Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Эффективность сохранения жизнеспособности пульпы при применении метода прямого покрытия
1.2. Использование озона в стоматологии 22
Глава 2. Материалы и методы исследования 31
2.1. Изучение частоты встречаемости и эффективности лечения обратимых форм пульпитов в практике врачей-стоматологов
2.2. Способ получения озона и методика проведения озонотерапии 32
2.3. Характеристика исследуемых материалов, применяемых для прямого покрытия пульпы
2.4. Модель экспериментального исследования 35
2.5. Исследование микроциркуляции крови в пульпе зуба 40
2.6. Морфологические исследования процессов регенерации тканей пульпы зуба
2.7. Изучение эффективности применения озонотерапии при случайном вскрытии пульпы зуба в клинических условиях
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение
3.1. Результаты изучения частоты встречаемости и эффективности лечения обратимых форм пульпитов в практике врачей-стоматологов
3.2. Результаты изучения показателей микроциркуляции в пульпе при лечении ятрогенного пульпита у исследуемых животных
3.3. Результаты морфологического исследования процессов регенерации тканей пульпы зуба при лечении ятрогенного пульпита
3.4. Результаты изучения эффективности применения озонотерапии при случайном вскрытии пульпы зуба
Заключение 107
Выводы 127
Практические рекомендации 128
Список литературы 129
- Использование озона в стоматологии
- Способ получения озона и методика проведения озонотерапии
- Морфологические исследования процессов регенерации тканей пульпы зуба
- Результаты изучения показателей микроциркуляции в пульпе при лечении ятрогенного пульпита у исследуемых животных
Введение к работе
Количество пациентов с воспалительными заболеваниями пульпы, по данным различных авторов, не только не снижается, но имеет тенденцию к увеличению, составляя от 20,6 до 46,3% от числа всех обратившихся за стоматологической помощью (В.С. Иванов, 2003; Л.М. Лукиных, Л.В. Шестопалова, 2004; Юдина Н.А., Азаренко В.И., Русак А.С., 2009).
При лечении обратимых форм пульпита используются препараты для
прямого покрытия пульпы, которые способствуют купированию воспаления
и повышению регенерационных возможностей тканей зуба. Для стимуляции
процессов регенерации многие авторы рекомендуют использовать
физиотерапевтические методы воздействия (Ефанов О.И., Волков А.Г., 2005;
Масленников О.В., 2008). Среди многочисленного арсенала
физиотерапевтических средств в стоматологии активно применяется
озонотерапия, которая является высокоэффективным немедикаментозным
методом лечения, обладающим бактерицидным, противовирусным,
фунгицидным, иммуномодулирующим, противогипоксическим и
дезинтоксикационным действием (Azarpazhooh A., Limeback H., 2008).
Механизм лечебного действия озонотерапии связан с высоким окислительно-восстановительным потенциалом озона, что обеспечивает, с одной стороны, дезинфицирующий эффект в отношении бактерий, вирусов и грибов, с другой – приводит к активизации метаболических процессов в тканях (Seidler V. et аl., 2008; Кисткин А.И., 2009). Универсальность механизма действия, способность влиять на процессы микроциркуляции и регенерации, отсутствие побочных эффектов предполагают возможность использования данного вида воздействия при лечении обратимых форм пульпита. В связи с этим изучение эффективности применения озонотерапии в сочетании с методом прямого покрытия пульпы зуба весьма актуально.
Цель исследования
Повышение эффективности лечения пульпита биологическим методом за счет включения в протокол применения озоно-воздушной смеси в сочетании с методом прямого покрытия пульпы материалами на основе гидроокиси кальция и гидроксиапатита ультравысокой дисперсности.
Задачи исследования
-
Оценить частоту использования, особенности применения и клиническую эффективность биологического метода лечения пульпита в стоматологической практике.
-
С помощью лазерной допплеровской флоуметрии дать оценку динамике микроциркуляции в пульпе зуба при лечении обратимых форм пульпита с использованием озоно-воздушной смеси в комбинации с лечебными прокладками на основе гидроокиси кальция и гидроксиапатита ультравысокой дисперсности в эксперименте.
-
Оценить с помощью морфологических методов исследования противовоспалительный и репаративный потенциал озоно-воздушной смеси в сочетании с прокладочными материалами на основе гидроокиси кальция и гидроксиапатита ультравысокой дисперсности при ятрогенном пульпите в эксперименте.
