Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Определение, история заболевания, эпидемиология 17
1.2. Иммунопатогенез 19
1.3. Этиология и триггерные факторы
1.3.1. Иммуногенетические факторы .22
1.3.2. Клинические триггерные факторы
1.4. Клинические формы. Гистологическая картина и диференциальная диагностика красного плоского лишая 23
1.5. Качество жизни пациентов с КПЛ .37
1.6. Лечение больных красным плоским лишаем
1.6.1. Фототерапия 38
1.6.2. Медикаментозная терапия 39
1.7. Терапия импульсным широкополосным светом .45
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Клиническая характеристика пациентов 49
2.2. Клинические методы исследования
2.2.1. Определение индекса красного плоского лишая 56
2.2.2. Дерматологический индекс качества жизни 60
2.2.3. Лабораторные методы исследования .63
2.2.4. Специальные методы исследования 65
2.2.5. Гистологическое исследование 67
2.2.6. Фотографирование пациентов .68
2.2.7. Дерматоскопия..
2.3. Методы и методики лечения 69
2.4. Методы статистической обработки результатов исследования 71
Глава 3. Оценка эффективности фармако-физиотерапевтического метода у пациентов с красным плоским лишаем
3.1. Влияние комбинированного применения импульсного поляризованного света и ингибитора кальциневрина на клиническую симптоматику с учетом показателей индекса дерматологического статуса при красном плоском лишае 72
3.2 Влияние различных методов лечения на изменение показателей качества жизни больных красным плоским лишаем 75
3.3. Сравнительная оценка интенсивности зуда у больных красным плоским
лишаем под влиянием различных методов терапии 83
3.4. Влияние комбинированного применения импульсного поляризованного света и топического ингибитора кальциневрина на отдельные показатели врожденного иммунитета 86
3.5. Влияние комбинированного применения импульсного поляризованного света и топического ингибитора кальциневрина на отдельные показатели иммунного статуса 3.6. Изучение безопасности применения комбинированного метода 94
3.7. Влияние на клинико-биохимические показатели больных красным плоским лишаем 98 3.8. Терапевтическая эффективность разработанного метода комбинированного применения импульсного поляризованного света и топического ингибитора кальциневрина 99
3.9. Гистологические изменения до и после применения импульсного поляризованного света и топического ингибитора кальциневрина 101
ГЛАВА 4. Сравнение отдаленных результатов после различных методов терапии
4.1. Отдаленные результаты после различных методов лечения 105
4.2. Анализ эффективности профилактического применения комбинированной терапии импульсным поляризованным светом и топическим ингибитором кальциневрина в межрецидивный период .107
Заключение 109
Выводы 119
Практические рекомендации .120
Список литературы
- Этиология и триггерные факторы
- Дерматологический индекс качества жизни
- Влияние различных методов лечения на изменение показателей качества жизни больных красным плоским лишаем
- Анализ эффективности профилактического применения комбинированной терапии импульсным поляризованным светом и топическим ингибитором кальциневрина в межрецидивный период
Этиология и триггерные факторы
Относительное преобладание больных мужского пола в детском возрасте является необычным для аутоиммунной природы заболевания и предполагает, что другие возможные до сих пор неизвестные механизмы могут быть задействованы в патогенезе КПЛ. В одном исследовании было показано, что детские формы КПЛ чаще встречаются у афроамериканского населения [132]. Кроме того, гипертрофический и актинический варианты, а также пигментная форма более распространены среди афроамериканцев или у темнокожих больных (Kanwar A. J., Dogra S., Handa S., Parsad D., Radotra B. D., 2003; Salman S. M., Kibbi A.G., Zaynoun S., 1989) [80]. Поствоспалительная гиперпигментация является характерным исходом КПЛ, что является более распространенным преимущественно в афроамериканской популяции [57]. У Азиатов фолликулярная форма встречается реже, чем у других национальностей по данным канадского эпидемиологического исследования (Tan E., Martinka M., Ball N., Shapiro J., 2004). На современном этапе развития медицинской науки КПЛ рассматривается Т-клеточно-опосредованное аутоиммунное заболевание. Воспалительные клетки, участвующие в этом процессе преимущественно состоят из Т-хелперов и Т-цитотоксических лимфоцитов, естественных киллеров (NK-клетки), и дендритных клеток. Т-клеточная активация занимает основополагающее место в патогенезе КПЛ. Цитотоксическая Т-клеточная инфильтрация в эпителии является результатом апоптоза базальных кератиноцитов. Теоретически, это может быть вызвано CXCR3 и CCR5 опосредованных сигнальных путей, инициированных как Т-лимфоцитами, так и кератиноцитами (Ichimura K., Hiratsuka N., Ogura et al., 2006).
