Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Современные представления о роли микробного фактора в этиологии и патогенезе пародонтита 13
1.2. Роль факторов воспаления в механизмах защиты и деструкции тканей пародонта 21
1.3. Факторы генетически обусловленной предрасположенности к развитию пародонтита 31
1.4. Заключение по обзору литературы 42
ГЛАВА 2. Материал и методы 46
2.1. Состав исследованной выборки, дизайн исследования и формирование базы данных пациентов 46
2.2. Клинические методы исследования 49
2.3. Рентгенологические методы исследования 53
2.4. Молекулярно–генетические методы исследования
2.4.1. Получение образцов биологического материала 54
2.4.2. Выделение ДНК пародонтопатогенов и геномной ДНК человека 56
2.4.3. Выделение РНК генов: TNF, MMP8, MMP9, IL8 57
2.4.4. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени 59
2.4.5. Нормировка данных 62
2.5. Методы статистического анализа 62
ГЛАВА 3. Результаты исследования 65
3.1. Общая характеристика обследованных лиц 65
3.2. Анализ эффективности использования выбранных молекулярно-генетических маркеров при оценке состояния тканей пародонта 72
3.2.1. Анализ представленности ДНК–маркеров пародонтопатогенов у пациентов с ХГП и здоровых лиц 72
3.2.2. Анализ представленности транскриптов генов TNF, MMP8, MMP9, IL8 у пациентов с ХГП и здоровых лиц 75
3.3. Выявление гендерных различий молекулярно-генетических маркеров у пациентов с ХГП и здоровых лиц 78
3.4. Взаимосвязь молекулярно-генетических маркеров с клиническими признаками и факторами риска пародонтита 83
3.5. Выявление способности пародонтопатогенов к образованию микробных комплексов 98
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов исследования 117
Заключение 127
Выводы 129
Практические рекомендации 131
Список сокращений 132
Список литературы 134
- Роль факторов воспаления в механизмах защиты и деструкции тканей пародонта
- Факторы генетически обусловленной предрасположенности к развитию пародонтита
- Молекулярно–генетические методы исследования
- Выявление гендерных различий молекулярно-генетических маркеров у пациентов с ХГП и здоровых лиц
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Основную роль в развитии хронического генерализованного пародонтита играет микробный фактор. При нарастании степени тяжести заболевания доказано увеличение в пародонтальных карманах анаэробных представителей патогенной микрофлоры, таких как A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola, P. intermedia [Кулаков А.А. с соавт., 2011; Зорина О.А. с соавт., 2011; Грудянов А.И. с соавт., 2011; Atieh M.A., 2008; Braga R.R. et al., 2010; Elamin A. et al., 2011; Socransky S.S. et al., 2013; Bai D. et al., 2015; Torrungruang K. et al., 2015].
С помощью экспериментальных и клинических исследований у этих микроорганизмов выявлен целый ряд агрессивных факторов, способствующих разрушению тканей пародонта, что позволило выделить эти бактериальные виды в отдельную таксономическую группу пародонтопатогенов. Несмотря на доказанную роль пародонтопатогенных бактерий в этиопатогенезе хронического генерализованного пародонтита, молекулярно-клеточные механизмы разрушения пародонтальной связки остаются неизвестными [Hajishengallis G. et al., 2015], а именно, до конца не выяснен вклад протеолитической деятельности бактериальных ферментов и матриксных металлопротеиназ человека в этот процесс [Palm E. et al., 2013; Jayaprakash K. et al., 2014].
В современных исследованиях немаловажная роль отводится
аутопротеолитическим механизмам деградации соединительнотканного матрикса пародонта [Gonzalez O.A., 2014; Leite A.C.E., 2015; Moutsopoulos N.M. et al., 2015]. Одной из генетических детерминант, ответственных за повышенный риск возникновения хронического генерализованного пародонтита, в настоящее время считается наличие полиморфизма гена матриксной металлопротеиназы MMP9 (желатиназы) в промоторной области. Это приводит к аномальной гиперпродукции MMP9, вызывающей ускоренную деградацию коллагена пародонтальной связки [Янушевич О.О. с соавт., 2011; Зорина с соавт., 2013; Keles G.C. et al., 2006; Loo W.T. et al., 2011; Arajo A.A. et al., 2013].
Изучен ряд других генов, аллельное состояние которых может влиять на вероятность развития пародонтита, а также на скорость прогрессии и тяжесть заболевания: IL–1, IL–6, IL–8, TNF, коллагенов 1 и 2 типа и др. [Почтаренко В.А. с соавт., 2005, 2006; Николаева Е.Н., 2007; Атрушкевич В.Г., 2010; Вишнягова Cirelli J.A. et al., 2009; Costa A.M. et al., 2010; Corbi S.C. et al., 2012; Finoti L.S. et al., 2013; Borilova–Linhartova P. et al., 2013; Ding C. et al., 2014; Barnea T.V. et al., 2015], но результаты проведенных исследований противоречивы. Недавно было высказано предложение, что ХГП является полигенной патологией, при которой множественные генные полиморфизмы способствуют кумуляции общего риска развития заболевания путем влияния на иммунный ответ организма и состав микробиоты полости рта [Divaris K. et al., 2013].
