Введение к работе
Актуальность темы. Пресноподпый легочный моллюск Lymnuea stagnate (L) (Gnsirupoda, Pulmonata) - классический модельный объект сопременной нейрофизиологии. Его центральная нервная система (ЦМС) содержит относительно небольшое количество (около 15000) крупных нейронон, многие ні которых достигают 200 микрометров в диаметре. Это позволило в относительно короткий период идентифицировать нейроны и нейрональные сети, регулирующие процессы дыхания (Moroz, 1991; Sycd et al., 1991), питания [Elliott and Kemencs, 1992], размножения [Roubos et al., 1988] и локомоции [Syed et al., 1988). й целом, количество идентифицированных нейронов и синапсов у L stagnate превышает несколько сотен [Winlow et al., 1992], что позволяег рассматривать этот вид как один из наиболее изученных в иейробпологнческом отношении. Как показали эксперименты с модуляцией свободного поведения L stagnate, do всех вышеуказанных процессах определенную роль могут играть функционально и фармакологически различные клеточные рецепторы гамма-аминомаслянной кислоты (ГАМК) [Moroz, 1991; Romanova, 1994]. Результаты иммуногистохимического анализа свидетельствуют о наличии ГАМК-ергнческих нейронов в периферическом осфрадиальнрм ганглии [Nezlin et al., 1994].
Недавно из нервной системы L stagnate были изолированы комплементарные дезоксирнбонуклеииовые кислоты (кДНК), кодирующие полипептиды, идентичные иа 30-52% аир субьеднннцам ГАМКл-рецспторио-канальных комплексов млекопитающих. Результатом экспрессии кДНК в ооцитах Xenopus laevb стало формирование ГАМКл-подобных ионотропных рецепторов. Существующие различия между структурными полипептидамн ГАМКл-рецепторов позвоночных и L stagnate позволили ввести а современную классификацию семь новых субъединнчных подтипов [Darlison et al., 1994].
Несмотря на столь значительные успехи молекулярно-биологических исследований, практически ничего не известно о характеристиках рецепторов ГАМК в нативных нейрональных мембранах L stagnate [Бочарова, 1975]. Соответственно, остаётся не выясненной функциональная роль этих рецепторов, а также нх значение для адаптации организма к естественным условиям и антропогенным изменениям среды обитания. Исследования показали, что у беспозвоночных основной мишенью воздействия токсических соединений во многих случаях являются именно ГАМК-рецепторы [Lunt, 1991]. Благодаря способности специфически реагировать на те или иные вещества, находящиеся в окружающем пространстве, L. stagnate широко используется для контроля и оценки состояния водных экосистем [S-Rozsa et al., 1988).
Учитывая большое значение систем клеточной рецепции аминокислот для реализации механизмов химической чувствительности и пластичности нейрональных мембран как беспозвоночных, "так и позвоночных животных, весьма интересным и
важным является изучение локализации, электрофизнологическнх и фармакологических характеристик рснеигороп ГАМК L. siagnalu.
Связь работы с крупными научными нроіраммами 'смамн. Настоящая работа является составной частью научно-нсслсдонательских программ "Исследовать механизмы действия модифицированных полисахаридов для изыскания эффективных антиаритмиков, регуляторов функции миокарда и температурной устойчивости организма.", Г.Б. W» 004-56 и "Нсйромсдиаторнмс механизмы модуляции поведенческих лроірамм у l.ymnaeasiagnulu"'. RWM300.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось экспериментальное обоснование гипотезы о присутствии в нейронах ЦІ 1С пресноводного легочного моллюска l.ymnaea siagimlis нескольких типов рецепторов гамма-аминомаслянной кислоты.
D соответствии с этой целью решались следующие основные задачи:
1. Исследовать локализацию в ЦПС L stugiuilis илензнфнциропанных нейронов,
чувствительных к игонисгам ГАМКл- и ГЛМКв-рсцепторов.
-
Провеет элекгрофизиологический и фармакологический анализ эффектов агоннсто» и (штагошатои ГАМКа- и ГАМКв-рецспторов на указанные нейроны.
-
Выяснить возможную роль рецепторов ГАМК в мехам.шах нейроналыюй пластичности путем:
3.1. оценки влияния эндогенных нейромодуляторов (серотоніні, мет-энксфалин,
интерлейкииы IL-lp, 1L-2, IL-4, 1L-6) и некоторых физиологически активных
экзогенных соединений (форбол 12, 13-дибутират, морфнцептин, налоксон) на
вызванные атомистами ГАМКл-ренептороп пейрональные ответы;
3.2. анализа воздействия шонистов ГАМКа- и ГАМКв-рецспторов на мембранные
потенциал-зависимые ионные токи.
Научнаи новизна результатов. Судя по имеющимся литературным данным, в работе оперные а мире продемонстрировано наличие двух типов рсцепюров ГАМК в идентифицированных нейронах ЦНС L stagnate, которые по своим электрофизиологическим и фармакологическим характеристикам близки к ГАМКа-рецепторно-канальным комплексам н ГАМКв-сопряжсниым с О-бслкамн рецепторам позвоночных.
Установлено, что стимуляция ГАМКл-подобных рецепторов / itagnalis приводит к формированию входящего хлорного тока, вызывающего деполяризацию нейронов различных функциональных групп (ннтернейрои RPeDI, расположенный на дортальной стороне правого педального ганглия, и некоторые могонейроны из А групп педальных и правого париетальною іанглиев).
