Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы .13
1.1. Этиология и патогенез воспалительных заболеваний пародонт .13
1.2. Микробиологические методы исследования, используемые в пародонтологии .18
1.3. Антимикробные средства используемые в пародонтологии
1.3.1. Антисептические средства 21
1.3.2. Антибиотики .27
1.4. Бактериофаги. Использование в медицине 35
ГЛАВА 2. Материалы и методы .51
2.1. Общая характеристика врачей-стоматологов, участвующих в анкетировании 51
2.2 Общая характеристика пациентов 52
2.3. Характеристика материалов .53
2.4. Методы исследования .55
2.4.1. Лабораторные методы исследования in vitro .55
2.4.1.1. Определение чувствительности микрофлоры пародонтальных карманов к антибиотикам 55
2.4.1.2. Метод spot-тестирования для определения чувствительности микрофлоры пародонтальных карманов к бактериофагам 56
2.4.1.3. Метод определения литической активности бактериофагов в присутствии антисептиков 57
2.4.1.4. Изучение зависимости антимикробной активности гелей от времени экспозиции 58
2.4.1.5 Микробиологические исследования клинических групп пациентов 59
2.4.2. Клинические методы исследования .61
2.4.2.1 Пародонтальные индексы 62
2.4.2.2 Рентгенологические методы исследования 63
2.5. Методы комплексного лечения и профилактики воспалительных
заболеваний пародонта 63
2.5.1. Профессиональная гигиена 63
2.5.2. Способы использования гелей 64
2.6. Методы статистической обработки материала 64
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 66
3.1 Результаты проведенного анкетирования .66
3.2. Результаты лабораторных методов исследования 68
3.2.1. Результаты изучение чувствительности микрофлоры пародонтальных карманов к антибиотикам 68
3.2.2. Результаты изучения чувствительности микрофлоры пародонтальных карманов к бактериофагам 70
3.2.3. Результаты изучения антимикробной активности различных антибактериальных средств 72
3.2.4. Результаты изучения совместного использования бактерио фагов с антисептиками 74
3.3. Результаты клинического обследования пациентов 76
3.3.1. Результаты изучения зависимости антимикробной активности гелей от времени экспозиции 76
3.3.2. Клиническая картина пародонта пациентов с ВЗП 79
3.3.3. Результаты определения длительности курса использования гелей 82
3.3.4. Результаты клинических исследований состояния пародонта у пациентов с ВЗП при динамическом наблюдении 85
3.3.5. Результаты динамики пародонтальных индексов у пациентов с ВЗП 88
3.3.5.1 Динамика показателей индекса гигиены .88
3.3.5.2 Динамика индекса кровоточивости H.R. Muhlemann .91
3.4. Результаты лабораторных исследований пациентов с ВЗП 94
3.4.1 Результаты определения пародонтопатогенов методом ПЦР диагностики у пациентов с ВЗП 94
3.4.2 Динамика выявления пародонтопатогенов у пациентов с ВЗП ... 96
3.4.3. Результаты определения микрофлоры методом масс спектрометрии и её динамики у пациентов с ВЗП 103
3.5 Результаты статистического анализа 116
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 130
Заключение .145
Выводы 147
Практические рекомендации 149
Список сокращений и условных обозначений 150
Список литературы .
- Микробиологические методы исследования, используемые в пародонтологии
- Характеристика материалов
- Результаты изучение чувствительности микрофлоры пародонтальных карманов к антибиотикам
- Динамика выявления пародонтопатогенов у пациентов с ВЗП
Введение к работе
Актуальность темы исследования
По данным ВОЗ, основанным на результатах эпидемиологических исследований, проведенных в 53 странах мира, заболеваемость гингивитом и пародонтитом в различных возрастных группах достигает 80-100%. Именно в связи с такой высокой распространенностью, тяжестью течения и последствий для пациентов, эффективное лечение остается одной из наиболее актуальных проблем стоматологии [Грудянов А.И., 2014, 2016, 2017; Дмитриева Л.А., 2016, Tabary N., 2014, Bhardwaj S.B, 2017].
На данный момент исследователи во всем мире признают, что ведущим этиологическим фактором развития воспалительных заболеваний пародонта, бесспорно, являются пародонтопатогенные бактерии полости рта [Грудянов А.И., 2014,2017,Вольф Г.Ф.,2008, Tabary N.,2014, Freitas C.V., 2016,Bhardwaj S.B, 2017]. В связи со сказанным, очевидно, что основу лечебных вмешательств должны составлять антимикробные средства: антисептики и антибиотики [Грудянов А.И., 2014, 2016, 2017, Dumitrescu A., 2010, Spellberg B., 2014, Bhardwaj S.B, 2017].
Имеющиеся на сегодня антимикробные средства чрезвычайно
многочисленны. Однако в последние годы специалисты во всех областях
медицины столкнулись с проблемой возникновения лекарственной
резистентности и роста числа нежелательных побочных эффектов при применении самых эффективных антибиотиков [Spellberg B., 2013, 2014,]. Сложившаяся ситуация подтверждается прогнозами ВОЗ (2013 г.), согласно которым уже через 10-20 лет практически все существующие микроорганизмы приобретут резистентность к антибиотикам.