В этой связи крайне актуальной является проблема поиска прогностически значимых генетических маркеров предрасположенности к пародонтиту, а также разработка диагностических тест–систем для определения соответствующих транскриптов на фоне конкретного бактериального биоценоза. Решение этой задачи может внести решающий вклад в создание концепции, описывающей развитие пародонтита, и обеспечить основу для назначения этиотропных средств его лечения.
Степень разработанности темы исследования
В последние годы в арсенале научных методов появился новый инструмент генетического исследования, основанный на анализе экспрессии генов в клеточной популяции, образце ткани или органа по матричной РНК. Анализ представленности транскриптов генов уже начинает активно использоваться во многих областях медицины: неврологии, ревматологии, аллергологии, онкологии. Определение РНК-маркеров применяется для диагностики заболеваний различной этиологии, для выявления скрытых воспалительных процессов, для уточнения типа опухолей [Quackenbush J., 2006; Izuhara K. et al., 2006; van der Pouw Kraan T.C. et al., 2007; Haroutunian V. et al., 2009; Fedenko E.S. et al., 2011; Mjsberg J. et
al., 2012; Bourmenskaya O., 2014]. На сегодняшний день уже разработан ряд тест– систем и выпускаются коммерческие наборы для проведения анализа.
Однако для исследования генетических маркеров повышенного риска развития пародонтита этот метод в нашей стране не применялся, а в зарубежной литературе имеются лишь несколько работ [Papapanou P.N. et al., 2004; Kubota T. et al., 2008; Demmer R. et al., 2008]. Несмотря на малое количество исследований, посвященных анализу транскриптома при пародонтите, они позволили получить интересные результаты о роли протеолитических ферментов и сигнальных молекул в патогенезе пародонтита.
Изучение представленности транскриптов цитокинов, матриксинов и
лифмокинов может быть мощным диагностическим инструментом в
пародонтологии. Понимание взаимосвязи генетических факторов с клинико– рентгенологической картиной заболевания позволит совершенствовать методы ранней диагностики хронического пародонтита, повысить эффективность лечения и правильно оценить прогноз заболевания. Быстрая и объективная диагностика поможет значительно снизить уровень ошибок при постановке диагноза, даст возможность в реальном времени следить за результативностью лечения, немедленно внося необходимые корректировки.
Цель исследования
Целью работы явилось выявление прогностически значимых молекулярно-генетических маркеров, уровень представленности которых ассоциирован с факторами риска развития хронического генерализованного пародонтитита.
Задачи исследования
-
На основании анализа клинических и молекулярно-генетических исследований провести отбор кандидатных факторов для углубленного исследования их роли в патогенезе пародонтита.
-
Изучить диагностические возможности новых тест–систем для определения РНК–маркеров провоспалительных белков (TNF, MMP8, MMP9,
IL8) в образцах биоматериала из пародонтального кармана методом обратной транскрипции в сочетании с ПЦР «в реальном времени».
-
Исследовать наличие взаимосвязей между клинически определяемым состоянием тканей пародонта, степенью представленности пародонтопатогенов в поддесневом микробиоме и локальными уровнями транскриптов генов TNF, MMP8, MMP9, IL8.
-
Провести анализ гендерных особенностей представленности пародонтопатогенов и специфических транскриптов в десневой жидкости здоровых лиц и содержимом пародонтальных карманов у пациентов с ХГП.
-
Исследовать влияние наследственной отягощенности и средовых факторов риска, таких как табакокурение, на содержание пародонтопатогенов и кандидатных РНК–маркеров.
Научная новизна исследования
Впервые получены данные о возможности использования новых тест– систем для определения РНК–маркеров в образцах биоматериала из пародонтального кармана методом обратной транскрипции в сочетании с ПЦР «в реальном времени».
Впервые получены данные о наличии гендерных различий состава поддесневой микрофлоры и характера экспрессии генов провоспалительных белков (IL8, TNF, MMP8, MMP9), что доказывает существование различий в механизмах развития пародонтита у мужчин и женщин.
Впервые проведено исследование взаимосвязей между состоянием тканей пародонта, наличием у пациента отягощающих наследственных факторов риска, курением, представленностью в поддесневом содержимом ДНК–маркеров пародонтопатогенов и РНК–маркеров генов IL8, TNF, MMP8 и MMP9 человека.