-
Разработать алгоритм и оценить клиническую эффективность применения озонотерапии в сочетании с методом прямого покрытия пульпы при обратимых формах пульпита.
Научная новизна
1. Впервые на основании анкетирования установлено, что 85% врачей-
стоматологов имеют представление о биологическом методе лечения
пульпита, но в клинической практике регулярно его используют лишь в
11,7%. При этом клиническая эффективность данного метода отмечается
лишь в 68% случаев, что связано с неправильной тактикой лечения,
несоблюдением врачами единого протокола ведения больных,
недостаточным использованием дополнительных методов исследования и физиотерапии.
-
Впервые разработана экспериментальная модель, позволившая изучить влияние озонотерапии, в сочетании с методом прямого покрытия пульпы материалами на основе гидроокиси кальция и гидроксиапатита ультравысокой дисперсности, на процессы микроциркуляции и регенерационную способность пульпы при ятрогенном пульпите.
-
Доказано, что озонотерапия в сочетании с методом прямого покрытия пульпы при лечении ятрогенного пульпита способствует ликвидации воспалительной гиперемии пульпы. При этом более выраженные изменения микроциркуляции наблюдаются при сочетании озонотерапии и гидроксиапатита ультравысокой дисперсности, что проявляется в снижении показателей микроциркуляции и среднего квадратичного отклонения амплитуды колебаний кровотока к 21-у дню после начала эксперимента и нормализацией показателей активной и пассивной модуляции кровотока на 35-й день исследования.
4. Установлено, что озонотерапия в сочетании с прямым покрытием
пульпы купирует воспаление и стимулирует процессы регенерации в пульпе
зуба при ятрогенном пульпите. Эти эффекты более выражены в той группе,
где озонотерапию применяли в сочетании с материалом на основе
гидроксиапатита ультравысокой дисперсности, о чём свидетельствовало
снижение уровня экспрессии Macrophage и интенсивности реакции с S100 на
14-й день и образование дентинных мостиков и структуризация
одонтобластов в один слой – на 35-й день.
5. Доказана клиническая эффективность включения озонотерапии в сочетании с методом прямого покрытия в алгоритм лечебных мероприятий при случайном вскрытии пульпы зуба.
Практическая значимость
Применение озонотерапии в сочетании с методом прямого покрытия пульпы материалами на основе гидроокиси кальция и гидроксиапатита ультравысокой дисперсности позволяет расширить арсенал методов лечения и способствует повышению качества лечения обратимых форм пульпита.
Положения, выносимые на защиту
-
Использование лазерной допплеровской флоуметрии и иммуногистохимических методов исследования позволяет достоверно оценить влияние озоно-воздушной смеси на регенерационную способность пульпы зуба.
-
Озонотерапия в сочетании с методом прямого покрытия пульпы оказывает положительное влияние на регенерацию пульпы при ятрогенном пульпите в эксперименте, и повышает клиническую эффективность лечения при случайном вскрытии пульпы зуба.
Внедрение результатов исследования
Разработанная методика применения озонотерапии в сочетании с методом прямого покрытия пульпы внедрена в практику лечебно-хирургического отделения ГБУЗ г. Москвы "Детская стоматологическая поликлиника № 54 ДЗМ". Материалы исследования включены в учебный процесс кафедры терапевтической стоматологии стоматологического факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на ХI Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2010 г.); на VI Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых учёных (Москва, 2011 г.); на (Москва, 2013 г.); на XIV Международном конгрессе "Здоровье и образование в XXI веке", Втором Российском съезде по
хронобиологии и хрономедицине с международным участием (Москва, 2013 г.); на IХ Межвузовской и межрегиональной научно-практической конференции «Научная стоматологическая навигация» «Достижения стоматологии – практическому здравоохранению» (Москва, 2013 г. ); на Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы морфологии, адаптогенеза и репаративных гистогенезов» (Оренбург, 2013 г.); на IX Всероссийской научно-практической конференции "Образование, наука и практика в стоматологии" 11 Всероссийском стоматологическом форуме Дентал-ревю (Москва, 2014 г.); на IX международной (XVIII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2014 г.) и на совместном заседании: кафедр терапевтической стоматологии; стоматологии педиатрического факультета, гистологии, эмбриологии и цитологии, челюстно-лицевой хирургии и стоматологии стоматологического факультета РНИМУ им. Н.И.Пирогова; кафедры терапевтической стоматологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова 11 марта 2014 г. (протокол №14).