На ранних стадиях, Т-клетки находятся преимущественно в глубоких слоях эпидермиса и в эпидермально-дермальном соединении [1, 80]. CCR5-связанные хемокины, а также CXCR3-таргетные хемокины существенно преобладают в высыпаниях, что в дальнейшем ведет к увеличению оборота мононуклеарных клеток в высыпаниях (Iijima W., Ohtani H., Nakayama T. et al., 2003; Spandau U., Toksoy A., Goebeler M., Bro cker E., Gillitzer R., 1998). Эта корреляция или совпадение свидетельствует о том, что оба кератиноцит-индуцированные и собственно индуцированные механизмы участвуют в Т - клеточной миграции в рамках высыпаний. Кроме того, клетки Лангерганса индуцируются CCR6-связанными хемокинами [80]. Активированные Т-клетки стимулируют Т-хелперы 1 типа (Тh1) ответ, в результате чего кератиноциты удаляются иммунными клетками [2, 81]. Тh1-ответ регулируется через toll-подобные рецепторы (TLR) [81]. TLR в основном активируют врожденный иммунитет, но могут также активировать и адаптивный иммунитет. Активация TLR2 индуцирует Тh1 активацию. Однако, можно предположить, что происходит подавление активности TLR2 и усиление активности TLR4 у больных оральным КПЛ (Janardhanam S. B., Prakasam S., Swaminathan V. T., Kodumudi K. N., Zunt S. L., Srinivasan M., 2012). Кроме того, у пациентов с оральной формой КПЛ, TLR4 и TLR9 активированы в поверхностных и базальных слоях, соответственно (Siponen M., Kauppila J. H., Soini Y., Salo T., 2012). NK-клетки могут мигрировать в участки поражения намного чаще, чем в здоровой коже (Carbone T., Nasorri F., Pennino D. et al., 2010). Эти клетки могут вносить вклад в патогенез КПЛ из-за их цитотоксической активности и их способности секретировать провоспалительные цитокины [14, 53].
Одним из основных патогенетических механизмов КПЛ является увеличение апоптоза кератиноцитов и снижение апоптоза Т-клеток (Lei L., Tan W.X., Zhou X.L., Zheng P.E., 2010). Активированные цитотоксические Т-клетки активируют Ig класса G и индуцируют апоптоз кератиноцитов в надбазальном слое клеток путем связывания с IgG на поверхности кератиноцитов (Hadzi-Mihailovic M., Raybaud H., Monteil R., Jankovic L., 2010). NK-клетки и цитотоксические Т-клетки могут также индуцировать апоптоз через гранзим Б/ перфорин пути. Этот аутодеструктивный иммунологический механизм является более выраженным при оральном КПЛ, чем при кожной форме (Santoro A., Majorana A., Bardellini E. et al., 2004). Измененный иммунный ответ приводит к апоптозу базальных кератиноцитов, что в конечном счете приводит к «растворению» всего базального слоя. Эти изменения в виде апоптоза могут также быть отражением активности заболевания (Brant J. M. C., Vasconcelos A. C., Rodrigues L. V., 2008).
Ragaz и Ackerman (1981) отметили увеличение числа клеток Лангерганса в эпидермисе на ранних стадиях патологического процесса. Эти клетки функционируют, чтобы представить аутоантигены или чужеродные антигены Т-клетам до Т-клеточной активации. Клетки Лангерганса являются более распространенными при оральном КПЛ, чем в здоровой слизистой оболочке полости рта, и степень миграции этих клеток из поверхностного слоя в базальный слой может быть предиктором хронизации заболевания (Pandey A., Setty S., Rao R., Radhakrishnan R., 2011).
Дерматологический индекс качества жизни
Степень выраженности зуда и его влияние на повседневное функционирование пациентов оценивались с помощью индекса зуда – Пруриндекс и опросника Behavioral rating scores (BRS). Для оценки интенсивности зуда (Пруриндекс) пациентам предлагался опросник 1 раз в сутки, где по 8-бальной шкале производилась оценка зуда, где 0 баллов выставлялось при отсутствии зуда, 1 балл – слабый зуд, 2 балла – заметный зуд, 3 балла – выраженный, 4 балла – сильный, 5 баллов – очень сильный, 6 – пульсирующий и 7 баллов при нестерпимом зуде.
