Введение к работе
Актуальность темы. Молекула ДНК является сильно заряженным полиионом, поэтому ее конформация в значительной степени определяется природой и концентрацией экранирующих про-тивоионов в растворе. Несмотря на огромный экспериментальный материал и значительное развитие теоретических представлений о поведении полиэлектролитов, до настоящего времени остаётся много неясного во влияшш ионной силы раствора на конформа-цшо полиионов. Обобщение экспериментальных данных позволило объяснить причину полиэлектролитного набухания ДНК в разбавленных растворах с помощью представлений об электростатическом дальнодействии в полимерной цепи, а при малых концентрациях поддерживающего электролита, сравнимых с концентрацией собственных противоионов макромолекулы, ещё и вкладом электростатического близкодействия, приводящего к возрастанию пер-систенгной длины Цепи. Отметим, что конформация молекулы ДНК в области больших ионных сил изучена существенно меньше. Было показано, что при достаточно высокой концентрации низкомолекулярного электролита электростатические взаимодействия в макромолекуле перестают оказывать влияние на её конформацию, и объём молекулы ДНК сохраняет постоянное значение. При этом одновалентные противоионы даже при их предельных концентрациях в растворе не вызывают высаливания нативной ДНК, за исключением иона лития, который, нарушая гидратную оболочку макромолекулы, способствует её денатурации. Сравнение экспериментальных данных, полученных разными методами при исследовании ДНК в области умеренных и больших ионных сил, свидетельствует о существовании некоторых особенностей конформащг-онных свойств макромолекулы при больших концентрациях поддерживающего электролита. Ранее в лаборатории было обнаружено изменение оптической анизотропии тимусной ДНК при увеличении концентрации NaCl в растворе выше 2,4 М. Отметим, что для двунитевых синтетических полинуклеотидов с определешюн нуклеотндной последовательностью при достижении 2,5 М NaCl или 0,7 М MgCk многие авторы наблюдали B-»Z конформацион-ный переход из право- в левозакрученную спираль. Известно, что B-»Z-nepexofl не характерен для природных ДНК, однако ранее, при использовании больших концентраций противоионов, отмечали некоторые особенности в нх поведении, в частности, аномально узкую ширину перехода спираль-клубок. Исследованию характера изменения оптической анизотропии ДНК в области больших концентраций ионов различной природы и посвящена первая часть диссертации.
Молекула ДНК является природным полимером, выполняющим самые важные функции в биологических системах. Тем не менее, многие её свойства могут быть объяснены в рамках общих представлений о конформационных изменениях полиионов различной природы. В связи с этим интересно сопоставить поведение биологических и синтетических полимеров, а также использовать последние в качестве модельных систем для проверки полученных результатов и при апробации новых методик. В диссертационной работе проводится разработка метода ковалентной фиксации ДНК на поверхности твёрдых носителей. Этот метод был апробирован также для фиксации мицелл, образованных блок-сополимерами полистирола и полиметакриловой кислоты. Актуальность таких экспериментов обусловлена развитием микроэлектронных технологий, в которых широкое распространение получили биосенсоры - микроэлектронные приборы, преобразующие физико-химические изменения чувствительной мембраны, обладающей биологической избирательностью, в электрический сигнал. Отклик регистрируется по изменению массы, показателя преломления, а также зарядовых свойств поверхности с фиксированными макромолекулами. Биосенсор на основе ДНК-зонда может быть применён в биотехнологиях, связанных с молекулярным узнаванием специфических участков последовательности ДНК.
Ковалентная фиксация синтетических и биологических макромолекул из раствора на поверхности твёрдого носителя может быть также использована для изучения их пространственной организации методами сканирующей микроскопии. Она обладает рядом преимуществ при приготовлешш образцов по сравнению с физической сорбцией'с использованием лиофильной сушки, а именно, значительно упрощает процедуру, а также затрудняет возможность формирования дополнительных агрегатов полимера в процессе высушивания на поверхности.
Метод ковалентной фиксации может быть полезен также при исследовании конденсированных форм ДНК, которые формируются, как принято считать, после зкраїшровки около 90% ионо-генных групп на макромолекуле многозарядными катионами. Известно также, что такие ионы металлов, как Со(МНз)б3+ и даже Mg2+ в смеси метанол-вода также способны вызывать конденсацию ДНК. В связи с этим, исследование поведения ДНК в области больших ионных сил, создаваемых ионами металлов различной природы и валентности представляет значительный интерес. Сравнительный анализ таких систем может дать представления о конформационных возможностях молекулы ДНК. Таким образом, разработка новых способов фиксации биологических и синтетических макромолекул имеет большое научно-практическое значение.
Целью работы явилось: изучение оптической аішзотропии и гидродинамических свойств молекулы ДНК в растворах больших концентраций NaCl, LiCl, NH4CI и MgCh, разработка метода ко-валентной фиксации молекул ДНК на поверхности оксида и нитрида кремния, а также апробация метода фиксации для изучения размеров и формы мицелл, образованных блок-сополимерами полистирола и полиметакриловой кислоты в смеси дноксан-вода микроскопическими методами.
Научная новизна. Впервые методами двойного лучепреломления в потоке и вискозиметрии была подробно изучена конфор-мация молекулы ДНК в области больших концентраций NaCl, LiCl, NH4CI и MgCh. Установлено, что при увеличении концентрации NaCl в растворе происходит резкое увеличение оптической анизотропии в области 2,4 М NaCl.
Обнаружено изменение оптической анизотропии ДНК при увеличении концентрации соли MgCh более 0,5 М.
Впервые в целях фиксации биологических макромолекул была химически модифицирована бифункциональными реагентами поверхности нитрида кремния - материала, широко используемого в микроэлектронных технологиях.
Предложен новый метод ковалентной фиксации молекул ДНК на поверхности нитрида кремния.
Впервые была надежно осуществлена ковалентная фиксация мицелл, образованных блок-сополимерами полистирола и полиметакриловой кислоты, на поверхности твердого носителя из раствора с сохранением их пространственной организации.
Теоретическая и практическая ценность. Во всех сферах использования полизлектрошітов существенную роль играют их конформацноиные свойства, которые определяются составом и структурой макромолекул, а также свойствами растворителя. Молекула ДНК занимает особое место вследствие своей чрезвычайно большой жёсткости и огромной плотности заряда. Поэтому исследование её конформации при различных ионных условиях может способствовать развитию представлений о полиэлектролитных свойствах макромолекул. Эти данные могут быть полезны для сопоставления с выводами теоретических работ, посвященных кон-формационным свойствам полиионов.
Ковалентная фиксация биологических макромолекул на твердые поверхности имеет большое практическое значение в молекулярной биологии, медицине, пищевой промышленности, инженерной энзимологии и биотехнологии для создания биосенсоров и для осуществления покрытия ферментных реакторов многократного применения. Фиксация может быть также полезна для исследо-
вания полимерных систем методами сканирующей электронной микроскопии.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на международных конференциях Eurosensors V (1995) в Риме, 2nd European Conference on Optical Chem. Sensors and Biosensors (Europt(r)ode II (1994) во Флоренции, 2nd International Symposium Molecular order and mobility in polymer systems (1996) в Санкт-Петербурге, Фундаментальные проблемы науки о полимерах (1997) в Москве.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ в научных журналах и сборниках.
Структура диссертации. Диссертация состоит из 5 глав, оглавления, введения, и выводов. Она содержит 61 рисунок и 11 таблиц. Диссертация написана на 224 страницах. Список цитированной литературы, содержит 232 наименования.