Личный вклад автора
Автором лично разработана экспериментальная модель для изучения эффективности применения озонотерапии в сочетании с методом прямого покрытия пульпы материалами на основе гидроокиси кальция и гидроксиапатита ультравысокой дисперсности при лечении ятрогенного пульпита, а также проведено лечение зубов в эксперименте на кроликах. Автор участвовал в проведении морфологических исследований и в анализе результатов. Самостоятельно изучал влияние озонотерапии на микрогемодинамику в пульпе зуба у экспериментальных животных и в клинической практике с помощью лазерной допплеровской флоуметрии. Соискатель самостоятельно проводил набор и анализ клинического материала по изучению эффективности применения озонотерапии при случайном вскрытии пульпы зуба. Автор лично оформил диссертационную работу и сформулировал выводы и практические рекомендации.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 6 работ в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.
Объем и структура работы
Использование озона в стоматологии
Среди большого арсенала физиотерапевтических средств, в последние годы, в стоматологии, активно применяется озонотерапия. По мнению большинства исследователей озонотерапия является высокоэффективным немедикаментозным методом лечения, обладающим бактерицидным, противовирусным, фунгицидным действием (Azarpazhooh A., Limeback H., 2008). Оказывает корригирующее влияние на гомеостаз, оптимизирует антиоксидантные системы, улучшает периферическое кровообращение, влияет на метаболизм биологических субстратов - углеводов, белков, липидов, оказывает иммуномодулирующее действие (малые дозы стимулируют иммунитет, большие - подавляют), оказывает дезинтоксикационное действие, влияет на свертываемость крови. (Перетягин С.П., 1992; Конторщикова К.Н., 2000; Конторщикова К.Н., 2003). История использования озона в медицинских целях начинается с 20 века. В 1911 году М. Эберхарт использовал озон при лечении туберкулеза, анемии, пневмонии, диабета. А.Вольф во время первой мировой войны применял озоно-кислородную смесь у раненых при переломах и гнойных процессах. В 30-х гг. XX века А.Фиш впервые применил озон в стоматологии. Озонотерапию, на сегодняшний день, широко используют в различных областях медицины. Её успешно применяют в гнойной хирургии, травматологии, акушерстве и гинекологии, оториноларингологии, офтальмологии, дерматологии, неврологии, в клинике инфекционных болезней, гастроэнтерологии, урологии, онкологии, эндокринологии и т.д. (Zhilina N., Contorshikova K., 1993; Crus O., Merendes S. et al., 1997; Белокуров Ю.Н., Молодкин В.М., 1998; Смирнов С.Н., 1999; Терентьева А.Б., 1998; Винниченко Ю.А.,2001; Котов С. А., 2000; Сайфиева H.H., 2002; Шулаков В.В. и соавт., 2003). Известно несколько способов применения озона с лечебной целью: местное обдувание, местные аппликации озонированных растворов и масел, малая и большая аутогемотерапии, подкожные инъекции озона, внутривенные инфузии озонированного физиологического раствора (Перетягин С.П., Конторщикова К.Н., 1992, 1995, 2003; Разумовский С. Д. 1995; Котов С. А., 2002). При местном применении в первую очередь проявляется бактерицидное, вирицидное и фунгицидное действие озона. В отличие от многих антисептиков, озон не оказывает разрушающего и раздражающего действия на ткани, так как клетки многоклеточного организма имеют антиоксидантную систему защиты (Туркина А.Ю., 2005). Озон нарушает целостность оболочек микробных тел, переокисляя фосфолипиды и липопротеиды, вступает в реакцию с молекулой ДНК, препятствуя размножению микроорганизмов (Зайцев А.Б., 2003).
Многочисленные экспериментальные исследования демонстрируют, что уже при небольших концентрациях озона отмечается подавление широкого спектра микроорганизмов, в том числе и большинства возбудителей хирургической инфекции: грамположительных и грамотрицательных бактерий, анаэробов, возбудителей газовой гангрены и дифтерии, микобактерий туберкулеза, патогенных грибков, простейших и вирусов (Brauner AW., 1993; Baysan A., Whiley RA.,2000;Шулаков В.В., Агапов B.C., 2003; Bezirtzoglou E., Cardoso MG., 2008; Castillo A., Galindo-Moreno P., 2008; Cretoiu SM., 2008).