Опросник BRS включал в себя 2 вопроса, где сумма баллов показывала выраженность зуда и его влияние на функционирование пациента в зависимости от времени суток (таблица 9).
Опросник Behavioral rating scores (BRS) Вопрос 1. Как Вы оцениваете зуд в дневное время (за после 0 баллов Зуд отсутствует балл Легкии зуд, не раздражающии и не причиняющии беспокоиство балла Умеренныи зуд, раздражающии и причиняющии беспокоиство, способныи влиять на повседневную деятельность 3 балла Выраженныи зуд, очень раздражающии, сильно влияющии на повседневную деятельность 4 балла Очень сильныи зуд, нарушающии повседневную деятельность Вопрос 2. Как Вы оцениваете зуд в ночное время (за последние сутки)? 0 баллов Зуд отсутствует 1 балл Легкии зуд, не раздражающии и не причиняющии беспокоиство 2 балла Умеренныи зуд, раздражающии и причиняющии беспокоиство, способныи влиять на повседневную деятельность 3 балла Выраженныи зуд, очень раздражающии, сильно влияющии на повседневную деятельность 4 балла Очень сильныи зуд, нарушающии повседневную деятельность Полученный результат был от 0 баллов, как минимум и 8 баллов, как максимум.
Красный плоский лишай оказывает значительное влияние на качество жизни, причиняя пациентам не только физический, но и психологический дискомфорт. Любые проблемы на коже становятся причиной проблем в общении, снижают самооценку и приводят к депрессиям, психозам, что негативо сказывается на лечении дерматоза. Дерматологический Индекс Качества Жизни (ДИКЖ, The Dermatology Life Quality Index (DLQI)) применяется для оценки степени негативного воздействия заболевания на разные аспекты жизни пациента, характеризующие качество его жизни в целом. Индекс был разработан специалистами Уэльского университета (авторские права принадлежат AY Finlay, Gk Khan, April 1992). Поэтому помимо оценки физикального осмотра, лабораторных показателей, важно оценить и психологический статус пациента. Индекс ДИКЖ может использоваться как критерий оценки эффективности лечения дерматологического заболевания.
Анкета для определения индекса ДИКЖ предназначена для пациентов старше 16 лет. Вопросы анкеты ДИКЖ были адресованы непосредственно пациенту. Однако для облегчения работы больного присутствовал врач-дерматолог. Качество жизни – это неотъемлемый признак, влияющий не только на заболевание и его лечение, но и на пациента и его благосостояние. Мы оценивали различные состояния пациента (физическое, эмоциональное и социальное), оказывающие влияние на заболевание и исход лечения. Важно понимать, что от качества жизни пациентов зависит исход терапии, а повышение этого показателя является конечно целью терапевтических мероприятий. Цифровой показатель, который мы получали в результате анализа ответов пациента, отражал уровень негативного воздействия заболевания на качество жизни пациента.
Пациенты отвечали на вопросы дважды – до и после лечения. Благодаря этому опроснику мы смогли оценить не только физическое и психологическое состояния, но и качество проведенного лечения. Опросник имел ряд преимуществ в виде простоты и скорости оценки полученных результатов (таблица 10).
Влияние различных методов лечения на изменение показателей качества жизни больных красным плоским лишаем
Оценивались отдельные показатели клеточного звена иммунитета, проводилось изучение уровня экспрессии гена толл-подобного рецептора второго типа (TLR2) в соскобах кожи из патологических очагов красного плоского лишая и анализировались маркеры зуда в сыворотке крови.
Определение количества субпопуляций лимфоцитов проводили с использованием методики проточной лазерной цитометрии, с использованием моноклональных антител с двойной меткой на лазерном проточном цитофлуориметре FACS Calibur “Becton Dickinson”. Для анализа данных (Cell QUEST) использовали программы c набором моноклональных антител (BD Simultest Reagents), лизирующего раствора (BD FACS Lysing Solution), фиксирующего раствора (BD Cell FIX) и реагентов для подсчета субпопуляций лимфоцитов в проточном цитофлуориметре (BD FACS Flow). Популяции лейкоцитов и «выделение» лимфоцитарного «окна» по светорассеянию: Д - (CD3/CD4) - для определения количества Т-хелперов CD3+CD4+-лимфоцитов; E - (CD3/CD8) - для определения количества Т цитотоксических лимфоцитов CD3+CD8+-лимфоцитов; F - (CD3/CD16CD56) - для определения количества натуральных киллеров - CD3-/CD16CD56-лимфоцитов; NK-лимфоцитов-СD3+/CD16+CD56+; G - (CD3/HLA-DR) – для определения активированных Т—лимфоцитов (CD3+HLA-DR+) и активированных иммунокомпетентных клеток, в состав которых входят В-лимфоциты, NK-клетки, моноциты -CD3-HLA-DR+-клетки. Данные, которые были получены в ходе анализа подвергались компьютерной обработке на базе программной системы CellQUEST.