В связи с этим поиск более безопасных, целенаправленных и эффективных средств для борьбы с патогенной микрофлорой представляется весьма актуальным. Наиболее перспективными с точки зрения этиотропной терапии являются средства, способные проникать внутрь микробной биопленки и уничтожать патогенные микроорганизмы при условии сохранения представителей
нормофлоры и биоценоза полости рта. Такими средствами могут быть средства на
основе бактериофагов [Зурабов, А.Ю., 2012]. Бактериофаги – это естественные
агенты, которые способны поражать бактерии на внутриклеточном уровне.
Антибактериальный эффект их обусловлен проникновением генома фага в
бактериальную клетку, образованием и сборкой фаговых частиц, выходом
фагового потомства в окружающую среду, что в итоге сопровождается лизисом бактериальной клетки [Михайлова Е.Г., 2011, Никитин В.В., 2017].
В России в последние десятилетия бактериофаги стали с успехом применять в различных областях медицины. Что касается стоматологии, то на отечественном рынке совсем недавно появился единственный препарат на основе бактериофагов - гель «Фагодент», - предназначенный для применения именно в стоматологии, а ещё точнее – в пародонтологии. При этом имеющиеся работы освещают лишь некоторые механизмы его лечебного действия, что совершенно недостаточно для обоснованного и широкого практического применения препарата.
В этой связи на сегодня чрезвычайно актуальным является изучение возможности применения бактериофагов в качестве антимикробного средства для купирования воспаления и продления сроков ремиссии при воспалительных заболеваниях пародонта.
Степень разработанности темы исследования
Бактериофаги в настоящее время начинают широко использоваться в различных областях медицины: акушерстве и гинекологии, урологии, хирургии, офтальмологии, отоларингологии, травматологии, комбустиологии, педиатрии. Они относятся к препаратам биологического действия.
Бактериофаги гораздо более специфичны, чем большинство антибиотиков. Будучи нацелены на конкретные бактерии, они не вызывают повреждения нормального микробного баланса организма. У многих пациентов с хроническими инфекциями возникает резистентность микрофлоры ко всем известным антибиотикам, в связи с чем клиницисты считают целесообразным дополнение антибиотикотерапии фаготерапией. Применение бактериофагов в
такой ситуации, приводящее к гибели бактерий, может даже восстановить чувствительность микрофлоры к антибиотикам.
В стоматологии, в частности пародонтологии, опубликовано всего несколько работ, касающихся применения бактериофагов, причем в этих работах нет сведений о таких важных параметрах их применения как время экспозиции, кратность и длительность [Михайлова Е.Г., 2011, Бондаренко Е.А., 2011].
Таким образом, сравнительная оценка эффективности традиционно используемых антибактериальных средств и бактериофагов на различных этапах лечения и для профилактики воспалительных заболеваний пародонта и отработка параметров их применения является актуальной.
Цель исследования
Повышение эффективности комплексного лечения и профилактики начальных форм воспалительных заболеваний пародонта с применением бактериофагов.
Задачи исследования
1. Определить устойчивость пародонтальной микрофлоры к
антибактериальным препаратам и эффективность геля «Фагодент» в отношении
антибиотикорезистентных штаммов.
-
Изучить in vitro антимикробную активность геля «Фагодент» по сравнению с различными антисептиками и возможность их совместного применения.
-
Отработать параметры местного применения геля «Фагодент» при гингивите и пародонтите легкой степени: время экспозиции и длительность курса применения.
4. Обосновать целесообразность включения геля «Фагодент» в комплекс
лечебных мероприятий при воспалительных заболеваниях пародонта для
сокращения сроков купирования воспалительного процесса и продления сроков
ремиссии.
5. Разработать методику и показания к применению геля «Фагодент» для профилактики начальных форм воспалительных заболеваний пародонта.
Научная новизна
Впервые in vitro показана антимикробная активность бактериофагов в
отношении антибиотикорезистентных микроорганизмов пародонтальных
карманов.
Впервые in vitro изучена антимикробная активность геля «Фагодент» при совместном его применении с различными антисептиками.
Впервые по данным клинико-микробиологических исследований проведено научное обоснование времени экспозиции геля «Фагодент» и продолжительности курса его применения при начальных формах воспалительных заболеваний пародонта.
Впервые изучен эффект клинического применения геля с бактериофагами у
пациентов с хроническим катаральным гингивитом и хроническим
генерализованным пародонтитом легкой степени для купирования
воспалительного процесса в тканях пародонта и продления срока ремиссии этих заболеваний.
Впервые проведено сравнительное изучение состава микрофлоры пародонта различными микробиологическими методами (ПЦР-диагностика и масс-спектрометрия).
Теоретическая и практическая значимость работы
По результатам лабораторных исследований показана высокая
антимикробная активность геля с бактериофагами, в том числе по отношению к
антибиотико-резистентным штаммам бактерий, а также возможность его
использования совместно с большинством антисептических средств, за
исключением перекиси водорода и октенисепта, которые полностью
инактивируют бактериофаги.
Применение геля с бактериофагами у пациентов с начальными формами ВЗП не вызывает негативных реакций местного или общего характера, что позволяет рекомендовать гель «Фагодент» для применения в пародонтологии.
Были установлены параметры применения геля «Фагодент» при хроническом катаральном гингивите и хроническом генерализованном пародонтите легкой степени: оптимальное время экспозиции – 10 минут, продолжительность курса применения геля – 10 дней.
Клинико-лабораторные исследования показали высокую эффективность геля
«Фагодент» для лечения, профилактики обострений и увеличения
продолжительности ремиссии при начальных формах воспалительных
заболеваний пародонта.
Разработаны практические рекомендации для врачей–стоматологов по использованию геля с бактериофагами «Фагодент» для профилактики обострений ХКГ и ХГПлс.
Методология и методы исследования
Диссертация выполнена в соответствии с принципами и правилами
доказательной медицины. Для обследования пациентов и оценки эффективности
профилактического применения гелей «Фагодент» и «Метрогил Дента»
применялись современные методики: клинические, рентгенологические
(ортопантомография), микробиологические (масс-спектрометрия
микроорганизмов зубодесневой борозды при хроническом катаральном гингивите и пародонтальных карманов при хроническом генерализованном пародонтите легкой степени и ПЦР-анализ пародонтопатогенных бактерий). Объектом исследования были 110: пациентов 55 с хроническим катаральным гингивитом (ХКГ) и 55 с хроническим генерализованным пародонтитом легкой степени (ХГПлс) в возрасте от 20 до 45 лет. Предмет исследования – эффективность применения средства на основе бактериофагов у пациентов с начальными формами воспалительных заболеваний пародонта.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Лабораторные исследования показали, что у пациентов с воспалительными заболеваниями пародонта гель на основе бактериофагов «Фагодент» оказывает узконаправленное антимикробное действие в отношении патогенной микрофлоры пародонта, в том числе антибиотико-резистентной.
-
Определение общего микробного числа через разные промежутки времени после введения геля «Фагодент» в область пародонта позволило установить оптимальное время экспозиции - 10 минут, а результаты клинических наблюдений – определить длительность применения геля – 10 дней.
3. Применение геля «Фагодент» у пациентов с воспалительными
заболеваниями пародонта обеспечивает выраженное антимикробное действие и,
как следствие, оказывает положительное влияние на состояние тканей пародонта,
что выражается в нормализации клинических и микробиологических показателей
без нарушения микробиоценоза полости рта.
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность полученных результатов подтверждается достаточным
объемом клинического материала и использованием современных методов
исследования (клинических, рентгенологических, микробиологических),
адекватных поставленным задачам. Добровольное участие пациентов в исследовании подтверждено их письменным согласием. Статистическая обработка результатов исследования проведена в соответствии с принципами доказательной медицины.
Результаты исследований были доложены на симпозиуме «Федеральная программа профилактики стоматологических заболеваний. Роль гигиениста стоматологического» (Екатеринбург, 2014), на 17-ом международном конгрессе Итальянской Ассоциации Пародонтологов и Имплантологов (Римини, Италия, 2015), на XI Всероссийской научно-практической конференции «Сибирский стоматологический форум» «Инновационные подходы к образованию, науке и практике в стоматологии» (Красноярск, 2015), на XXII Российском национальном
конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2015), на научной конференции «Клуб
пародонтологов» (Москва, 2015), на международном конгрессе «Europerio-8»
(Лондон, Великобритания, 2015), на VII международной конференции
«Современные аспекты реабилитации в медицине» (Ереван, Армения, 2015), на
научной конференции «Клуб пародонтологов» (Москва, 2015), на 19-ом
национальном конгрессе Итальянской Ассоциации Пародонтологов и
Имплантологов (Турин, Италия, 2016), на VII научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы стоматологии и челюстно-лицевой хирургии» (Москва, 2016), на общеинститутской конференции ЦНИИС и ЧЛХ (Москва, 2016, 2017), на 18-ом международном конгрессе Итальянской Ассоциации Пародонтологов и Имплантологов (Римини, Италия, 2017), на международном конгрессе Французской Ассоциации Пародонтологов и Имплантологов «The PINK matter» (Тулуза, Франция, 2017).
Апробация диссертации состоялась 29 мая 2017г. на заседании сотрудников
структурных подразделений: отделения пародонтологии, отделения кариесологии
и эндодонтии, отделения терапевтической стоматологии, отделения заболеваний
слизистой оболочки рта, отделения профилактики стоматологических
заболеваний, лаборатории микробиологии ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» Минздрава России.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования внедрены в клиническую практику отделения пародонтологии ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» Минздрава России, сети клиник «ЛидерСтом» (Москва).
На основании результатов проведенного исследования совместно с производителями геля «Фагодент» были внесены изменения и дополнения в инструкцию к препарату.
Личный вклад автора
Автор принимал непосредственное участие в анализе литературных данных по теме исследования, самостоятельно проводил клиническое обследование пациентов, их динамическое наблюдение с индексной оценкой состояния тканей
пародонта, самостоятельно проводил забор биологических образцов поддесневого содержимого для микробиологических исследований (в общей сложности – 980 образцов). Автор принимал непосредственное участие в лечении пациентов, анализе полученных результатов и их статистической обработке, а также в подготовке материалов диссертации для публикаций и докладов.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, из которых 8 статей в журналах, входящих в перечень ВАК РФ и 6 – в зарубежных изданиях.
Объем и структура работы
Микробиологические методы исследования, используемые в пародонтологии
Существует несколько теорий возникновения воспалительных заболеваний пародонта, но ни у кого не вызывает сомнений, что развитие этих заболеваний напрямую связанно с микрофлорой полости рта, а конкретно с микроорганизмами зубного налета и зубного камня. Именно микрофлора зубной бляшки рассматривается как ведущий фактор, вызывающий развитие воспалительного процесса в пародонте [8, 13, 18, 19, 34, 37, 48, 51, 52, 53, 55, 72, 157, 170, 177, 195, 196, 207, 242, 243, 250, 252, 253, 259, 260, 273].
В 1965 году Н.Е. Le с соавторами опубликовал результаты классического экспериментального исследования, которое обосновывает бактериальную этиологию воспалительных заболеваний пародонта. Для этого у пациентов с интактным пародонтом отменяли все гигиенические процедуры, после чего у них происходило интенсивное накопление зубных отложений и в течение 10-20 суток развивались клинические проявления острого катарального гингивита. После возобновления гигиенических процедур десна возвращалась к исходному состоянию. Этот факт был подтвержден и другими исследователями [201, 243].
В последующие годы многочисленными исследованиями была выявлена прямо пропорциональная зависимость развития воспалительных заболеваний пародонта от количества зубных отложений и обратно пропорциональная их связь с эффективностью используемых гигиенических мероприятий [26, 37, 48, 49, 55, 63, 107, 122, 136, 157, 213].
В 1976 году W. Loesche выдвинул две теории микробного фактора: неспецифического микробного состава и специфического. Первая теория заключается в том, что состояние тканей пародонта зависит от «количества повреждающих веществ вырабатываемых бактериями». Пока количество «повреждающих агентов» не превышает защитные способности слюны и пародонта, он остается интактным. В соответствии с этой теорией состояние тканей пародонта зависит от уровня гигиены рта и состояния макроорганизма.
Вторая теория – теория специфического микробного состава - предполагает, что только наличие определенных бактерий в налете определяет его патогенность.
Socransky S. (1979) установил, что возникновение воспалительных заболеваний пародонта объясняется патогенным воздействием некоторых бактерий, которые были названы пародонтопатогенами, поскольку они оказывают выраженное повреждающее действие на пародонт. Им же были описаны так называемые микробные комплексы бактерий: красный, зеленый, желтый, пурпурный, оранжевый [211, 274].
Оранжевый комплекс включает в себя Prevotella intermedia, Prevotella nigrescen, Campylobacter rectus, Peptostreptococcus micros, Campylobacter spp. Красный комплекс - Tannerella forsythia, Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola. Желтый комплекс - Streptococcus israilis, Streptococcus mitis, Streptococcus sanguis. Пурпурный комплекс - Actinomyces odontolvticus, Veillonella parvula. Зеленый комплекс - Еikenella corrodens, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Capnocytophaga spp.
Было показано, что самой высокой патогенностью и особо агрессивным воздействием на пародонт обладают Porphyromonas gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Treponema denticola и Tannerella forsythia [192, 193, 211, 220, 285]. Присутствие этих микроорганизмов обуславливает сильную кровоточивость десен и быстрое течение деструктивных процессов в пародонте. Формирование комплексов с этими микроорганизмами Socransky S. назвал «конечной стадией» развития патогенности и устойчивости микроорганизмов к защитным системам хозяина.
Фактором вирулентности Aggregatibacter actinomycetemcomitans является лейкотоксин, который вызывает лизис нейтрофилов и ускоряет апоптоз макрофагов. Prevotella intermedia продуцирует фосфолипазу А, нарушающую целостность эпителиальных клеток, и вырабатывает протеолитические ферменты, что играет основную роль в возникновении пародонтальных абсцессов [13, 18, 48, 120, 139, 140, 157].
Липополисахарид Porphyromonas gingivalis вызывает продуцирование большего количества цитокинов [283]. Инвазия его в десневые эпителиоциты подавляет секрецию интерлейкина-8, что ослабляет естественную защиту пародонта. Поскольку макроорганизм при этом лишается сигнала о присутствии бактерий, то не направляет лейкоциты для их уничтожения [176].
Tannerella forsythia продуцирует трипсиноподобные ферменты, которые разрушают коллагеновые структуры тканей пародонта, а Treponema denticola способствует выработке металлопротеиназ из полимофноядерных лейкоцитов, которые приводят к деструкции межклеточного вещества соединительной ткани, а также могут агглютинировать и лизировать эритроциты. Доказана способность Treponema denticola активировать макрофаги, которые в свою очередь вырабатывают вещества, способствующие резорбции коллагена, что на фоне нарушенной функции нейтрофилов вызывает глубокие поражения [268].
В 2004 году Н.Р. Muller указал на значение синергизма и антагонизма между пародонтопатогенами и другими микроорганизмами полости рта. Было установлено, что микрофлора имеет особые патогенные свойства, существуя в ассоциациях, что подтвердили и другие исследователи [159, 204, 215, 216, 254, 256]. Повышенная устойчивость микробных связей объясняется их существованием в виде вязких биопленок. Между бактериями биопленки развиваются определенные взаимоотношения: обмен питательными веществами и генетической информацией [93]. Mc Dongall (1963), изучая микроскопическое строение микробной бляшки показал, что полностью сформированная зубная бляшка образуется через 6-9 дней и состоит из массы бактерий, которые по отношению к поверхности зуба располагаются строго под прямым углом. Образование микробной пленки и инвазия пародонтопатогенов в пародонтальные ткани – сложный процесс [64, 93, 146].
Характеристика материалов
Литическую активность бактериофагов определяли методом spot-тестирования на материале полученном из ПК 40 пациентов с ХГП различных степеней тяжести. Забор материала проводили из области максимально выраженного очага воспаления пародонта у каждого пациента. Микробиологическое исследование проводили в лаборатории НПЦ «МикроМир». Методом spot-тестирования определяли спектр антимикробного действия фагов с использованием выделенных штаммов. Для этого клинический образец в объеме 0,2 мл рассевали на стерильные агаровые пластинки (агар Brain Heart Infusion с добавлением 5% гемолизированной бараньей крови). Посевы растирали шпателем для получения сплошного бактериального газона, в центр которого наносили 1 каплю геля «Фагодент». Чашки с посевами инкубировали в соответствии со стандартными сроками и условиями культивирования. Учет результатов: антимикробную активность регистрировали по наличию или отсутствию роста культуры в месте нанесения капли средства с бактериофагами (Рисунок 5). Наличие зоны лизиса в месте нанесения геля «Фагодент» расценивали как положительный результат, а её отсутствие – как отрицательный.
Активность препарата оценивали, подсчитывая количество образцов с положительным spot-тестированием, после чего высчитывали процент от общего числа образцов.
Изучали литическую активность бактериофагов, содержащихся в геле «Фагодент», при его одновременном использовании с антисептиками: 0,05% и 0,2% хлоргексидином, 3% перекисью водорода, 0,01% мирамистином, 2% диоксидином, октенисептом, ополаскивателем Листерин. В качестве модельных штаммов был взят: Staphylococcus aureus.
Исследуемые антисептики смешивали с гелем «Фагодент» в соотношении 1:1, инкубировали при комнатной температуре в течение 24 часов, после чего проводили выделение бактериофагов и титрование по Грациа. В качестве контроля был использован физиологический раствор. Литическую активность бактериофагов определяли по концентрации фаговых частиц путём стандартного титрования по Грациа в бляшкообразующих единицах на сантиметр кубический (БОЕ/см3). Исследования проводили с антисептиками в чистом виде, в 2-х, 5-ти и 10-кратном разведении и в трёхкратном повторении.
Определение оптимального времени экспозиции гелей «Фагодент» и «Метрогил Дента» проводили в условиях строго клинического контроля используя методику определения биологической концентрации микрофлоры тканей пародонта по подсчету общего микробного числа у 40 пациентов – 20 пациентов с ХКГ и 20 пациентов с ХГПлс. Биологическую концентрацию исследовали методом высева культуры на плотные питательные среды при последовательных десятикратных разведениях. Подсчёт выросших колоний проводили на тех чашках, в которых число выросших колоний не превышало 100. Опыт ставили в трех повторениях и рассчитывали среднее арифметическое значение. Биологическую концентрацию рассчитывали по формуле: количество выросших колоний 10 порядок разведения.
Забор материала для микробиологического исследования проводили в области зубов с наиболее выраженным воспалением до введения гелей и через 5, 10, 15 и 20 минут после введения геля «Фагодент», и через 10, 20, 30, 40 и 50 минут после введения геля «Метрогил Дента» (Овчинникова В.В., 2001). Полость рта пациентов изолировали от слюны, после чего проводили забор материала стерильными бумажными эндодонтическими штифтами №25, которые погружали в ЗБ или ПК до его дна и оставляли на 10 сек. После чего штифты помещали в транспортные среды, которые отправляли в лабораторию «МикроМир», где в образцах проводили подсчет общего микробного числа. 2.4.1.5 Микробиологические исследования клинических групп пациентов
Микробиологические исследования проведены у 110 пациентов с ХКГ и ХГПлс методом ПЦР-диагностики и масс-спектрометрии (МСМ).
Микробиологические исследования в клинических группах проводили до начала исследования, через 1 неделю и 1, 3, 6 и 12 месяцев после проведения ПГ. Забор материала для исследований проводили в области зубов с наиболее выраженным воспалением десны с помощью бумажных штифтов № 25 по стандартам ISO, вводя их стерильным пинцетом в ЗБ (у пациентов с ХКГ) или ПК (у пациентов с ХГПлс) на 7–10 секунд. Полученный материал помещали в 2 пробирки (первая с жидкой питательной средой Brain Heart Infusion Broth (для аэробов). вторая пробирка транспортная угольная среда (для анаэробов)), которые плотно закрывали, маркировали и транспортировали в лабораторию научно-производственного центра «МикроМир», где проводили исследование полученных образцов.
В лаборатории осуществляли параллельный рассев образцов на питательную среду Brain Heart Infusion с добавлением 10% стерильной дефибринированной крови. Посевы инкубировали в аэробных и анаэробных условиях и идентифицировали микроорганизмы.
Метод ПЦР – позволяет получить множество копий специфического фрагмента ДНК в пробирке (in vitro). Он основан на трехэтапном циклическом процессе: денатурация, гибридизация праймеров, полимеризация, или элонгация, цепи ДНК, в результате которого многократно увеличивается количество специфического фрагмента ДНК [88, 98, 121, 125] (Рисунок 6).
ПЦР-тестирование клинического материала проводили «в реальном времени» с использованием набора праймеров фирмы «Литех» (Рисунок 7) к 5 пародонтопатогенам Prevotella intermedia (P.i.), Treponema denticola (T.d.), Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A.a.), Porphyromonas gingivalis (P.g.), Fusobacterium nucleatum (F.n.).
Результаты изучение чувствительности микрофлоры пародонтальных карманов к антибиотикам
При внутриротовом осмотре особое внимание обращали на анатомо-функциональные нарушения, имеющие патогенетическое значение в развитии воспалительных заболеваний пародонта.
Учитывая выявленные особенности большинству пациентов помимо лечения у пародонтолога требовались консультации врачей смежных специальностей: хирурга-пародонтолога (при выявлении нарушений строения преддверия полости рта и прикрепления уздечек губ), ортодонта (при скученности зубов и патологии прикуса), ортопеда (при частичных дефектах зубных рядов) (Таблица 14).
Для объективизации пародонтологического статуса пациентов нами были использованы пародонтологические индексы (S-L и Muhlemann). Кроме того, мы проводили забор материала из ЗБ или ПК в области зубов с наиболее выраженным воспалением для проведения микробиологических исследований – ПЦР-диагностики и МСМ.
После клинико-рентгенологического обследования и установления диагноза всем пациентам проводили гигиеническое обучение и ПГ, используя аппарат Пьезон Мастер - 400 с 0,05% раствором хлоргексидина, с последующим полированием шеек зубов.
Пациенты (с ХКГ и ХГПлс) были разделены на 3 группы наблюдения: основная группа - пациентам, которым вводили гель «Фагодент», группа сравнения - пациентам, которым вводили гель «Метрогил Дента», и контрольная группа, в которой гели не использовались (лечение ограничивалось только гигиеническим обучением и проведением ПГ). Курс применения гелей определяли по клинической нормализации состояния пародонта. После проведения ПГ динамические наблюдения проводили в сроки: 1 неделя, 1,3,6 и 12 месяцев.
При внутриротовом осмотре пациентов с ХКГ отмечали гиперемию и отечность десны, ее болезненность и кровоточивость при зондировании, наличие мягкого налета и зубного камня. Рентгенологически у 76% пациентов этой группы изменений со стороны костной ткани выявлено не было, у 24% был выявлен остеопороз вершин гребней межальвеолярных перегородок, без снижения их высоты. При внутриротовом осмотре пациентов с ХГПлс определялась гиперемия и отечность десны, ее болезненность и кровоточивость при зондировании, наличие ПК глубиной до 4 мм. У 1,8% пациентов была выявлена подвижность зубов I степени (в основном нижних фронтальных).
У 63% пациентов рентгенологи при описании ортопантомограмм отмечали «начальные проявления пародонтита», у 32% - «резорбцию вершин межальвеолярных перегородок», у 3% - снижение межальвеолярных перегородок на 1/3 длины корней зубов.
Сразу после проведения гигиенического обучения и ПГ пациентам основной группы и группы сравнения ежедневно 1 раз в день вводили гели в ЗБ при ХКГ и в ПК при ХГПлс. Время экспозиции для геля «Фагодент» составляло 10 минут, для геля «Метрогил Дента» - 30 минут, что соответствует ранее полученным данным. На каждом последующем приеме выясняли жалобы пациентов и проводили внутриротовой осмотр с обязательным определением индексов (S-L и Muhlemann). Длительность курса использования гелей определяли по нормализации клинического состояния тканей пародонта.
После проведения ПГ у 26,3% пациентов (с ХКГ и ХГПлс) были жалобы на повышенную чувствительность шеек зубов на температурные раздражители, которая сохранялась первые 2 дня. На 3-й день жалобы на повышенную чувствительность шеек зубов предъявляли 20% пациентов; на 7 день - 11,25% , на 10 день только 1 пациент (1,25%) группы сравнения с ХГПлс. При внутриротовом осмотре у всех пациентов после проведения ПГ отмечали значительное снижение индекса S-L: при ХКГ с 2,9 до 1,3; при ХГПлс с 2,9 до 1,2. На каждом последующем приеме обращали внимание пациентов на те участки, которые были недостаточно очищены. В последующие посещения индекс гигиены у пациентов постепенно снижался, при этом динамика его показателей при ХКГ и ХГПлс была однотипной и значимых изменений по группам выявлено не было: с 3 по 5 день его средние значения при ХКГ были – 0,9; при ХГПлс – 1,1; с 5 по 7 день 0,9 и 1,0 соответственно, к 10-му дню у всех пациентов индекс S-L снижался до 0.
При внутриротовом осмотре с 1 по 4 день у всех пациентов отмечали гиперемию и отечность десны, кровоточивость её при зондировании: средние значения индекса Muhlemann в основной группе при ХКГ снижались с 2,8 до 2,1; в группе сравнения с 2,5 до 1,9; при ХГПлс в основной группе с 3,0 до 2,2; в группе сравнения с 2,9 до 2,6.
На 5 день у 1 пациента группы сравнения с ХКГ отмечали нормализацию состояния тканей пародонта: десна приобретала бледно-розовый цвет, плотно прилегала к шейкам зубов, кровоточивость при зондировании отсутствовала (индекс Muhlemann = 0). У остальных пациентов сохранялась незначительная отечность десны и её кровоточивость при зондировании. При ХКГ в основной группе средние значения индекса Muhlemann равнялись 1,7; в группе сравнения –1,6; при ХГПлс – 1,8 и 1,9 соответственно. В последующие дни количество пациентов, у которых происходила нормализация состояния тканей пародонта и индекс Muhlemann достигал нуля, постепенно увеличивалось.
На 6 день индекс Muhlemann = 0 у 3 пациентов (при ХКГ - 2 пациента основной группы, 1 пациент группы сравнения), средние его значения у остальных пациентов были при ХКГ в основной группе и группе сравнения – 1,4; при ХГПлс – 1,5 в основной группе и 1,6 в группе сравнения.
На 7 день индекс Muhlemann = 0 у 6 пациентов (в основной группе у 3 пациентов с ХКГ и 1 с ХГПлс, в группе сравнения у 2 пациентов с ХКГ). Средние значения индекса Muhlemann у остальных пациентов при ХКГ в основной группе было равно 1,1, в группе сравнения – 0,9; при ХГПлс – 1,8 и 1,7 соответственно.
На 8 день индекс Muhlemann = 0 у 8 пациентов (в основной группе у 3 пациентов с ХКГ и 2 с ХГПлс; в группе сравнения у 2 пациентов с ХКГ и 1 с ХГПлс), значения индекса у остальных пациентов при ХКГ в основной группе были равны 0,7, в группе сравнения – 0,8; при ХГПлс – 1,3 и 1,4 соответственно.
На 9 день индекс Muhlemann = 0 у 20 пациентов (в основной группе у 5 пациентов с ХКГ и 4 с ХГПлс, в группе сравнения у 6 пациентов с ХКГ и 5 с ХГПлс;), значения индекса у остальных пациентов при ХКГ в основной группе были равны 0,2, в группе сравнения – 0,3; при ХГПлс – 0,6 и 0,7 соответственно.
Динамика выявления пародонтопатогенов у пациентов с ВЗП
При динамическом наблюдении соотношение между нормальной флорой, условно-патогенной и патогенной менялось в сторону увеличения первой.
У пациентов с ХГПлс в основной группе через 1 неделю количество нормальной флоры увеличилось с 36% до 46% за счёт уменьшения условно-патогенной (с 24 до 20%) и патогенной (с 40% до 34%) флоры. Через 1 месяц мы наблюдали значительный рост нормальной и условно-патогенной флоры до 61% и 23% соответственно и уменьшение числа патогенной до 16%. Через 3 месяца отмечали некоторое снижение нормофлоры до 57% и увеличение до 19% патогенной, величина условно патогенной флоры менялась незначительно (с 23% до 24%). Через 6 месяцев происходило дальнейшее снижение нормальной флоры до 54%, увеличение числа условно-патогенной и патогенной флоры до 25% и 21%. Через 12 месяцев отмечалось незначительное уменьшение нормальной флоры до 52% в основной группе и увеличение условно-патогенной и патогенной флоры до 26% и 22%.