По данным Мирошина С.И. и Ладыгиной Г.И. (1995), при 10-ти минутной экспозиции хлоргексидина погибало лишь 15,2%, диоксидина -20,7% штаммов протея, в то время как при озонировании подавлялся рост 100% штаммов изучаемых микроорганизмов, это, по мнению авторов, указывает на отстутствие резистентности микрофлоры к воздействию озона (Мирошин С.И., Ладыгина Г.Н., 1992).
Антивирусное действие озона связано с повреждением полипептидных цепей оболочки, что приводит к нарушению способности вирусов прикрепляться к клеткам-мишеням. Кроме того, происходит расщепление одной нити РНК на две части, подрывающее фундамент реакции размножения. Определенную роль в этом процессе играют "непереносимость" пероксида инфицированными клетками и изменение активности фермента обратной транскриптазы, участвующей в синтезе вирусных белков (Перетягин С.П., 1992). Фунгицидный эффект озона реализуется за счет влияния на внутриклеточный гомеостаз, следствие нарушения барьерных свойств плазматической мембраны. При электронно-микроскопических исследованиях обнаружено образование поперечных сшивок «белок-белок», «белок-липид». Одним из сшивающих агентов может быть малоновый диальдегид. Это подтверждается тем, что при летальной дозе для Candida продольные сколы мембран замещаются поперечными, что приводит к быстрому изменению ультраструктуры плазматической мембраны, что приводит к гибели микроорганизмов (Brito LC., Teles FR., 2007).
Кроме того, проведенные экспериментально-клинические исследования выявили многогранные эффекты озонотерапии, среди которых можно выделить: сдвиг рН в щелочную сторону, активацию окислительных процессов в клетках с нормализацией перекисного окисления липидов, ускорение кислородозависимых реакций в тканях (Разумовский С.Д., 1992; Конторщикова К.Н., 2003).
Способ получения озона и методика проведения озонотерапии
При проведении экспериментального исследования для прямого покрытия пульпы использовали материал на основе гидроокиси кальция Calcipulpe - Calcium hydroxide paste - «Septodont» (Франция) и препарат на основе гидроксиапатита ультравысокой дисперсности ОСТИМ-100. Calcipulpe является препаратом гидроксида кальция. Выпускается фирмой «Septodont» (Франция). Материал содержит гидроксид кальция (20,00 г) и сульфат бария (20,10 г); он может химически нейтрализовать кислоты и способствует образованию заместительного дентина (рис. 3). ОСТИМ-100 синтезирован в Лаборатории радиохимических методов исследования гетерогенных процессов МГУ им. М.В. Ломоносова. Это синтетический гидроксиапатит ультравысокой дисперсности, который представлен в виде пасты (Панкратов А.С.,1995; Зуев В.П., Новиков В.И., Панкратов А.С., 1995; Безруков В.М., Григорьянц Л.А., Зуев В.П.,1998). Препарат разрешен к медицинскому применению приказом Минзравмедпрома РФ № 59 от 14 марта 1995 года и соответствует требованиям ВФС 42-2447-94. Помимо высокой химической чистоты и строгой стехиометрической однородности, соответствующей требованиям Международного Стандарта, материал отличается тем, что размеры его частиц составляют 0,01 - 0,03 мкм, что на 2 - 3 порядка меньше, чем у наиболее близких по структуре образцов гидроксиапатита, а их удельная поверхность составляет 150 – 200 м2/г. (что в 30 - 50 раз выше, чем у известных в литературе аналогов). На поверхности кристалла гидроксиапатита создана высокая концентрация равномерно встречающихся ультрамикропор, которым принадлежит решающая роль в утилизации частиц гидроксиапатита в условиях биологически активной среды. Для предупреждения взаимной агрегации кристаллов гидроксиапатита препарат выпускается в виде однородной водной пасты. Она достаточно пластична, так как не является результатом простого смешивания порошка с водой, а образуется в результате синтеза. Максимальная концентрация, при которой не происходит адгезии микрочастиц – 33% (рис. 4).