Теоретическая и практическая значимость работы
Разработаны новые диагностические тест-системы для определения молекулярно-генетических маркеров типичных форм пародонтита.
Создана методика количественной оценки уровня представленности транскриптов в содержимом пародонтальных карманов методом обратной транскрипции в сочетании с ПЦР «в реальном времени».
Разработаны практические рекомендации для врачей–стоматологов по использованию методики количественной оценки молекулярно-генетических маркеров в содержимом пародонтальных карманов, что позволяет расширить возможности ранней диагностики и оценки эффективности лечения пародонтита.
Обнаружены гендерные различия в представленности бактериальных патогенов в поддесневой биопленке у здоровых лиц и пациентов с ХГП. При пародонтите возрастает количество P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythia и T. denticola, причем степень тяжести ХГП у женщин наиболее значимо коррелирует с уровнем P. gingivalis, а у мужчин – с содержанием T. forsythia.
Выявлено существенное повышение колонизации P. gingivalis и
P. intermedia у пациентов с неблагоприятной наследственностью, которое при наличии генетической отягощенности одновременно по двум линиям сопровождается повышением уровня мРНК IL8.
Установлены корреляции между состоянием тканей пародонта,
гиперколонизацией T. forsythia и повышением уровней транскриптов генов матриксных металлопротеиназ (MMP8 и MMP9) у курящих пациентов, что обосновывает применение этих маркеров для оценки прогноза развития и тяжести течения пародонтита.
Получены данные о повышении уровня транскрипта гена IL8 у пациентов с
ХГП в стадии обострения, что указывает на возможность применения данного
молекулярно-генетического маркера для оценки степени активности
воспалительно-деструктивного процесса и прогноза течения заболевания.
Методология и методы исследования
Диссертация выполнена в соответствии с принципами и правилами доказательной медицины. Использованы клинические, рентгенологические, молекулярно-генетические и статистические методы исследования. Объектом
исследования были пациенты с ХГП и здоровые лица обоих полов в возрасте от 27 до 63 лет. Предмет исследования – представленность транскриптов генов TNF, IL8, MMP8, MMP9 и количественное содержание 5 пародонтопатогенов (P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, T. forsythia, T. denticola, P. intermedia) в десневой жидкости здоровых лиц и содержимом пародонтальных карманов у здоровых лиц и пациентов с ХГП различной степени тяжести.
Научные положения, выносимые на защиту
1. Клинические признаки, характеризующие степень воспаления и
деструкции тканей пародонта, находятся в тесной взаимосвязи с качественным и
количественным составом пародонтопатогенов в поддесневом микробиоме, за
исключением A. actinomycetemcomitans, а также с локальным уровнем
транскрипта гена IL8.
2. У мужчин и женщин имеются существенные различия в составах
поддесневой микрофлоры и в экспрессии генов - факторов противомикробной
защиты. У мужчин с ХГП наиболее часто выявляется гиперколонизация ПК
T. forsythia, а у женщин - P. gingivalis, причем у мужчин даже при высоком
содержании пародонтопатогенов в поддесневом микробиоме клинические
признаки воспаления и деструкции тканей пародонта могут отсутствовать.
3. При наличии у пациентов отягощающих наследственных факторов по
заболеваниям пародонта наблюдается повышение содержания P. gingivalis в
поддесневом микробиоме и более высокий уровень мРНК IL8. У курящих
пациентов отмечается гиперколонизация пародонта T. forsythia и повышение
уровней транскриптов генов MMP8 и MMP9.
Степень достоверности и апробация результатов
Степень достоверности определяется достаточным количеством пациентов группы исследования (288 человек), современными методами исследования (молекулярно-генетическое исследование ДНК-маркеров 5 пародонтопатогенов методом ПЦР «в реальном времени», исследование мРНК маркеров генов TNF,
IL8, MMP8, MMP9 методом ОТ–ПЦР), применением адекватных методов
статистической обработки данных (параметрические критерии Стьюдента и
Фишера, непараметрические критерии Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса,
ранговой корреляции Спирмана). Добровольное участие пациентов в исследовании подтверждалось их письменным согласием.
Результаты исследования доложены на научно-практических конференциях:
– News of science. Proceedings of materials the international scientific conference. Czech Republic, Karlovy Vary – Russia, Moscow, 30–31 August 2015.
– VI Научно-практическая конференция молодых ученых «Актуальные проблемы стоматологии и челюстно-лицевой хирургии». – Москва, 2015.
– VII Научно-практическая конференция молодых ученых
«Фундаментальные и прикладные проблемы стоматологии и челюстно-лицевой хирургии». – Москва, 2016.
