Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Литературный обзор 8
1.1. Экспериментальные и теоретические методы конформационного анализа пептидов . 9
1.2. Прямая структурная задача 20
1.3. Структурно-функциональная организация пептидов 29
1.4. Обратная отруктурная задача 39
1.5. Метод теоретического конформационного анализа ' 50
1.6. Задачи исследовании 56
ГЛАВА II. Теоретический конформационный анализ Лейцин-Энкефалина 57
2.1. Биологические функции лейцин-энкефалина 57
2.2. Конформационные возможности лейцин-энкефалина 58
ГЛАВА III. Теоретический конфоешщионный анализ аналогов лейцин-энкефалина 69
3.1. Аналог Туг1- Gly2- Gly3- Phe4- Leu5- Arg6 70
3.2. Аналог Ty^-D- Ala2- Gly3~ Phe4- Leu5 » 72
3.3. Аналог Tyi^-D- Ala2- Gly3- Phe4- Leu5- - Arg6 79
3.4. Аналог Tyr*-D- Ala2- Gly3- Phe4- Ala5- - Arg6 84
3.5. Аналог TyrX-D~ Ala2- Gly3- Phe4- Gly5- - Arg6 88
3.6. Аналог Туг1-])- Ala2- Gly3- Phe4- Ala5- - Lys6 91
3.7. Аналог Туг ^D- Ala2- Gly3- Phe4- Ala5- - Asn6 93
3,8* Аналог Туг ^D*- Ala2- Gly3- Phe4-Aln5~ - Gin6 99
3,9. Аналог Туг -^- D- Ala2- Gly3- Phe4- Ala5- - His6 103
3,10* Аналог Туг -^-D- Ala2- Glu3-N- MePhe4- - Leu5- Arg6 106
ГЛАВА ІУ. Теоретшеский конформационный анализ n -концевого трщшкапептйда динорфина и его аналогов
4.1 Функции динорфина и схема расчета его про странственного строения ИЗ
4.2. Фрагменты Arg - Arg7, Arg - Arg9, Arg -
- bys11, bys11- Lys13 116
4.3. Фрагменты Phe 4- Arg7 и Arg 6- Arg9 121
4.4. Фрагмент Arg 9- Lys13 126
4.5. Фрагмент Туг I*-Arg 9 129
4.6. Молекула N-концевого тридекапептида динорфина 132
4.7. Аналог [D - Ala2]-динорфина I - ІЗ 137
4.8. Аналог [D - Ala ]-динорфина І - ІЗ 137
Основные выводе І40
Список опубликованных статей по теме диссертации 142
Литература 144
- Прямая структурная задача
- Конформационные возможности лейцин-энкефалина
- Аналог Tyi^-D- Ala2- Gly3- Phe4- Leu5- - Arg6
- Фрагменты Phe 4- Arg7 и Arg 6- Arg9
Введение к работе
Обшая характеристика работы. Диссертационная работа посвящена исследованию пространственного строения лейцин-энкефалина, N -концевого тридекапептида динорфина и целого ряда их аналогов методом теоретического конформационного анализа. Потенциальная энергия при расчете конформации молекул взята в виде суммы энергий взаимодействий валентно несвязанных атомов, электростатических, тороион-ных взаимодействий и водородной связи. Для поиска минимума потенциальной энергии применялся метод сопряженных градиентов, В работе была использована разработанная в проблемной лаборатории "Молекулярной биофизики" Азербайджанского Государственного университета им,С.М.Кирова универсальная программа, написанная на алгоритмическом языке "ФОРТРАН", Расчеты проводились на электронно-вычислительных машинах EC-I033, EC-I022 и БЭСМ-6,
Актуальность темы. Многие биологические процессы осуществляются при непременном участии белков и гормонов. Знание пространственной организации и динамических конформационных свойств природных олигопептидов необходимо для изучения молекулярных механизмов узнавания, стимулирования, регуляции и координации биологических процессов, явления структурно-функциональных соотношений и решения многих других вопросов, имеющих большое научное и практическое значение. Методом рентгеноструктурного анализа можно лишь определять статические состояния белков и гормонов. Теоретический кон-формационяый анализ дает представление не только о пространствен** ной структуре, но и о её потенциальных возможностях к изменению. Поэтому работы в этом направлении могут привести к получению ценной информации о тонких деталях биологических процессов на атомно-молекулярном уровне.