Выявлено, что через ГАМКв-подобнмс рецепторы реализуется несколько различных мембранных эффектов' увеличение проводимости нейроналыюй
мембраны для ионов калия и связанная с этим гиперполярнзация клеток (интернейроны RPeDI, VD4 -дорзальная сторона висцерального ганглия); угнетение кальциевого и быстрого калиевого потенциал-зависимых токов, приводящее к уменьшению амплитуд потенциала действия и следовой гиперполярпзации (RPeDI, LPeDI - дорзальная сторона левого педального ганглия, часть нейронов из L и М групп висцерального ганглия).
Впервые обнаружено, что ГАМКа- и ГАМКв-подобные рецепторы ЦНС L siagnalis могут участвовать в механизмах пластичности нейрональных мембран, о чем свидетельствуют:
а) модуляция потенцнал-активнруемых токов агонистами ГАМКв-рецепторов;
б) изменения клеточных ответов, вызванных приложением агонистов ГАМКл-
рецепторов серотонином, мет-энкефалином, морфицептином, форбол 12, 13-
дибутиратом, IL-ip, IL-2, IL-6,1L-4.
Практическая значимость полученных результатов. Показано, что идентифицированные нейроны L. siagnalis являются удобной нейробиологической моделью для исследования влияния физико-химических факторов на функциональные характеристики рецепторов ГАМК. Методическая простота и высокая информативность модели позволяют использовать её при решении научно-практических задач токсикологии и радиобиологии.
Научные положения и выводы диссертации нашли практическое применение при исследовании ллияния модифицированных полисахаридов на химическую чувствительность нейрональных мембран, проведённом в НИЛ терморегуляции БГУ.
Экономическая значь меть полученных результатов. На основе модифицированных методов внутриклеточного диализа [Kostyuk and Krishta', 1977] и "фиксации концентрации" (concentration clamp) [Akaike, 1986] была создана новая система для работы с изолированным перфузируемым нейроном, позволившая уменьшить в десять раз расход биологически активных веществ и в два-три раза увеличить длительность эксперимента, что привело к расширению области применения метода внутриклеточного диализа в нейробиолошческйх исследованиях. После метрологической адаптации данная система может быть представлена в виде коммерческого продукта.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
в педальных, париетальных, правом плевральном и висцеральном ганглиях ЦНС L siagnalis присутствуют идентифицируемые нервные клетки, содержащие ГАМКа- и ГАМКв-подобные рецепторы;
деполяризация нейронов RPaDl (правый париетальный ганглий, дорзальная сторона), RPeDI, LP&V2 (левый париетальный ганглий, вентральная сторона), VDc (два нейрона, расположенных в каудальной части висцерального ганглия, дорзальная
сторона), некоторых нейронов из LPeA, RPeA, RPID групп агонистами ГАМКл-рецепторов (мусцпмол и ГАМК) опосредоваїта увеличением проводимости клеточной мембраны, главным образом, для ионов хлора. Гиперполяризация RPcDl и VD4 агонистами ГАМКв-рсцепторов (баклофен и ГАМР." связана с увеличением проводимости клеточной мембраны преимущественно для ионов калия;
- ГАМК-активнрованное увеличение проницаемости нейрональной
мембраны для С1 угнетается пикротоксипом, кадмием и свинцом, потепциируется ртутью, а для К* подавляется 4-аминопнриднном, тетраэтиамонисм и цезием;
участие систем рецепции ГАМК в процессах нейрональной пластичности определяется, во-первых, модуляцией кальциевых и калиевых потенциал-актнвируемыхтоков в RPcDl, LPcDI, VD4 и ряде нейронов L и М групп агонистами ГАМКв-рецепторов - баклофеном и ГАМК, через механизмы, lie включающие G-белки, чувствительные к коклюшному токсину; во-вторых, тем, что ГАМКл-агонист-индуцированиый входящий хлорный ток подвергается нейромодуляторному воздействию ряда физиологически активных соединений (серотонин, мст-энкефалнн, морфицептин, налоксон, форбол 12,13-дибутират, IL-lp, 1L-2.1L-4, IL-6).
Личный вклад соискателя. Все экспериментальные данные, включенные в настоящую работу, получены непосредственно автором. В диссертации не были использованы результаты исследований соавторов совместных публикаций. В то же время все соавторы принимали участие в обсуждении публикуемых результатов. Научный руководитель и научный консультант участвовали в определении цели и задач исследования, а также в обсуждении полученных результатов.
Апробация работы. Результаты диссертаций доложены и обсуждены на семинарах кафедры человека и животных БГУ, конференции биологического факультета Белгосуннвсрснтета (Минск, 1994), заседании Минского городского отделения физиологического общества Беларуси (Минск, 4 мая 1996) и на международных симпозиумах Heavy metal induced alterations in excitable membranes (Hungary, Tihany, 22-24 July 1993), региональной конференции Международного общества нейробиологии беспозвоночных (IS1N) (Россия, Пущино, 26-28 мая 1994), Symposium on molluscan neurobiology (Netherlands, Amsterdam, 1-4 June 1994), н 8th Symposiun on invertebrate neurobiology (Hungary, Tihany, 27 June-2 July 1995).
Опубликоваїшость результатов. Результаты диссертации изложены в I статье и 8 тезисах научных конференций, опубликованных в отечественных и зарубежных изданиях.
Объем н структура диссертации. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (I глава), описания методов исследования (2 глава), трех глав, содержащих описание и' обсуждение
результатов исследования (3-5 главы), выводов, библиографического указателя, включающего 240 источников, иллюстрирована 1 таблицей и 28 рисунками.