Это обусловливает быструю реакцию материала на изменение окружающей биохимической активности, максимальную адаптацию кристаллов по форме и размерам к структуре окружающей ткани, высокую сорбционную активность по отношению к белкам. В экспериментальном исследовании на животных изучали эффективность применения озонотерапии в сочетании с методом прямого покрытия пульпы материалами на основе гидроокиси кальция и на основе гидроксиапатита ультравысокой дисперсности при лечении ятрогенного пульпита. Эксперимнтальное исследование осуществлялось в соответствии с нормативами, предусмотренными «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (ETS № 123 от 18.03.1986) и Федеральным законом № 52 «О животном мире» от 24.04.1995 г. Объектами исследования являлись - половозрелые кролики породы "Советская шиншилла". Количество животных составляло 32 особи, от 8 месяцев до 1,5 лет, живой массой 3,5 - 4 кг. Они были получены из вивария ФГУП ОПХ «Манихино», эксперимент проводился в виварии ЦНИЛ ГБОУ ВПО РНИМУ им И.П. Пирогова Минздрава России, г. Москва, ул. Островитянова д.1а (зав. виварием Сергеева Е.Г.) и на кафедре терапевтической стоматологии стоматологического факультета ГОУ ВПО РНИМУ им. И.П. Пирогова Минздрава России, г. Москва (Выписка из протокола заседания ЭК РГМУ № 98 от 17 мая 2010 года). После 4-х дней акклиматизации животных приступали к экспериментальному исследованию. Общую анестезию (наркоз) у кроликов проводили на фоне премедикации 2% раствором ксилазина гидрохлорида (рометара) в дозе 5,0 мг/кг. Для общей анестезии применяли внутримышечное или внутривенное введение 5% раствора золетила в дозе 7,5 мг/кг массы при внутримышечном введении и 7,0 мг/кг массы при внутривенном введении (рис. 5). Данные анестетики разрешены к применению в ветеринарии у животных. Рис. 5. Введение 5% раствора золетила в ушную вену После введения исследуемого животного в состояние наркоза производили установку роторасширителя, затем механически очищали исследуемые зубы с помощью полировочных щеток и абразивной пасты Detartrine- Z пасты. Далее под инфильтрационной анестезией sol. Ubestezini 4% в количестве 0,5-1,0 мл., проводилось препарирование зубов. На вестибулярной поверхности двух резцов верхней и двух резцов нижней челюсти в пришеечной области , а также на жевательной поверхности первых жевательных зубов шаровидным бором моделировался дефект твердых тканей зуба со вскрытием пульповой камеры зуба. Этап препарирования твердых тканей зуба выполнялся тщательно и аккуратно отрывистыми движениями с использованием турбинного наконечника с охлаждением (до 250 тыс. об/мин.) и шаровидного бора (рис. 6). Рис. 6. Препарирование твердых тканей зуба В зависимости от проведения дальнейших мероприятий зубы были разделены на четыре группы. В первой группе (32 зуба) обдувание озоном не использовали. После моделирования ятрогенного пульпита проводилось прямое покрытие пульпы материалом на основе гидроксида кальция (Calcipulpe - Calcium hydroxide paste - «Septodont»). Во второй группе (32 зуба) при лечении ятрогенного пульпита использовали озонотерапию, после чего проводили прямое покрытие пульпы материалом на основе гидроксида кальция (Calcipulpe - Calcium hydroxide paste - «Septodont»). Третью группу (32 зуба) составили зубы с моделированным ятрогенным пульпитом, где лечение проводилось без применения озонотерапии. Вскрытую пульпу покрывали материалом на основе гидроксиапатита Ca10(PO4)6(OH)2 ультравысокой дисперсности (ОСТИМ - 100). В четвёртой группе (32 зуба) при лечении ятрогенного пульпита применяли обдувание пульпы озоно-воздущной смесью. Вскрытую пульпу затем покрывали препаратом на основе гидроксиапатита ультравысокой дисперсности (Остим -100).
Завершающим этапом во всех группах являлось закрытие дефекта в твердых тканях зуба с помощью светоотверждаемого полихромного компомера (Twinky Star, Voco, Германия). Выбор материала был обусловлен наличием широкого спектра цветов, облегчающий кодировку гистологического материала (рис. 7). В первой группе использовали Twinky Star orange, во второй Twinky Star green, в третьей - Twinky Star blue, в четвёртой - Twinky Star pink. В связи с понижением температуры тела кролика во время общей анестезии и в течение 3 часов послеоперационного периода производилось его согревание, используя внешние источники тепла. Выведение животного из эксперимента производили на 7, 14, 21, 35 сутки путем передозировки золетилового наркоза. Указанные сроки были необходимы для того, чтобы проследить в динамике процессы регенерации тканей пульпы, происходящие в очаге повреждения.
Морфологические исследования процессов регенерации тканей пульпы зуба
При морфологических исследованиях было изучено 128 гистологических препаратов, полученных от 32 кроликов. Для остановки обменных процессов и сохранения структур исследуемых объектов от аутолитических повреждений была проведена фиксация в 10% забуференном формалине (Bio-Оpticа) в течение суток в соотношении. Для декальцинации полученного материала через 24 часа от начала фиксации исследуемый материал был помещен в контейнер с раствором Мielodec (Bio-Орtiса, Италия). Материал проходил этап декальцинации в ультразвуковом декальцинирующем устройстве (USE 33, Меdite Меdizintechnik, Германия) в рекомендованном производителями аппарата и растворов режиме – экспозиция 2 часа в растворе А, 15 минут в 70% этаноле, 2 часа в растворе В. Все этапы были проведены при температуре 17С. Через 4 часа декальцинации материал промывали проточной водой. В зоне повреждения осуществлялся визуальный контроль полости зуба.
Материал из области непосредственно дефекта сформированного бором в работу не забирался, так как после проведенных манипуляций (моделирование ятрогенного пульпита, пломбирование полости) достоверно оценить характер поражения пульпы в данном месте не представлялось возможным ввиду выраженной фрагментации и механической деформации поверхностного слоя пульпы. В некоторых случаях на поздних сроках исследования отмечалось полное отсутствие коронковой части пульпы, вследстие ее некроза. Из каждого зуба продольными срезами с использованием скальпеля выделяли несколько фрагментов - серия послойных срезов через шейку и корень зуба. Выделенные фрагменты укладывали в гистологические кассеты по одному, срезом к основанию кассеты. На каждую кассету наносили соответствующую содержанию маркировку. Далее согласно стандартной процедуре проводки материал помещали в гистологический процессор конвейерной проводки Tissue Xpress Х50 (Sakura, Япония). Длительность стандартной запрограммированной проводки составляла 80 минут при температуре 62С. После проводки выделенные фрагменты заливали в парафин (Bio Plast еxtrа, Италия) на модульной системе заливки Тissue-ТеkТЕС5. В дальнейшем на микротоме из них изготавливали срезы. Для этого срезы после стандартной процедуры депарафинизации окрашивали гематоксилином Джилла (Gill s hematoxylin, Bio-Optica, Италия) и водно-спиртовым раствором эозина (BioVitrum, Россия) в мультистейнере Тissue-ТЕКРRISМАТМ (Sakura, Япония). После заключения под покровную пленку в аппарате Тissuе-ТЕКFILМ (Sakura, Япония) гистологические препараты оценивали методом световой микроскопии на тотально роботизированном микроскопе Nikon Есlipse i90 (Nikon Соrporation, Япония).
Для определенных целей изготавливали замороженные срезы. При этом из каждого фрагмента после охлаждения блоков при температуре -20С в морозильной камере с последующей поддержкой температуры блоков на крио-станции (Тissue-ТekТЕС plus Сrуо Соnsolе, Sakura, Япония) на ротационных микротомах Ассu-Сut SRM 200 (Sakura, Япония) были сделаны срезы толщиной 0,5 мкм. Срезы укладывали по одному на предметные стекла Меnzel-Glaser (Тhermo Scientific, USА), высушивали в вертикальном положении в термостате (ТС-1/80 СПУ, Россия) при температуре 38С. Для изучения восстановительных процессов после моделированного повреждения пульпы оценивали следующие параметры: интенсивность воспаления, клеточный состав инфильтрата, неоангиогенез, характер нарушений кровообращения, миграция и пролиферация фибробластов, ремоделирование соединительной ткани и характер метапластических изменений. Кроме того, оценивалась скорость формирования третичного дентина. Для оценки вышеобозначенных процессов, помимо окраски препаратов гематоксилином-эозином, использовали дополнительную гистохимическую окраску трихромом в модификации Массон - выявление соединительнотканного компонента и степени зрелости коллагеновых волокон (NexES SS, Ventanа, США). В ходе исследования было изучено 128 срезов. После декальцинации зуба и удаления неорганического дентина органические остатки стенки зуба расщеплены на пластины, которые расположены параллельно полости зуба и перпендикулярно направлению канальцев. Уровень пролиферативной активности оценивали по реакции с Кi-67 из расчета количества клеток с позитивной ядерной экспрессией на 100 элементов аналогичного морфологического ряда. Реакция с СD117 позволила выявить количество тучных клеток пульпы в зависимости от сроков, прошедших после нанесения повреждения, и от проводимой терапии. Степень повреждения сосудистой стенки в процессе воспаления, а именно ее набухание, отек эндотелия и диссоциация его элементов, оценивались по уровню и интенсивности экспрессии Роdoplanin и СD34 на эндотелии лимфатических и кровеносных сосудов соответственно. Для визуализации нервных волокон и выявления интенсивности постампутационной пролиферации проводили реакции с S100. Для визуализации элементов гистиоцитарного ряда воспалительного инфильтрата и, на поздних сроках, для контроля макрофагально -гистиоцитарной реакции и ее интенсивности использовали анти-Масrophage маркер.
