, ингибитор Na+, К+-АТФазы оуабаин, ускоритель десенситизации проадифен CSKF-525A), ингибитор транспорта АХ в синаптические везикуль везамикол.
1.' ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА