Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы слюна как биоматериал для диагностики 7
1.1. Роль слюнных желез в гомеостазе организма и тканей полости рта... 7
1.2. Состав и свойства слюны и ротовой жидкости при некоторых патологических состояниях 9
1.3. Кристаллографические исследования биожидкостей 14
1.4.Общие сведения о кристаллографии и свойствах кристаллов 17
1.5. Жидкокристаллическая структура слюны 21
1.6. Компоненты слюны, влияющие на ее структурную и кристаллобразующую функцию 22
17. Сахарный диабет. Этиология, патогенез, клиника 28
1.7.1. Изменения слюнных желез при сахарном диабете 31
1.7.2. Экспериментальные исследования 36
Глава 2. Материал и методы исследования 41
2.1. Объекты исследования 41
2.2. Материалы исследования 51
2.3. Получение препаратов кристаллограмм слюны 52
2.4. Методы исследований 52
2.5.Текстурный анализ 54
2.6. Многомерный статистический анализ 57
Глава 3. Собственные исследования 61
3.1. Кристаллизация ротовой жидкости в норме 61
3.2. Кристаллизация ротовой жидкости у больных с сахарным диабетом 79
3.3. Сахарный диабет П типа 91
Выводы 111
Практические рекомендации 112
Список литературы 113
- Состав и свойства слюны и ротовой жидкости при некоторых патологических состояниях
- Кристаллографические исследования биожидкостей
- Получение препаратов кристаллограмм слюны
- Кристаллизация ротовой жидкости у больных с сахарным диабетом
Введение к работе
Исследования последних лет показали большую распространенность диабета во всех странах мира (от 1,5 до 3% всего населения). По данным различных источников, количество больных диабетом в мире превысило 177 млн. человек, а по данным экспертов ВОЗ, к 2025 оно составит 300 млн. человек. Рост заболеваемости сахарным диабетом, большая частота осложнений и повышение трудозатрат на их лечение, увеличение инвалидизации трудоспособного населения страны определяют актуальность данной проблемы, ее медико-социальную и экономическую значимость. (Балаболкин М.И., 1998; Беляков Ю.А., 1983; Дедов И.И., 1995; Мазовецкий АХ., Беликов BJC, 1987; «О мероприятиях по реализации федеральной целевой программы «Сахарный диабет», Приказ МЗ РФ №340 от 25.11.98; Питер Дж.Уоткинс, 2000).
В настоящее время для установления правильного диагноза при различных видах патологии (воспалительных, опухолевых, сосудистых заболеваниях, травм мозга, болевых синдромах и др.) в качестве дополнения к другим диагностическим методам используется кристаллографический метод исследования. Суть его состоит в анализе фигур кристаллизации, образующихся при высушивании различных биологических жидкостей (слюна, слеза, моча и др.) (Deams,1964; Неретин В.Я., Кирьяков В.А., 1977; Мороз Л.А. и др.,1981). Также этот метод нашел применение в фармакологии (Фигуровский Н.А., Борисова В.Г., 1957), в гигиенических исследованиях (Кожинова Л А,, Масленникова Л.С.Д968), в судебной медицине (Степанов А.В., 1951; Швайкова М.Д., 1959). Способ уже применяется в стоматологии. С его помощью изучался патогенез ряда стоматологических заболеваний: кариеса, (Леус П. А,, 1977,1983; Токуева Л.И,, Кузьмина Л.Н., 1990), красного плоского лишая (Ярвиц А. А., 1994).
За последние годы была разработана унифицированная методика изучения и оценки фигур кристаллизации слюны (Барер Г,М., Денисов АЛх,
5 2000; Стурова Т.М., 2003).
Вместе с тем, анализ выполненных работ свидетельствует о несопоставимости результатов на основании использовавшихся методов получения кристаллических структур, не разработаны критерии описания результатов. Поэтому данные противоречивы и нужны новые методические исследования.
Нами не обнаружено сведений относительно изучения кристаллизации слюны при сахарном диабете.
Цель исследования.
Определить критерий диагностики и дифференциальной диагностики сахарного диабета I и II типа по оценке фигур кристаллизации слюны.
Задачи исследования.
Разработать критерий описания морфологии кристаллизации.
Оценить влияние сахарного диабета на стоматологический статус, в том числе и на морфологию кристаллов слюны.
Определить основные морфологические виды кристаллов слюны при различных типах сахарного диабета с целью дифференциации по типу кристаллов между собой.
Научная новизна исследования.
Впервые будет проведен сравнительный анализ морфологии кристаллизации слюны у здоровых лиц и больных сахарным диабетом I и I типа. Будут разработаны дифференциально - диагностические критерии кристаллизации слюны между I и I типами сахарного диабета.
При многомерном статистическом анализе установлено, что кристаллические агрегаты слюны разделяются на норму и патологию при сахарном диабете I и II типа. Кристаллические агрегаты образуют самостоятельные группы, что может служить диагностическим критерием.
6 Практическая значимость.
Применение унифицированной методики кристаллизации слюны позволит избежать использования дорогостоящей аппаратуры в диагностике и дифференциальной диагностике эндокринных заболеваний. Но для широкой клинической практики метод пока не пригоден, так как требует большого количества экспертных морфометрических измерений, необходимых приспособлений для получения изображения кристаллограмм, а также компьютеров со специальной программой многомерного статистического анализа. В дальнейшем метод является перспективным для исследования кристаллографии при других видах патологии, а также разработки специальной компьютерной программы для автоматизированного анализа кристаллограмм.
Внедрение результатов.
Результаты исследований внедрены в учебный процесс на дневном и вечернем отделениях стоматологического факультета, на курсах повышения квалификации врачей - стоматологов и преподавателей ФПДО МГМСУ.
Основные положения, выносимые на защиту диссертации.
Дендровидные и другие микрокристаллы смешанной слюны могут быть экспертно описаны, как количественно, так и качественно.
Использование многомерной статистики позволяет четко разделить кристаллографическую картину нормы и патологии.
Кристаллографическая картина « нормы » не зависит от пола и возраста.
При сахарном диабете I и П типа образуется нозологически — специфичный набор вариантов микрокристаллов, что может использоваться для диагностических целей.
Состав и свойства слюны и ротовой жидкости при некоторых патологических состояниях
По своей химической природе слюна это раствор: однородная смесь нескольких веществ, а компонент находящийся в избытке называется растворителем (Советский энциклопедический словарь, 1990, С. 1115). «Растворителем» в слюне является вода. Вся слюна состоит из 94 % воды и 6 % сухого вещества, 1/3 которого составляют неорганические и 2/3 органические вещества. По концентрации растворенного вещества растворы подразделяются на насыщенные, ненасыщенные и перенасыщенные. По этой классификации, слюна является раствором перенасыщенным ионами Са2+ и НРОг ,что является основным механизмом поддержания постоянства состава эмали зубов (В.К. Леонтьев, 1978). Для различных целей оценивают как физические, так и химические показатели слюны. Величины этих показателей в свою очередь служат для: 1. оценки нормы или патологии собственно СЖ (А.В. Шипский, В.В. Афанасьев; 1997). 2. диагностики различных соматических заболеваний (см. таблицу 2); 3. в экспериментальной фармакологии (К.М. Лакин и др., 1987). 4. оценки «здоровья» человека (P.M. Баевский, 1979, Morse и соавт.1984); 5. экологического мониторинга (И.М. Макеева, 1992; Е.В. Евстафьева, 1996; Ю.Л. Образцов, 1997); Химические и биохимические показатели слюны. В зависимости от целей и задач исследований в слюне могут определены практически все химические элементы. Состав слюны (неорганические и органические компоненты) достаточно полно охарактеризован (А.Б.Денисов. 2003: 1996, Buddecke Е. , 1981; Saliva and dental health., 1990). В качестве «критериев» могут быть использованы как качественные (появление/исчезновение признака), таге и количественные показатели. По своей химической природе слюна это раствор: однородная смесь нескольких веществ, а компонент находящийся в избытке называется растворителем (Советский энциклопедический словарь, 1990, С. 1115). «Растворителем» в слюне является вода.
Вся слюна состоит из 94 % воды и 6 % сухого вещества, 1/3 которого составляют неорганические и 2/3 органические вещества. По концентрации растворенного вещества растворы подразделяются на насыщенные, ненасыщенные и перенасыщенные. По этой классификации, слюна является раствором перенасыщенным ионами Саг+ и НРОг ,что является основным механизмом поддержания постоянства состава эмали зубов (В.К. Леонтьев, 1978). Для различных целей оценивают как физические, так и химические показатели слюны (табл.1). Величины этих показателей в свою очередь служат для: 1. оценки нормы или патологии собственно СЖ (А.В. Шипский, В.В.Афанасьев; 1997). 2. диагностики различных соматических заболеваний (см. таблицу 2); 3. в экспериментальной фармакологии (К.М. Лакин и др., 1987). 4. оценки «здоровья» человека (P.M. Баевский, 1979, Morse и соавт.1984); 5. экологического мониторинга (И.М. Макеева, 1992; Е.В. Евстафьева, 1996; Ю.Л. Образцов, 1997); Много десятилетий, стоматологи используют слюну для оценки риска кариеса, измеряя его буферную способность и содержание бактерий. В последнее время слюна все более и более используется для постановки диагноза системных болезней, которые влияют на функцию слюнных желез и состав слюны, таких как синдром Сегрена, алкогольный цирроз, муковисцидоз, саркоидоз, сахарный диабет и болезни коры надпочечников. Введение метода реакции полимеразных цепей привело к использованию жидкостей полости рта как источник микробной ДНК для обнаружения вирусов (например, вируса герпеса связанный с саркомой Калоши) и бактериями (например, Helicobacter pylori, который вызывает гастрит, язвенную болезнь и возможно рак желудка) (Koelle et al,1997; Refflyetal.,1997). Кроме того, можно установить диагноз инфекционных болезней, по количеству антител к микроорганизмам, найденным в слюне и полости рта. Например, в прошлые 10 лет исследователи показали, что обнаружение в слюне к HTV (Malamud, 1997) представляет собой атравматичную альтернативу к определению количества антител в крови для контроля эффективности антивирусной терапии и прогрессии СПИДа (Shugars et al., 2000). До недавнего времени, передача ВИЧ через слюну инфицированных индивидуумов в течение лечения зубов или как следствие резкого кашля вызывала беспокойство (Baron 2001, Baron et al., 1999). В исследованиях последних лет были найдены Hiv - антитела, антимикробные слюнные факторы защиты и секреторный ингибитор протеазы лейкоцитов, что позволяет полости рта ингибировать ВИЧ инфекцию (Shugars, Wahl , 1998; Shugars 1999). Полученные данные объясняют тот факт, что через слюну не наступает заражение ВИЧ. Кроме того слюна в полости рта гипотонична, что приводит к гибели ВИЧ инфицированных клеток з полости рта (Baron 2001, Baron et al., 1999). Таким образом, уровни белка и соли в слюне служат как важные биомаркеры иммунорезистентности организма.
Кристаллографические исследования биожидкостей
Первое определение химических веществ по их кристаллографическим признакам было выполнено в 1804 г. Т.Е. Ловицом в России. Он обнаружил после испарения на стекле солевых растворов характерный для каждой соли рисунок кристаллов. Затем это явление было забыто и вновь к использованию этого феномена вернулись в середина прошлого столетия. В разных странах, с разными целями, кристаллическими рисунками, образующимися при высушивании химических растворов и биожидкостей заинтересовались биологи и медики. Метод кристаллических налетов нашел применение в фармакологии для качественного анализа лекарств (Фигуровский Н.А. , Борисова В.Г., 1957, Рубинская В. Г, 1961; Рубинская В.Г., Фигуровский Н.А., 1962;Зимнухов В. В. 1964, Никольская М.Н.. Гандель В.Г. , Полков В.А.. 1965; Позднякова В.Т., Головкин В. А.,1965;
Позднякова В.Т., Роговский Д.Ю., Головкин В.АД965; Саломатин Е.М.,1965), в гигиенических исследованиях для идентификации пестиіщдов во внешней среде (Кожшюва Л. А., Масленникова Л.С.,1968). Микрокристаллические реакции используют судебные химики (Степанов А.В., 1951; Швайкова М.Д., 1959, Белова А. В., 1964. Лобанов В.И., 1966; Ильясов ЯЗ., 1966). В медицинской практике кристаллографическое исследование крови впервые было проведено голландскими учеными Daems и Theslgrafle (1964) у больных с гипертрофией и карциномой простаты. В нашей стране указанный метод был впервые использован в 1977 году В.Я. Неретиным и В.А.Кирьяковым при исследовании спинномозговой жидкости у больных с заболеваниями ЦНС. Обзор литературы предполагает, анализ (всесторонний разбор) и сравнение (процедура оценки сходство - различие между объектами) полученных ранее результатов. Но нами обнаружено, что. эти исследования почти не возможно провести по следующим причинам. Во-первых с помощью микрокристаллизации были исследованы различные биологические жидкости (табл.3), свойства которых существенно отличаются друг от друга (например слюна и стекловидное тело). Во вторых равноценно используются три способа, кристаллизации биожидкостей. 1. - кристаллизация при испарении воды из биожидкости слюны: она высушивается на предметном стекле. 2. тсзиграфия - кристаллографический метод исследования основанный на изучении форм кристаллов, полученных при действии кристаллообразующего вещества (обычно это CuCl 2) на биосубстрат. 3. - кристаллизация в «сендвич-ячейке» (образуемой предметным и покровным стеклом), экстракта липидной фракции биожидкости в спиртовом раствора лецитина (лиотропный ЖК). Обобщая данные для таблицы № 2, мы обратили внимание, на то, что, как правило, проведенные исследования не имеют продолжения в практической медицине.
Получение препаратов кристаллограмм слюны
Оценка была выполнена экспертным методом, и кристаллография проходила вручную, без использования математических технологий. Получение изображения кристаллограмм Исследование структуры образцов слюны выполняли с помощью оптического микроскопа Leica DM -LS (Германия) с аналоговой видеокамерой Sony SSC-DC30P , 72 (ppi). Захват изображение проводился с помощью видиоплаты (видиобластера) ASUS 3 DP- V264 GT/ PRO и передавался на экран монитора. Вначале при малом увеличении проводилось сканирование всей поверхности высушенной капли, а затем при большом увеличении исследовались отдельные участки поверхности с различной морфологией. Выбранные участки кристаллограммы записывались в виде графического файла на компьютере со следующими параметрами 362 X 280 пике с 256 градациями яркости («серой» шкалы). Файлы сохранялись как растровое изображение с разрешением 300 dpi в формате BMP. При высушивании слюны (переход ее в твердую фазу) на открытой поверхности возникают характерные (папоротникововидные) кристалжиеские структуры. Образование микрокристаллов неравномерно в различных зонах высушенной капли (Шатохина С.Н., 1995). И, главное, вид кристаллов заметно отличается в них (Михалева И.Н., 2000). Объяснение этого явления связано с влиянием скорости и направления отвода тепла, конвекционные токи жидкости и т.д. (Вегман Е.Ф. и соавт., 1990). Микрофото кристаллограмм сохранялись в виде графических файлов. Для обработки графических изображений использовали программы Adode Photoshop 6,0 HPhotoDraw2000. Полученные биометрические результаты заносились в электронную таблицу Excel 2000 из пакета Microsoft Office 2000 SR-1. Данные анализировали на компьютере с использованием статистических пакетов: STATISTICA -5.0 (StatSoft Inc.USA); модули - основные статистики (Basic statistics/Tables), и кластерный анализ (Cluster analysis). STATGRAPHICS Plus 5.0 (Manugistic Inc.USA) - программы многомерного анализа данных - кластерный анализ (Cluster Analysis), дискриминативный анализ ( Discriminant Analysis). Для оценки нулевой гипотезы был использован критерий t - Стью-дента. Результаты считали достоверными при Р 0,05. В процессе исследования было установлено, что в ряде случаев образования микрокристаллов не происходит, хотя изображение не является гомогенным, а текстурировано (рис. 4а. 46).
А именно при СД І в 30% случаев, а при СД І в 18%. В литературе существуют несколько определений текстур. Мы приводим одно из них принятое в кристаллографии. Агрегат называет тексту pup о ванным, если ориентировка его кристаллитов относительно внешних, координатных осей не является случайной. Максимальный угол разориентировки кристаллитов относительно внешних осей и плоскостей, задающих текстуру, называют углом рассеяния текстуры. Типы текстур: - кольцевая текстура: одна из плоскостей совокупности { hi} каждого кристаллита расположена параллельно внешней оси (нормали к { hi } перпендикулярны оси), обозначение (h,); - аксиальная текстура: эквивалентные направления [Щ всех кристаллитов параллельны внешней оси; обозначения [UJ; - коническая текстура: ось текстуры [UJ отклонена от внешней оси образца на угол ср; обозначение (р [Ui ]; - ограниченная текстура: плоскость (hj) кристаллитов на внешней плоскости, направление {TJi ] этой плоскости параллельно внешнему направлению; обозначение [U, ] (hi). Рис. 46. Вид текстуры высохшей смешанной слюны при сахарном диабете. Для текстурного анализа была использована программа Hesperus v. 3.0 beta. Методы текстурного анализа включенные в Hesperus используют как гистограмму, так и матрицу пространственной зависимости (GLCM). Текстура может выделяться на основании различных критериев. Применение любого из этих критериев к изображению дает на выходе другое изображение, где интенсивность каждого пиксела отражает величину соответствия этому частному критерию в конкретной точке входного изображения. Результаты текстурного анализа обычно трактуются как одно многоканальное изображение, и могут быть поданы на вход к стандартному Байесовому классификатору, который группирует текстуры по классам. Матрица пространственной зависимости (GLCM - gray level cooccurrence matrix) - гистограмма второго порядка, показывающая вероятность совместного появления двух определетіт.тх значений пикселов на заданном расстоянии и в определенном направлении. Размеры матрицы зависят от количества градаций цвета берущихся в рассмотрение. В Hesperus применяются матрицы размером 256x256 элементов, что соответствует 256 оттенкам серого цвета. На основе матрицы пространственной зависимости вычисляется большое число текстурных характеристик.