Апробация диссертационной работы состоялась 03 ноября 2016 г. на
совместном заседании сотрудников кафедры Стоматологии ИПО ФГБОУ ВО
Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России, отделения
терапевтической стоматологии, отделения эндодонтии и кариесологии, отделения профилактики стоматологических заболеваний ФГБУ ЦНИИС и ЧЛХ Минздрава России.
Внедрение результатов исследования
Результаты работы используются в учебном процессе на кафедре Стоматологии ИПО ФГБОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России и внедрены в клиническую практику отделения терапевтической стоматологии ФГБУ ЦНИИС и ЧЛХ Минздрава России.
Личный вклад автора в выполнение работы
Автором проведены все ключевые этапы выполнения данного
исследования: анализ современной научной литературы по теме диссертации; выбор генов–кандидатов на роль прогностических значимых РНК–маркеров
развития пародонтита; отбор пациентов, удовлетворяющих критериям включения в исследование; проведение стоматологического обследования 288 человек (204 пациента с ХГП различной степени тяжести и 84 здоровых человека) с индексной оценкой состояния тканей пародонта; получение биологических образцов поддесневого содержимого для молекулярно-генетических исследований (в общей сложности – 1728 образцов); формирование электронных массивов и статистическая обработка полученных данных с применением параметрических и непараметрических методов; анализ полученных результатов; подготовка материалов диссертации, публикаций и докладов.
Объем и структура работы
Роль факторов воспаления в механизмах защиты и деструкции тканей пародонта
Частота генетических полиморфизмов может значительно варьировать среди различных этнических групп, поэтому применение таких маркеров для диагностики и прогноза течения пародонтита следует рассматривать в разных популяциях.
Мета–анализ, проведенный C. Ding et al. (2014), показал, что генотип TNF –308G /А был связан с повышенным риском ХГП у азиатов и кавказцев, и этот полиморфизм был в значительной степени связан с повышенным риском агрессивного пародонтита у азиатов и кавказцев. Азиатские лица с генотипом АА в локусе –863C / A имели более высокий риск развития пародонтита. Между ХГП и наличием полиморфизма TNF –238G /A статистически значимая связь не обнаружена [94]. G.G. Song et al. (2013) провели мета–анализ по изучению предрасположенности к пародонтиту у лиц с полиморфизмом TNFА в локусах – 308 A/G и –238 A/G в разных этнических популяциях. Анализ показал, что повышенная предрасположенность к пародонтиту, связанная с полиморфизмом гена TNF –308 A/G, выявлена в исследованиях с участием представителей бразильского, азиатского и турецкого населения [221]. Мета–анализ Xie C. et al. (2012) показал, что полиморфизм TNFА –308 был связан с пародонтитом в китайской популяции [242].
Целью исследования W. Yang et al. (2013) было оценить связь четырех полиморфизмов гена TNF (–1031T / C, –857C / T, –308G / А и –238G / А) с предрасположенностью к ХГП и АП у китайского населения. Авторы показали, что TNF –1031CC генотип является фактором риска для ХГП, а TNF –308AA генотип является фактором риска для АП. Ассоциации полиморфизмов TNF – 238G /А и –857C / T с предрасположенностью к AП или ХГП у китайского населения не выявлено [244]. В результате исследований, проведённых И.Л. Горбуновой (2009), Н.А. Вишняговой (2011), получены статистически значимые данные о наличии ассоциации между продукцией цитокина TNFa (A/A, G/A, G/G) при G(–308)/А и степенью тяжести ХГП. Однако, несмотря на то, что при пародонтите имеется тенденция к увеличению частоты А–аллеля промотора –308 гена TNFa, достоверной разницы в распределении генотипов между группами больных хроническим генерализованным пародонтитом и пациентов с интактным пародонтом не обнаружено [8, 9].
Противоречивые результаты, наблюдаемые в литературе, можно объяснить несколькими факторами: различными критериями при постановке диагноза, неоднородностью населения, наличием других факторов повышенного риска развития пародонтита, искажающих результаты исследования (демографических, экологических, поведенческих). Отсутствие связи между генотипами и показателями клинического пародонтологического статуса может быть связано с небольшим размером выборки, особенно для аллелей с низкой частотой встречаемости в популяции. Наконец, генетическая основа пародонтита может быть обусловлена несколькими полиморфными генами, действующими синергично друг с другом и факторами окружающей среды, повышая вероятность развития заболевания [163].
Исследований, посвященных изучению полиморфизма генов матриксных металлопротеиназ ММР–1, ММР–2, ММР–3, ММР–9, ММР–12, проведено достаточно много, но их результаты также крайне противоречивы.