Цель работы. Диссертационная работа посвящена изучению пространственного строения и динамических конформационных свойств молекул эндогенных пептидных гормонов лейцин-энкефалина, динорфи-яа, а также большого числа их аналогов.
Апробация теоретического подхода, позволяющего ещё до синтеза и биологических испытаний предсказывать структуры аналогов, обладающих теми или иными функциями природных гормонов. Необходимо было найти такие химические модификации гормонов, которые сделали бы пролонгированным их действие или воспроизводили бы избирательно одну из этих функций. Для этого требовалось, во-первых, выяснить геометрические и энергетические характеристики предпочтительных конформационных состояний природных гормонов (прямая структурная задача) и, во-вторых, целенаправленно модифицировать химическое строение природных гормонов таким образом, чтобы их пространственное строение отвечало вполне определенным низкоэнергетическим конформациям природного пептида (обратная отруктурная задача).
Научная новизна. Впервые установлены пространственные структуры и конформационные возможности лейцин-энкефалина, n -концевого тридекапептида дияорфина и ряда их аналогов. Получено, что лейцин-энкефалин может иметь всего несколько низкоэнергетических структур разных типов, число которых для его аналогов значительно сокращается.
Конформационные состояния аналогов лейцин-энкефалина можно разделить на две группы: аналоги, претерпевающие вследствие замены значительные структурные изменения, и аналоги, в которых замена аминокислот приводит к заметному смещению конформационного равновесия в сторону некоторых форм природного гормона. Найдено, что N -концевой тридекапептид динорфина имеет ограниченный набор низкоэнергетических структурных типов, число которых зависит от
природы окружающей среды. Найдены аналоги, моделирующие те или иные функциональные свойства лейцин-энкефалина и динорфина.
Практическая ценность. На основе аминокислотной последовательности лейцин-энкефалина и динорфина I-I3 определены конформа-ционяые возможности и трехмерные структуры молекул, знание которых необходимо для изучения биологической активности и механизма функционирования этих молекул, а также целенаправленного поиска аналогов.
Апробирован теоретический подход и изучена пространственная структура аналогов. Исследование шляется полезным для целенаправленного синтеза аналогов этих молекул со специфическими функциями. Проведенный расчет показал возможность предсказания геометрии и конформационных возможностей гормонов и химического строения их аналогов с заведомо известными свойствами с помощью метода теоретического конформационного анализа.
Основные положения, выносимые на зашиту: I. Результаты расчета пространственной структуры лейцин-энкефалина Н - Туг1- Gly2- Gly5- Phe^~ Leu^-OH И следующих ЄГО аналогов: H-Tyr1-Gly2-Gly5-Phe4-Leu5-Arg6-OH,
H-Tyr1-D-Ala2-Gly5-Phe4-Leu5-OH,
H-Tyr1-D-Ala2-Gly5-Phe4-Leu5-Arg6-OH,
H-Tyr1 -D-Al a2-Gly3-Phe4-Al a5-Arg6-OH,
H-Tyr1 -D-Ala2-Gly3-Phe4-Ala5-Ly s6~0H,
H-Tyr1-D-Ala2-Gly5-Phe4-Ala5-Asn6-OH,
H-Tyr1 -D-Al a2-Gly5-PheZ|"-Gly 5-Arg6-OH,
H-Tyr1 -D-Ala2-Gly5-Phe4-Ala5-Gln6-OH,
H-Tyr1-D-Ala2-Gly5-phe^-Ala5-His6-OH,
H-Tyr1-D-Ala2-Gly5-N-MePhe4-Leu5-Arg6-OH.