В группе сравнения через 1 неделю количество нормальной флоры увеличилось с 40 до 46% за счёт уменьшения условно-патогенной флоры с 21 до 19% и патогенной с 39 до 35%. Через 1 месяц наблюдался дальнейший рост нормальной и условно-патогенной флоры до 57% и 21% соответственно и уменьшение числа патогенной до 22%. Через 3 месяца мы отмечали некоторое снижение нормофлоры до 55% и увеличение условно-патогенной и патогенной флоры до 22% и 23% соответственно. Через 6 месяцев определяется дальнейшее снижение нормальной флоры до 52% и увеличение числа условно-патогенной и патогенной флоры до 26% и 22% соответственно. Через 12 месяцев определяется дальнейшее снижение нормальной флоры до 49% и увеличение числа условно-патогенной и патогенной флоры до 28% и 23% соответственно.
В контрольной группе прослеживалась та же тенденция: увеличение нормальной флоры с 36% до 40% через 1 неделю, до 53% через 1 месяц, после чего происходило постепенное снижение до 51% в срок 3 месяца, до 42% в срок 6 месяцев, до 38% в срок 12 месяцев. Соответственно изменялись и значения патогенной флоры: сначала происходило её снижение – через 1 неделю с 41 до 35%, через 1 месяц до 25%, через 3 месяца до 24%, затем отмечался рост до 31% через 6 месяцев и до 34% через 12 месяцев. Количество условно-патогенной флоры в группе контроля на всём протяжении времени наблюдения менялось незначительно: исходные значения - 23%, через 1 неделю – 25%, через 1 месяц -22%, через 3 месяца – 25%, через 6 месяцев – 27%, через 12 месяцев – 28%.
При сравнении по группам наблюдений было выявлено, что в срок 1 месяц во всех группах выявлено максимальное увеличение количества нормальной флоры и уменьшение патогенной. В срок 3 месяца во всех группах отмечается некоторое уменьшение нормальной флоры (с 61 до 57% в основной группе, с 57 до 55% в группе сравнения и с 53 до 51% в контроле). При этом наблюдается соответственное увеличение условно-патогенной и патогенной флоры. Через 6 и 12 месяцев эта тенденция сохраняется во всех группах, однако количество нормофлоры во всех группах остаётся выше исходных показателей: 52% при исходных 36% для основной группы, 49% при исходных 40% в группе сравнения и 38% при исходных 36% в контроле). Наиболее выраженные положительные результаты были нами получены в основной группе.
Таким образом, при динамическом наблюдении у пациентов с ХГПлс происходит увеличение нормофлоры во всех группах наблюдения в срок 1 месяц основной группе количество нормофлоры увеличивается по сравнению с исходными значениями на 25%, в то время как в группе сравнения и контроля -на 17%. В отдаленные сроки отмечается постепенное снижение нормофлоры во всех 3-х группах наблюдения. Однако, в срок 12 месяцев в основной группе количество нормофлоры остается на 16% выше исходных значений, в то время как в группе сравнения – на 9%, а в контроле – всего на 2%. В отношение патогенной микрофлоры в срок 12 месяцев в основной группе её количество остается ниже исходных значений на 18%, в группе сравнения – на 16%, а в контроле – на 7%. Таким образом, применение геля «Фагодент» у пациентов с ХГПлс дает более выраженный и стабильный результат в отношении нормофлоры ПК. Результаты МСМ отчетливо показали изменение соотношения микроорганизмов у пациентов с ХКГ и ХГПлс после проведения ПГ. Наиболее выраженные результаты были получены в группах, в которых пациентам вводили гель с бактериофагами «Фагодент». В срок 12 месяцев количество нормофлоры у них было выше исходных значений на 17% при ХКГ и на 16% ХГПлс, за счет снижения патогенной - значения её в тот же срок уменьшились от исходных на 15% при ХКГ и на 18% при ХГПлс.
В группе сравнения, пациентам которой вводили гель «Метрогил Дента», эти показатели были скромнее. В срок 12 месяцев количество нормофлоры было выше исходных показателей всего на 2% при ХКГ и на 9% при ХГПлс, значения патогенной микрофлоры в тот же срок уменьшились на 6% при ХКГ и на 16% при ХГПлс.
В группе контроля в отдаленные сроки наблюдения (12 месяцев) изменения нормофлоры было незначительным как при ХКГ так и ХГПлс: её увеличение составило всего 2% от исходных значений, а количество патогенной микрофлоры в этот срок вернулось к исходным значениям.
Результаты клинико-лабораторных исследований показали, что применение геля с бактериофагами «Фагодент» приводит к снижению индексов, определяющих воспаление в тканях пародонта (на 46-50%), снижению числа пародонтопатогенов (на 75% при ХКГ и 60% при ХГПлс) и увеличению количества нормофлоры (на 17% при ХКГ и 16% при ХГПлс за счет сокращения патогенной и условно-патогенной). Динамическое наблюдение (до 12 месяцев) показали, что курс применения геля «Фагодент» позволяет получить более выраженный и стабильный положительный результат по сравнению с использованием геля «Метрогил Дента». Таким образом, использование бактериофагов при ХКГ и ХГПлс позволило получить значительно более выраженный и стабильный эффект (Рисунок 25-28).