Так, C.M. Astolfi et al. (2006) установили наличие взаимосвязи аллельных вариантов генов ММР–1 и ММР–3 с развитием ХГП в бразильской популяции [58]. В исследовании Z. Cao et al. (2005) установлена связь полиморфизма в промоторной области гена ММР–1 с генерализованным агрессивным пародонтитом у представителей китайской популяции [77]. D. Pirhan et al. (2008) показали, что однонуклеотидная замена в промоторной области гена ММР–1 приводит к существенному повышению уровня транскрипции этого фермента и оказывает влияние на эффективность лечения ХГП [197]. В ряде исследований была выявлена взаимосвязь полиморфизма гена ММР-9 с развитием пародонтита. В работе G.C. Keles et al. (2006) исследовался полиморфизм аллеля C/T в участке -1562 в промоторной области гена ММР-9. Образцы венозной крови и ДНК были получены от 70 больных с ХГП тяжелой степени и 70 здоровых испытуемых. Генотип и частоты аллелей были проанализированы с помощью критерия %2. В результате была обнаружена существенная разница генотипов ММР-9 между группами больных хроническим пародонтитом и здоровых людей. При пародонтите отношение шансов для генотипов СТ и комбинации СТ и ТТ составило 0,4 (95% доверительный интервал от 0,17 до 0,93, p = 0,02) по сравнению с генотипом CC - 0,37 (95% доверительный интервал 016 до 0,85; р = 0,01) [159].
W.T. Loo et al. (2011) исследовали значение полиморфных позиций в гене MMP9 и уровень накопления металлопротеиназ при хроническом пародонтите. Гомозиготный генотип C/C в промоторной зоне гена MMP9 найден у 51% больных пародонтитом и только у 17% здоровых. Изучение уровня продукции белков с помощью ИФА с высокой степенью достоверности (p 0,001) показало, что наличие мутантного генотипа MMP9 приводит к повышению уровня накопления соответствующего белка в крови [178].
Напротив, в исследовании О.А. Зориной (2011) установлено, что у пациентов с ХГП выявлена повышенная частота варианта -1562Т (rs3918242) гена ММР9. Частота встречаемости аллеля Т среди пациентов с ХГП составляла 47,0% по сравнению с 25,7% в контрольной группе (х2=29,03; p=710-8). Согласно аутосомно-доминантной модели наличие аллеля T является фактором риска ХГП: OR= 7,97 (2,84 - 22,42). Частота встречаемости генотипа TT среди пациентов с ХГП была в 6 раз выше, чем среди здоровых пациентов (х2=16,95; p=410-5). Согласно аутосомно-рецессивной модели фактором риска ХГП является генотип ТТ: OR=2,57 (1,63 - 4,05) [28].
Факторы генетически обусловленной предрасположенности к развитию пародонтита
Комплект реагентов основан на использовании процесса амплификации ДНК методом ПЦР. Процесс амплификации заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров (затравок) с комплементарными последовательностями и последующей достройкой полинуклеиновых цепей ДНК–полимеразой. Для детекции результата амплификации использовали ДНК–зонды, каждый из которых содержал флуоресцентную метку и гаситель флуоресценции. При образовании специфичного продукта ДНК–зонд разрушался, действие гасителя на флуоресцентную метку прекращается, что ведет к возрастанию уровня флуоресценции. Количество разрушенных зондов (а, следовательно, и уровень флуоресценции) возрастало пропорционально количеству образовавшихся специфических амплификатов и измерялось на каждом цикле амплификации.
ДНК–зонды, использующиеся для детекции продуктов амплификации искомой ДНК и внутреннего контрольного образца, мечены флуоресцентными метками Fam и Hex соответственно, что позволяет раздельно регистрировать результаты амплификации ДНК исследуемых образцов.
Для повышения чувствительности и специфичности реакции применялся «горячий» старт, который обеспечивался методикой приготовления реакционной смеси, состоящей из двух слоев, разделенной прослойкой из парафина. Смешение слоев и превращение их в амплификационную смесь происходило только при плавлении парафина, что исключало неспецифический отжиг праймеров на ДНК– мишени при начальном прогреве пробирки.
Необходимое количество пробирок с подготовленной реакционной смесью, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонд, маркировали согласно количеству анализируемых образцов.
Во все промаркированные пробирки добавляли раствор Taq–полимеразы. Во все промаркированные пробирки (кроме пробирок К– – отрицательный контрольный образец, К+ – положительный контрольный образец) вносили 5 мкл анализируемого препарата ДНК или кДНК.
Контрольные образцы необходимы для исключения ложных результатов, возникающих вследствие артефактов детекции. В пробирку К– вносили отрицательный контрольный образец (должен давать отрицательную реакцию, так как сам образец не содержит фрагментов ДНК, необходим для контроля чистоты реактивов). В пробирку К+ вносили положительный контрольный образец (всегда дает положительную реакцию, так как уже содержит клонированный фрагмент специфической ДНК, необходим для проведения сравнения результатов с опытными образцами).