Срезы для проведения реакций формировались аналогично срезам для рутинных окрасок, но укладывались на предметные стекла SuperFrost Рlus из (Меnzel, Германия) с положительно заряженной поверхностью. За счет постоянного положительного заряда на своей поверхности и образования ковалентных связей между поверхностью стекла и срезами тканей, фиксированных в формалине, данные стекла обеспечивают лучшую адгезию клеток и тканей на своей поверхности, предотвращают образование фоновой окраски при проведении иммуногистохимических реакций. Иммуногистохимическое исследование проводили в полностью автоматизированном иммуностейнере ВenchMark (Roche Ventana, США). Все реакции выполняли по рекомендованным производителем антител и аппарата протоколам, зашифрованным в штрих-кодах, наклейки с которыми наклеивались на колорированный матовый край стекла для исключения возможности ошибки чтения антитела при ручном нанесении. Стекла укладывали на термопады, поддерживающие заданную в протоколах постоянную температуру депарафинизации и инкубации антител. Для протоколов с использованием СDЗ, СD20, Кi-67 после депарафинизации были заданы параметры стандартной предварительной обработки клеток в течение 64 минут с использованием щелочного буфера (СС1, Roche Ventana, США), для протоколов с анти-СD117, S100 и Роdoplanin с использованием кислого буфера (СС2, Roche Ventana, США), в протоколах для Масrophage и СD34 использовали ферментный метод с Рrotease1 (Roche Ventana, США) (табл.5). После проведения реакций срезы окрашивали в иммуностейнере гематоксилином (Нematoxylin II, Roche Ventana, США) и дополнительно обрабатывали дифференцирующим раствором Вluing reagent (Roche Ventana, США). После каждого этапа протокола стекла стандартно покрывали жидким стеклом (LSD, Roche Ventana, США), что предотвращало высыхание срезов.
Результаты изучения показателей микроциркуляции в пульпе при лечении ятрогенного пульпита у исследуемых животных
Через сутки после проведенных лечебных мероприятий у больных первой группы, где применялась озонотерапия, жалобы отсутствовали. Показания электроодонтодиагностики находились в пределах от 14 мкА до 23 мкА. Показатели лазерной допплеровской флоуметрии свидетельствовали о развитии воспалительной гиперемии. Во всех исследуемых зубах отмечалось повышение показателей микроциркуляции в среднем на 32% и среднего квадратичного отклонения амплитуды колебаний кровотока на 19%, по сравнению с показателями соседних интактных резцов.
