Введение к работе
Актуальность проблемы.
В физике, химии и биологии известно множество примеров самопроизвольного образования различных макроскопических структур в открытых неравновесных системах. Согласно терминологии, введенной И. Р. Пригожиным, такие структуры называются диссипативными, а процессы образования этих структур - процессами самоорганизации.
В иммунологии хорошо известна реакция иммунопреципитации -образование в тонком слое геля узоров, в результате диффузии и взаимодействия иммуноактивных белков. Особый интерес представляет собой радиальная иммунопреципитация — диффузия одного белка из точечного источника в среде, содержащей другой белок. В результате такого процесса образуется правильное, четко очерченное кольцо, размер которого пропорционален количеству иммуноактивного белка в источнике. Эта закономерность лежит в основе единственного количественного иммунопреципитационного метода - метода радиальной иммунодиффузии. В настоящее время клиническая иммунология располагает целым арсеналом средств и методов качественного и количественного анализа иммуноактивных белков: агглютинация, иммунопреципитация в геле, нефелометрия, иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг, радиоиммуноанализ и т.д. Среди всех количественных методов, используемых для определения достаточно больших количеств белка, выгодно выделяется метод радиальной иммунодиффузии. Он достаточно прост, воспроизводим, легко доступен практически всем лабораториям клинической иммунологии и может использоваться при массовых обследованиях.
К иммунологическим методам, помимо их высокой информативности, предъявляется такое важное требование как стандартизованность. Использование при проведении массовых обследований готовых диагностикумов отчасти позволяет стандартизовать результаты, полученные в различных лабораториях. Однако, имеющиеся на сегодняшний день методы учета результатов реакции - измерение размеров колец преципитации при помощи специальных линеек и бинокулярной лупы не стандартизуется из-за того, что воспринимающим элементом является человеческий глаз. Появление прибора автоматизированного учета результатов радиальной иммунодиффузии позволит не только сократить трудозатраты, но и повысит точность измерения, что, в конечном итоге, позволит стандартизовать результаты, получаемые в различных лабораториях. Для решения задачи автоматизации в Институте аналитического приборостроения РАН ранее был разработан анализатор «ИМАТЕСТ» и программное обеспечение, для управления анализатором и обработки результатов с помощью компьютера. Однако результат предварительных испытаний этого комплекса оказался неудовлетворительным.
Определение возможностей совершенствования комплекса требовало хотя бы качественных физических представлений об исследуемом объекте. Кроме того, разработка количественной модели радиальной иммунопреципитации может оказать существенную помощь в решении задачи оптимизации существующих методик работы с готовыми стандартизованными диагностикумами. Между тем, в литературе полностью отсутствуют какие-либо количественные оценки по иммунодиффузии, а качественное представление, основанное на образовании иммунопреципитационного осадка в жидкости, не выдерживает никакой критики [Хаитов и др. 1995, Воробьева, 2000].
Следует отметить, что образование иммунопреципитационных структур происходит в открытой системе, а потому представляется возможным использовать современные физические представления из области синергетики и физики открытых систем при исследовании этого процесса. Рассматриваемая система содержит целый ряд параметров - температура среды, концентрации взаимодействующих белков, соответствующие константы скорости ассоциации и диссоциации, а также коэффициенты диффузии отдельных белков и продуктов реакции. Между тем следует ожидать, что присущее открытым системам формирование структуры обусловливается лишь одним из параметров. Представляется интересным также вопрос об упорядоченности образовавшихся структур.
Таким образом, исследование образования иммунопреципитационных колец представляется интересным не только как основа для решения различных прикладных задач, но и как самостоятельное теоретическое исследование.
Цель работы.
Основная цель настоящей работы состояла в теоретическом исследовании образования иммунопреципитационных структур в гелевой среде. Практическая цель состояла в исследовании возможностей оптимизации метода радиальной иммунодиффузии и усовершенствования комплекса автоматизированного учета результатов радиальной иммунодиффузии.
Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Провести анализ литературных данных по диффузии белков в гелевых средах.
-
Разработать количественную модель иммунопреципитации в рамках представления иммунной реакции как простой бимолекулярной реакции. Оценить оптимальное время учета результатов радиальной иммунодиффузии при количественном анализе иммуноглобулинов.
-
Построить качественную модель иммунопреципитации, дающую адекватное представление о причинах визуальной регистрации результата иммунной реакции в гелевой среде.
-
Определить специфику пространственной самоорганизации продуктов иммунной реакции при радиальной иммунодиффузии.
5. Проверить выбор схемы освещения иммунопреципитационных колец, а
также выработать практические рекомендации по совершенствованию
комплекса автоматизированного учета результатов радиальной
иммунодиффузии.
Научная новизна.
-
Впервые иммунная реакция in vitro рассмотрена как объект физики открытых систем.
-
Впервые предложены качественная и количественная модели иммунопреципитации в гелевой среде.
-
Показано, что значение константы скорости ассоциации белков определяет степень упорядоченности структуры, образуемой продуктами иммунной реакции.
Практическая ценность.
-
Обосновано техническое решение выбора освещения иммунопреципитационных узоров для получения наиболее качественных фотографий.
-
Создан новый алгоритм обработки изображений для программного обеспечения анализатора «ИМАТЕСТ 01», расширяющий возможности анализатора.
-
Обоснована возможность сокращения времени количественного анализа иммуноглобулинов в методе радиальной иммунодиффузии.
-
Предложенная в диссертационной работе количественная модель может быть использована для определения возможностей оптимизации метода радиальной иммунодиффузии при работе с другими иммуноактивными белками, а также других методов иммунопреципитации в геле.
-
Разработанные модели могут служить теоретической основой при моделировании других иммунологических реакций или процессов с участием подобных молекул, например, при исследовании иммуносуспензионных методов диагностики и разработке соответствующей приборной базы.
Положения, выносимые на защиту.
Количественная модель радиальной иммунопреципитации, позволяющая на макроуровне объяснить образование радиально-симметричной структуры продуктами иммунной реакции.
Качественная модель иммунопреципитации, показывающая образование крупных молекулярных кластеров, которые обусловливают возможность визуальной регистрации результатов иммунной реакции в гелевой среде.
Специфика пространственной самоорганизации продуктов иммунной реакции в геле при радиальной иммунодиффузии обусловливается свойствами взаимодействующих белков и среды.
Возможность сокращения времени учета результатов радиальной иммунодиффузии при проведении количественного анализа иммуноглобулинов.
Апробация результатов работы.
Основные результаты работы докладывались на семинарах ИАнП РАН, 6-ой и 7-ой Путинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2002, 2003), 10 Всероссийской конференции студентов-физиков и молодых ученых России (Москва, 2004), 3-ем съезде Биофизиков России (Воронеж, 2004).
Работа проводилась в рамках НИР "Новые принципы детекции и разработка на их основе приборов для автоматизации лабораторно-диапюстических методов исследования", выполняемой по межведомственной научно-технической программе «Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего» (№ Гос. регистрации 01.200.2 09213).
Работа также поддержана грантом Санкт-Петербургского Конкурсного центра фундаментального Естествознания (грант М05-2.4К-215).
Публикации.
Основное содержание работы отражено в 5 научных публикациях, а также в сборниках трудов конференций.
Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 139 страницах, содержит 6 таблиц и 56 рисунков.