Амплификацию проводили согласно режимам, прописанным в инструкции к набору. Результаты ПЦР в реальном времени регистрировали в графическом виде по кривой флуоресцентного сигнала, пересекающей линию порога базовой флуоресценции с определением значения порогового цикла (Ct-цикла), при котором это пересечение происходило (Рисунок 5). С помощью программного обеспечения получали отчет о проведенном исследовании в цифровом виде для
Для определения соотношения пародонтопатогенов в образцах, Ct каждого маркера нормировали относительно общей бактериальной массы, представленной в образце (детекция по консервативному участку гена 16S рРНК). Таким образом, обсеменённость пародонта конкретным патогеном принимали равной его доле в микробиоценозе, выраженную в процентах.
Количество выявленных транскриптов (кДНК) нормировали на количество геномной ДНК человека (фрагмент гена рецептора гормона роста). Таким образом, концентрация каждого конкретного транскрипта выражалась в виде доли этого транскрипта в общем транскриптоме содержимого пародонтального кармана.
Нормированные значения, соответствующие уровню представленности каждого микроорганизма или транскрипта, рассчитывали с помощью метода Ct. С целью нормировки сигнала (учёта разброса в количестве взятого биоматериала и эффективности экстракции ДНК) для каждого образца определяли величину «относительного Ct». Для этого из величины абсолютного Ct для специфического набора праймеров и зонда, усреднённого по двум образцам одной серии, вычитали усреднённую величину Ct общей бактериальной массы (или геномной ДНК человека при исследовании транскриптов) для тех же двух образцов серии. Статистической обработке подвергали данные, выраженные в форме относительного Ct.
В ходе проведения работы были использованы интернет ресурсы: – Сервер NCBI (National Center for Biotechnology Information) Национальный центр информации по биотехнологии США (http:www.ncbi.nlm.nih.gov). – GenBank – база данных генетических последовательностей, поддерживаемая NIH (National Institutes of Health), содержащая коллекцию общедоступных последовательностей ДНК, РНК и белков (http:www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html). Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета Statistica 8,0 для Windows, по стандартным методикам вариационной статистики. В случае нормального распределения величин в выборках сравнение проводили путем анализа значений t–критерия Стьюдента и F–критерия Фишера. t–критерий Стьюдента – общее название для класса методов статистической проверки гипотез (статистических критериев), основанных на распределении Стьюдента. Наиболее частые случаи применения t–критерия связаны с проверкой равенства средних значений в двух выборках. F–критерий Фишера – статистический критерий, тестовая статистика которого при выполнении нулевой гипотезы имеет распределение Фишера (F– распределение). В случае нарушения нормальности распределения величин внутри выборок использовали непараметрические критерии Краскела–Уоллиса и Манна–Уитни. Критерий Краскела–Уоллиса предназначен для проверки равенства медиан нескольких выборок. Данный критерий является многомерным обобщением критерия Уилкоксона–Манна–Уитни. U–критерий Манна–Уитни – статистический критерий, используемый для оценки различий между двумя независимыми выборками по уровню какого–либо признака, измеренного количественно. Позволяет выявлять различия в значении параметра между малыми выборками.
При анализе взаимосвязей внутри пары количественных или порядковых качественных признаков использовали корреляционный анализ по методу Спирмана.
Метод ранговой корреляции Спирмана позволяет определить силу и направление корреляционной связи между двумя признаками или двумя профилями (иерархиями) признаков. Задача корреляционного анализа сводится к проверке уровня значимости полученных коэффициентов корреляции. При расчете коэффициента ранговой корреляции Спирмана не требуется никаких предположений о характере распределений признаков в генеральной совокупности, необходимо лишь располагать двумя рядами значений, которые могут быть проранжированы. Такими рядами значений могут быть:
Молекулярно–генетические методы исследования
Одной из задач исследования являлось проведение отбора генов– кандидатов на роль прогностических значимых РНК–маркеров развития пародонтита и отработка методики выделения транскриптов из образцов десневой жидкости/содержимого пародонтальных карманов, позволяющую исследовать состав РНК–маркеров.
В рамках работы была апробирована система для оценки содержания локального уровня транскриптов генов четырех защитных факторов организма, которые были выбраны в качестве РНК–маркеров: фактора некроза опухолей TNF, матриксных металлопротеиназ MMP8 и MMP9, провоспалительного лимфокина IL8.
Содержание специфических транскриптов анализировали с помощью метода ОТ-ПЦР, используя набор «Дентофлор» производства «ДНК–Технология» (Россия, Москва). Кроме того, проводили оценку содержания суммарной геномной ДНК человека по маркеру КВМ (входит в состав набора «Дентофлор»).