Исследование уровня экспрессии гена TLR-2 в коже проводили путем выделения РНК из клинического материала с использованием комплекта реагентов «РИБО-сорб» согласно инструкции производителя. Выделенную РНК хранили при -70C. Реакцию обратной транскрипции проводили для синтеза кДНК на матрице мРНК гена TLR для последующего определения числа копий с помощью ПЦР-РВ, для этого к смеси праймеров (3 мкл обратного праймера TLR (Синтол, Россия) и 1 мкл random-праймера (5 ОЕ/мкл; Синтол, Россия) добавляли по 4 мкл РНК пробы и инкубировали в твердотельном термостате при температуре 75С (Термостат «Термит», ДНК-Технология, Россия) 3 минуты. Затем добавляли 10х буфер для ревертазы (Сибэнзим, Россия, dNTP 2,5 мМ (Синтол, Россия), M-mulv reverse transcriptase 0,1 мкл (Сибэнзим, Россия), после чего пробирки помещали в амплификатор («Терцик», ДНК-Технология, Россия) на 1 час при 37С, далее на 10 мин при 94С. Последовательность праймеров TLR подбирали с помощью программы Vector NTI 8.0, анализируя последовательность интересующих генов, полученную из электронной базы данных GenBank. Для постановки ПЦР-РВ использовали реагенты из «Набора для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I» (Синтол, Россия). Реакцию ПЦР-РВ проводили в приборе АНК-32 (Институт Аналитического Приборостроения РАН, Россия). Уровень экспрессии исследуемого гена проводилось относительно экспрессии гена -актина, для чего использовали «Набор реактивов для обнаружения и определения кДНК -актина человека» (Синтол, Россия). Все действия по постановке реакции проводились согласно рекомендациям фирмы-производителя.
Концентрация в сыворотке крови биохимических маркеров зуда гистамина определяли с помощью с помощью тест системы «UniCap». Гистамин содержится в базофильных лейкоцитах. Результаты определения этого маркера зависели от количества этих клеток в цельной крови. Использовалась способность соединений в щелочных средах переходить в органическую фазу, а в кислых в фазу водную. Измерялась флюоресценция продуктов конденсации гистамина с ортофталевым альдегидом и проводился анализ.
Гистологическое исследование Гистологическое исследование является важнейшей методикой в диагностике заболеваний кожи. Под местной инфильтрационной анестезией осуществлялся забор биоптата первичного элемента кожной сыпи без захвата здоровой кожи стандартным цилиндрическим ножом диаметром 6 мм, при котором в срез попадали все слои кожи и подкожная клетчатка с кожными структурами (волосяные фолликулы, сальные и потовые железы). Данная методика является адекватной для постановки диагноза и не требует наложения швов после удаления кожного биоптата.
Исследуемый материал помещался в герметично закрываемый контейнер с 10 % забуференным формалином, объем которого превышал объем биоптата в 20 раз. Далее материал доставлялся в лабораторию патоморфологии кожи. Гистологическое исследование проводилось по стандартному протоколу с изготовлением парафиновых срезов толщиной 4 мкм и окрашиванием их гематоксилином и эозином. Фиксация, проводка биоптатов кожи проводилась на аппарате Tissueek VIP 5Jr («Сакура Сейка Ко., Лтд.», Япония). Заливка в парафин (изготовление парафиновых блоков) -модульная станция заливки парафином Leica EG1150. Изготовление срезов проводилось микротом Leica RM 2245. Окраска препаратов – с использованием автоматического аппарата для окрашивания Leica ST5010 (Leica Microsystems Nussloch GmbH, ФРГ). Гистологические препараты исследовались в светлом поле на микроскопе Leica DM2500 с фотофиксацией камерой Leica DFC 450C с программным обеспечением Leica application suite 4.4.