Кристаллизация ротовой жидкости у больных с сахарным диабетом
Конечной целью нашего исследования состояла в том, чтобы выявить (разработать) критерии диагностики и дифференциальной диагностики эндокринного заболевания - сахарного диабета по оценке фигур кристаллизации слюны. В этой серии исследований нами было обследовано 96 больных. Из них 55 человек с СД П-го типа и 41 пациента с СД 1-го типа, Общие сведения приведены в таблице № 20. После анализа морфологии кристаллов у больных СД I смешанная слюна нами обнаружено следующее. В 30% случаев не происходит образование микрокристаллов, хотя изображение не является гомогенным, а текстурировано. Во всех других случаях в слюне образуются микрокристаллы, часть которых качественно отличаются от нормы.
Образуются тела кристаллов с измененные отростками и вершинами. Наиболее часто (74% случаев) образуются « объемные кристаллы» (рис.21).
Такой рост кристаллов возможен при оптимальных условиях крислаллизации. Особенностью морфологии кристаллов при СД I характерно образование отростков первого порядка с одной стороны - CUM - 61% (рис.22). В таком же проценте появляется кристаллы с расщеплением вершин - CST - (рис.23). При СД - I нарушается процесс образования отростков: в половине случаев (48%) кристаллы имеют длинные ветвящиеся на концах отростки - LSD (рис. 24). В другой половине случаев наоборот, образуются короткие деформированные отростки - CBD (рис. 25). В 39% случаев рост микрокристаллов напоминает « коралловую ветвь» - ССВ (рис. 26).
У лиц больных сахарным диабетом П-го типа в 26% появляются кристаллы с одним ветвящимся отростком (признак СВМ) (рис.28). Наиболее редки «голые кристаллы», без роста отростков- FAB (22%) (рис.29).
Таким образом при инсулин зависимом сахарном диабете рост микрокристаллов в смешанной слюне качественно изменяется.
Для дальнейшего анализа полученных данных нами был использован многомерный статистический анализ данных. Полученные данные в контроле - (20 человек, 16 показателей) и в опыте (30 больных, 31 показатель). А также пять дополнительные показателей: 1) пол; 2)возраст; 3)длительность заболевания; 4) наличие пародонтита и 5) состояние высоты прикуса, были занесены в электронную таблицу STATGRAPHICS и подвергнуты кластерному анализу. В качестве метода исследования был выбран методы Joining (tree clustering) - метод построения дендрограммы или дерева объединения. В качестве параметров кластерного анализа был выбран метод Wards, выделяющий кластеры с приблизительно равным числом членов. В качестве ключевой метки (Point Labels) была выбрана группа исследования. На рисунке 31 представлены результаты разбиения массива данных на 2 кнастера. Видно, что результате кластеризации произошло полное разделение на кластеры больных (цифра 3) и здоровых лиц (цифра 1). Эти результаты совпадают в данными литературы о том, что при сахарном диабете синтетические процессы в слюнных железах мало изменены.
Таким образом, нами впервые систематизированы и описаны морфологические признаки, характеризующие кристаллические агрегаты смешанной слюны у больных страдающих сахарным диабетом 1-го типа.
Обозначения. По оси абсцисс - наблюдения, скомбинированные в соответствии с проведенным анализом, где 1 - норма, 3 -сахарный диабет. По оси - ординат - расстояние (distance) для каждого шага работы агломеративного иерархического алгоритма кластеризации.
Смешанная слюна больных сахарным диабетом П типа кристаллизуется со своими отличиями. При этом типе CD также как и при CD І в ряде случаев (18%) не происходит образование микрокристаллов, а изображение текстурировано. Это в два раза реже чем при CD I.
Во всех других случаях в слюне образуются микрокристаллы, часть которых качественно отличаются от нормы. Образуются тела кристаллов с измененные отростками и вершинами (рис.31). Сокращенное обозначение видов кристаллов приведено было раньше в таблице № 17 .
![Стоматологический статус и особенности гигиенического воспитания детей с ограниченными возможностями [Электронный ресурс]](/i/i/4710/197192.png "Стоматологический статус и особенности гигиенического воспитания детей с ограниченными возможностями [Электронный ресурс] Платонова Наталья Вячеславовна")