В отличие от бактериальных патогенов, распределение которых по поверхности тканей пародонта за счет межвидовой конкуренции и стратификации микробиоценоза было достаточно устойчивым и гомогенным, существенной трудностью при исследовании транскриптов является приуроченность транскриптома к определенной клеточной популяции. Поскольку воспаление и деградация тканей пародонта сопровождается инфильтрацией в очаг лимфоцитов и неклональных клеток иммунной системы (нейтрофилов, моноцитов NK–клеток и других), транскриптом поражённого участка проявляет яркие отличия от незатронутой поражением ткани того же происхождения. Кроме того, высокая интенсивность защитных реакций не может не проявляться на профиле экспрессии генов резидентных клеток пародонта (фибробластов, тканевых макрофагов и других). С учетом этого важным этапом отработки метода диагностики пародонтита с использованием анализа транскриптов являлась унификация метода отбора образцов. Содержимое пародонтальных карманов извлекали из наиболее глубоких участков с помощью стерильных бумажных эндодонтических штифтов. Забор материала проводили дважды от каждого пациента.
Визуальный анализ отбираемого материала показал, что пораженные участки пародонта содержат существенно большее количество эндогенного материала человека по сравнению с образцами здоровых участков пародонта: они более интенсивно окрашены гемоглобином и содержат больше нерастворимой фазы. Поскольку ранее было показано, что общая бактериальная обсемененность лишь незначительно увеличивается при обострении хронического пародонтита, можно предполагать, что значительная часть наблюдаемой в образцах нерастворимой фазы приходится на собственные клетки человека. Таким образом, разработка универсального подхода к нормировке сигнала при транскриптомном анализе образцов нормальной и пораженной ткани пародонта может столкнуться с существенными трудностями.
Оценку содержания в образцах специфических транскриптов выполняли с помощью ПЦР в реальном времени в формате Taqman – «примыкающие пробы» по параметру Ct. При описании результатов рассчитывали медиану признака, квантили и непосредственное значение степени достоверности (р).
Характеризуя уровень содержания транскриптов, необходимо отметить, что образцы от 12 (4,2%) первично обследованных пациентов не позволяли выделить суммарную РНК, пригодную для определения хотя бы нормировочного сигнала по мРНК. Однако, из этих 12 человек только двое относились к группе пациентов с легкой степенью хронического пародонтита: остальные были клинически здоровы. Таким образом, при работе с пациентами с диагнозом «хронический пародонтит» доля пациентов, не подлежащих исследованию на содержание транскриптов, составила не свыше 0,9%.
Как показал анализ, между выборками пациентов с ХГП (основная группа) и здоровых лиц (контрольная группа) не выявлено статистически достоверных различий в содержании исследованных маркерных транскриптов генов TNF, MMP8, MMP9, IL8 и геномной ДНК человека.
Таким образом, сравнительный анализ молекулярно-генетических показателей основной и контрольной групп (без разделения по полу) показал, что значения Ct для пародонтопатогенов P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythia, T. denticola жёстко коррелируют с патологическим состоянием пародонта: значение уровня достоверности р при этом достигали 10–6. Только для такого опасного пародонтопатогена, известного своими агрессивными свойствами по отношению к тканям пародонта, как A. actinomycetemcomitans не было выявлено разницы в значениях Ct в основной и контрольной группах. Локальные уровни исследованных маркерных транскриптов TNF, MMP8, MMP9, IL8 и геномной ДНК человека у здоровых лиц и пациентов с ХГП достоверно не различались.
Выявление гендерных различий молекулярно-генетических маркеров у пациентов с ХГП и здоровых лиц
Рассматривая уровни содержания транскриптов, необходимо отметить, что образцы от 12 первично обследованных пациентов не позволяли выделить суммарную РНК, пригодную для определения хотя бы нормировочного сигнала по мРНК. Однако, из этих 12 человек только двое относились к группе пациентов с легкой степенью хронического пародонтита: остальные были клинически здоровы. Таким образом, при работе с пациентами с диагнозом «хронический пародонтит» доля пациентов, не подлежащих исследованию на содержание транскриптов, составила не свыше 0,9%.
Проведенный статистический анализ позволил установить, что гиперколонизация пародонта четырьмя из пяти пародонтопатогенов P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythia и T. denticola в рамках исследованной выборки ассоциирована с наличием диагноза «пародонтит». Наиболее жесткой эта корреляция является для P. gingivalis. Напротив, в рамках исследованной выборки вид A. actinomycetemcomitans одинаково часто встречался у здоровых лиц и пациентов с ХГП, при этом с помощью набора «Дентофлор» было выявлено значительное число лиц с высокой степенью обсемененностью пародонта A. actinomicetemcomitans, но без клинических признаков ХГП.