Через две недели после лечения отмечалось повышение электровозбудимости зубов до 8 – 17 мкА. Сохранялась гиперемия пульпы: показатель микроциркуляции был выше на 39%, чем в интактной пульпе, а среднее квадратичное отклонение амплитуды колебаний кровотока также было выше нормы на 22%. Во второй группе, где в комплекс лечебных мероприятий озонотерапию не включали, на следующий день после лечения два пациента предъявляли жалобы на возникновение кратковременной боли (до 10 сек) от холодной воды. У остальных больных жалобы отсутствовали. Электровозбудимость зубов была в диапазоне от 18 мкА до 27 мкА. По данным ЛДФ воспалительная гиперемия пульпы у четырёх пациентов этой группы была более выражена, чем в первой группе. Уровень кровотока (М) и его интенсивность () увеличивались в среднем на 41% и 26% по сравнению с интактными зубами. У одного из пациентов второй группы отмечалось снижение показателей микроциркуляции на 62% и среднего квадратичного отклонения амплитуды колебаний кровотока на 49%. В той группе, где озонотерапию не проводили, через две недели после лечения кратковременная болевая реакция на температурные раздражители сохранялась у двух пациентов. Электровозбудимость зубов у этих пациентов была в пределах 25 – 27 мкА. У остальных больных отмечалось повышение электровозбудимости до 14 – 22 мкА. У четверых больных был более высокий уровень воспалительной гиперемии по сравнению с первой группой в эти же сроки. Показатель микроциркуляции был выше на 54%, а среднее квадратичное отклонение амплитуды колебаний кровотока на 33% показателей интактных зубов. У одного из больных второй группы наоборот отмечалось сохранение более низкого уровня микроциркуляции по сравнению с пульпой интактных зубов. Уровень кровотока и его интенсивность были ниже на 67% и на 52% соответственно. В отдаленные сроки 2, 6 и 12 месяцев после лечения у всех больных первой группы жалобы отсутствовали. Электровозбудимость зубов была в пределах от 2 мкА до 12 мкА. Показатели лазерной допплеровской флоуметрии через два месяца после лечения соответствовали показателям интактной пульпы. При рентгенологическом обследовании в отдаленные сроки после лечения не было обнаружено патологических изменений периапикальных тканей исследуемых зубов.
Во второй группе через 1,5 месяца после лечения один из пациентов обратился с жалобами на боли от горячего и чувство тяжести в области пораженного зуба. Электровозбудимость была снижена до 75 мкА. Лазерная допплеровская флоуметрия показала отсутствие кровообращения в коронке зуба, что свидетельствовало о некрозе коронковой пульпы и необходимости проведения эндодонтического лечения.
Через два месяца после лечения другой пациент этой группы отмечал появление ноющих самопроизвольных болей, которые усиливались от температурных раздражителей. Электроодонтодиагностика показала, что электровозбудимость пульпы была снижена до 45 мкА. Данные лазерной допплеровской флоуметрии соответствовали высокой степени воспалительной гиперемии пульпы зуба. Уровень кровотока и его интенсивность были выше на 47% и на 26% по сравнению с показателями кровообращения интактных зубов. В результате анализа клинических и дополнительных методов исследования было установлено, что в пульпе развился хронический воспалительный процесс и возникли изменения необратимого характера, требующие эндодонтического лечения.
У остальных пациентов второй группы в отдалённые сроки после лечения жалобы отсутствовали. Показатели электроодонтодиагностики находились в диапазоне от 11 мкА до 18 мкА. Лазерная допплеровская флоуметрия свидетельствовала о стихании воспалительной реакции в пульпе и нормализации локального кровотока. При рентгенологическом исследовании патологических изменений в периапикальных тканях у этих пациентов обнаружено не было. Таким образом, в результате изучения эффективности применения озонотерапии при случайном вскрытии пульпы зуба установлено, что в той группе, где озонотерапию не применяли, у двух из шести пациентов возникли необратимые патологические изменения в пульпе. Применение озонотерапии способствовало повышению качества лечения. В группе, где использовали озонотерапию, а после проводили прямое покрытие пульпы материалом на основе гидроксида кальция (Calcipulpe - Calcium hydroxide paste - Septodont), у всех пациентов удалось добиться сохранения жизнеспособности пульпы при её случайном вскрытии. У этих больных быстрее стихали и были менее выражены симптомы воспаления, о чем свидетельствовали данные электроодонтодиагностики и лазерной допплеровской флоуметрии. Результаты клинического применения озонотерапии при случайном вскрытии пульпы зуба полностью согласуются с результатами экспериментального исследования по изучению эффективности применения озонотерапии при лечении ятрогенного пульпита. Полученные клинико - экспериментальные данные позволили разработать алгоритм комплексного лечения пациентов с ятрогенными формами пульпитов с использованием озонотерапии. При случайном вскрытии полости зуба для сохранения жизнеспособности пульпы необходимо провести обдувание вскрытой пульпы озоно-воздушнойи смесью в течение 1 мин, при концентрации озона 0,261мг/ м и производительности озоногенератора 2 л/мин озоно-воздушной смеси. После этого нужно провести прямое покрытие пульпы материалом на основе гидроксида кальция (Calcipulpe - Calcium hydroxide paste - Septodont). Завершающим этапом лечения является временная реставрация дефекта твердых тканей зуба (рис. 56). Окончательную реставрацию рекомендовать проводить через 6 месяцев при отсутствии симптомов воспаления.