Анализ эффективности профилактического применения комбинированной терапии импульсным поляризованным светом и топическим ингибитором кальциневрина в межрецидивный период
В работе проводилось изучение уровня экспрессии гена толл-подобного рецептора второго типа (TLR2) в соскобах кожи из патологических очагов красного плоского лишая. До терапии было обнаружено, что экспрессия гена TLR2, отвечающего за определенные механизмы врожденного иммунитета кожи была достоверно значимо увеличено при этом отмечалась прямая зависимость от тяжести процесса, а в большинстве случаев – это и большая длительность патологического процесса. Так при легкой степени тяжести экспрессия гена толл-подобного рецептора второго типа в очагах КПЛ соответствовала уровню 4,129±0,018 против 3,289±0,012 (критерий Манна-Уитни, р 0,05). При средне-тяжелой степени тяжести экспрессия гена толл-подобного рецептора второго типа в очагах КПЛ была еще более значимой (выше в 1.3 раза по сравнению с легкой степенью тяжести КПЛ) и соответствовала уровню 4,662±0,022 против 3,289±0,012 (критерий Манна-Уитни, р 0,05). При тяжелой степени тяжести были отмечены самые высокие показатели экспрессии гена толл-подобного рецептора второго типа в очагах КПЛ, которые составили 4,685±0,026 против 3,289±0,012 (критерий Манна-Уитни, р 0,05).
После применения комбинированного метода терапии вне зависимости от степени тяжести процесса отмечалось восстановление экспрессии (табл. 15). Так при легкой степени наблюдалось снижение уровня экспрессии TLR 2 рецепторов до показателя нормы - 3,562±0,024 (критерий Вилкоксона, p 0,05). У пациентов со средне-тяжелым течением КПЛ показатель снизился и составил 3,729±0,019 (критерий Вилкоксона, p 0,05). У пациентов с тяжелым течением КПЛ показатель снизился и составил 3,662±0,023 (критерий Вилкоксона, p 0,05).
Анализируя полученные данные исследования уровня экспрессии гена TLR2 в образцах кожи из очагов красного плоского лишая можно предположить, данные сигнальные пути играют определенную роль в механизмах развития данного дерматоза, о чем свидетельствует их повышенный уровень (гиперэкспрессия). Разработанный комбинированный метод, по-видимому, угнетает экспрессию толл-подобных рецепторов, что лежит в основе высокой терапевтической эффективности комбинированного применения IPL терапии и такролимуса.
Влияние комбинированного применения импульсного поляризованного света и топического ингибитора кальциневрина на отдельные показатели иммунного статуса Считается, что одним из ключевых патогенетических звеньев красного плоского лишая является иммуноопосредованное воспаление, поэтому методы лечения, влияющие на функциональную активность иммунной системы, обладают высокой эффективностью. Учитывая данные исследований последних лет об иммуномодулирующем действии фототехнологий с преимущественным супрессивным действием, механизмы действия такролимуса и отсутствие в доступной литературе данных о влиянии как комбинированного применения данного метода, так и его составляющих нами были исследованы отдельные показатели клеточного звена иммунитета до и после лечения.
До терапии у большинства (93,7%) больных отмечались изменения в иммунном статусе, касающиеся клеточного звена иммунитета. Данные изменения в значительной степени варьировали, однако, прослеживалась общая тенденция, что отражало тяжесть процесса у находившихся под наблюдением пациентов.
Так до лечения были выявлены следующие изменения: относительное количество активированных Т-лимфоцитов CD3+ было достоверно снижено 48,9+0,8 против контроля 62,4±3,4 (р 0,05), однако абсолютное число СОЗ+лимфоцитов было значительно повышено 1547±29 при значениях в группе контроля 1115±72 (р 0,05), данный факт несоответствия абсолютных и относительных показателей объясняется тем, что в исходе общее количество Т-лимфоцитов было значительно повышено, таким образом, при относительном дефиците CD3+ лимфоцитов отмечалось увеличение их общего количества. Относительное и абсолютное количество Тh-клетки, по сравнению с контролем (41,2±2,9/935±24) было повышено: 50,9±4,8/1124±36 (р 0,01). На этом фоне отмечалось значительное уменьшение относительного и абсолютного количества клеток супрессорной субпопуляции CD8+ лимфоцитов 16,4±2,9 (р 0,01) - в контроле 27,6±3,5 и 625±37 (р 0,05) - в контроле 625±37соответственно.