Обнаруженное отсутствие корреляции между количеством A. actinomicetemcomitans в составе поддесневой микрофлоры и степенью тяжести пародонтита является важным результатом нашей работы. С учётом наличия в литературе убедительных свидетельств особо агрессивных свойств этого патогена, способного к сплошной колонизации пародонта с полным вытеснением нормофлоры, можно предполагать неэффективность используемых в составе набора «Дентофлор» олигонуклеотидов для выявления вида A. actinomicetemcomitans. Возможно, что входящие в состав набора «Дентофлор» олигонуклеотиды не способны обеспечить дискриминацию A. actinomicetemcomitans на фоне непатогенных представителей рода Aggregatibacter, например A. segnis или A. aphrophilus. Использование количественных, а не только качественных методов, позволивших применить методы статистического анализа выборок в норме и при патологии, является основной причиной того, что в рамках настоящей работы были обнаружены существенные гендерные различия в составе микробиоценозов, а также отличия в составе локального уровня транскриптов цитокинов и матриксных металлопротеиназ.
В рамках нашей работы впервые было выявлено, что гиперколонизация пародонта P. gingivalis жестко коррелирует со степенью тяжести пародонтита у женщин, но не у мужчин. Напротив, T. forsythia является ключевым фактором бактериальной обсемененности, коррелирующим со степенью тяжести хронического пародонтита у мужчин. Хотя мужчины и женщины в среднем имеют на поверхности пародонте равные количества пародонтопатогенов, мужчины существенно меньше подвержены риску возникновения хронического пародонтита. Иными словами, среди мужчин со здоровым пародонтом имеется высокая доля лиц, пародонт которых в значительной степени колонизирован патогенными микроорганизмами, однако их деструктивное воздействие на ткани пародонта эффективно блокируется факторами местной противомикробной системы защиты.
Впервые установлено, что страдающие от хронического пародонтита женщины склонны к доминированию в составе микробиоценоза одного какого– либо вида пародонтопатогена. В то же время, для мужчин наиболее характерна множественная инфекция, которая далеко не всегда приводит к поражению пародонта. В совокупности эти данные свидетельствуют о существовании коренных отличий в механизмах развития пародонтита мужчин и женщин.
Нет сомнений, что в силу половой специфики иммунореактивности пародонта методы оценки состояния микробиоценоза пародонта на основе ПЦР в реальном времени (на примере набора «Дентофлор») позволяют достоверно выявлять причину хронического пародонтита у женщин. При обследовании мужчин анализ поддесневого микробиоценоза должен дополняться анализом локального уровня транскриптов TNF, MMP8, MMP9 и IL8.
В ходе исследования было выявлено существенное превышение колонизации P. gingivalis и P. intermedia у пациентов с неблагоприятной наследственностью по материнской линии, а при наличии наследственной отягощенности одновременно по материнской и отцовской линиям отмечалась гиперколонизация P. gingivalis с одновременным повышением уровня мРНК IL8.
Сопоставление выборок некурящих и курящих пациентов позволило выявить серьезные различия в содержании молекулярных маркеров. Как оказалось, для курящих пациентов было характерно повышение количества T. forsythia, а также увеличение уровней транскриптов генов MMP8 и MMP9. Это наблюдение показывает, что курение вызывает изменения микробиоценоза полости рта и нарушение нормального функционирования сигнальных механизмов, обеспечивающих защиту пародонта от инфекции.
Еще одним важным наблюдением, имеющим отношение к разработке метода ранней диагностики развития и оценки эффективности медикаментозного лечения пародонтита, является выявление ассоциации уровня транскрипта IL8 и степени нагноения. Поскольку IL8 является хемоаттрактантом нейтрофилов, формирующих гной, данное наблюдение не выглядит неожиданным. Однако, важно, что в случае пародонтита тип клеток, выступающий источником IL8, остается неизвестным. Поэтому новым, практически важным результатом является обнаружение соответствующего транскрипта непосредственно в содержимом пародонтальных карманов.
Кроме того, в опубликованных работах IL8 рассматривается в качестве компонента воспалительной реакции, что, по нашим данным, не совсем точно. Реакция нагноения во времени заметно отстает от Th1–ответа, причем её развитие можно трактовать как неспособность организма остановить инфекцию за счет неспецифической иммунореактивности. Полученные в ходе работы данные позволяют использовать транскрипт IL8 в качестве маркера нагноения, что может иметь важное значение для оценки степени развития инфекции, а также в тех случаях, когда нагноение имеет место, но не может быть выявлено визуально.
Полученные в ходе исследования данные позволяют предложить диагностические критерии для выявления предрасположенности к пародонтиту на стадии, когда микробный консорциум с участием пародонтопатогенов уже сложился, но деградация тканей пародонта еще не началась. Эти тесты могут также применяться при выборе тактики лечения и оценке его эффективности у пациентов с уже диагностированным ХГП.