2. Результаты расчета пространственной структуры динорфина
І-ІЗ Н -Туг1 -Gly2 -Gly5 -Phe4 -Leu5 -Arg6 -Arg7 -lie8 -Arg9 <~ -Pro10 -Lys11 -Leu12 -Lys15 -он и следующих его аналогов: [ъ -
-Ala2] - и (Ъ -Ala12] -динорфина.
Обсуждение зависимости между химической структурой и пространственным отроением рассмотренных природных и синтетических аминокислотных последовательностей,
Целенаправленный поиск химических модификаций молекул лейцин-энкефалина и динорфина, более устойчивых и воспроизводшцих биологические функции природных пептидов.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на УІ Всесоюзном симпозиуме по межмолекулярному взаимодействию и конформа-циям молекул (Вильнюс, 1982 г.), на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982 г.), на научной конференции, посвященной итогам научно-исследовательских работ за 1983 год (Баку, 1984 г»), на Республиканской конференции молодых ученых по физико-химической биологии (Баку, I98I г.), а также на семинарах кафедры оптики и молекулярной физики и проблемной лаборатории "Молекулярной биофизики" .
Публикация. Основное содержание диссертации изложено в семи публикациях.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 159 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав и выводов, содержит 10 рисунков, 35 таблиц и список цитированной литературы, включающий 135 наименований.
Прямая структурная задача
Под прямой структурной задачей будем подразумевать установление кинформационных особенностей молекулы по её химическому строению. Решение такой задачи для природных олигопептидов, приведенных в табл. I строилось на основе следующих предположений [45, 46].
Аминокислотная последовательность полностью определяет пространственное строение олРігопептидной молекулы. 2.Конформацион-ные состояния олигопептидов в физиологических условиях обладают минимальной потенциальной энергией. 3.Пространственное строение природных олигопептидов отвечает шютнеышей упаковке аминокислотной последовательности. 4.В компактных структурах олигопептидов шеет место согласованность между всеми ближними, среднши и дальніми внутримолекулярными взаимодействиями.
Под ближними подразумеваются взаимодействия боковой цепи данного остатка с двумя прилегающими пептидными группами; под среднши - взаимодействия остатка с четырьмя соседями по обе стороны в последовательности; под дальніми - взаимодействия с более удаленными по цепи остатками (рис. I). Ближние взаимодействия определяют конформационные возможности свободных монопептидов. Количественное представление об этой компоненте может дать конфор-мационный анализ соответствующих метиламидов N -ацетил-л-аминокислот. В настоящее время для всех 20 стандартных -аминокислот получены предпочтительные по ближним взаимодействиям наборы оптимальных конформаций, пригодные для расчета любой аминокислотной последовательности. На рис, 2а представлена потенциальная поверхность молекулы метиламида N -ацетил-ь -аланина как функция двугранных углов у и т/г [59, 60]. Поверхность имеет четыре области низкой энергии В, Н, ь и Р. Очень близки нонформационные карты тр- \jr у іб из 20 стандартных аминокислот, боковые цепи которых не содержат разветвление при С атоме. Потенциальные поверхности метиламидов N -ацетил-L -валина и ь -изолейцина имеют те же, но несколько более суженные области низкой энергии.Карта -тг ме-тиламида W -ацетил-глицина центросимметрична и содержит обширные и практически изоэнергетические области R( ь ) иВ( Р ), рис. 3. Потенциальная поверхность молекулы метиламида N -ацетил-ь -проли-на имеет два минимума, отвечающих значениям угла " г -60 ( R.) и- 140 ( В ), рис. 4.
Теоретические предсказания относительно информационных возможностей и положения конформационного равновесия метиламидов N -ацетил-ос-аминокислот в полярных и неполярных средах соответствуют экспериментальным данным, полученным для целого ряда этих сое-динений с помощью методов ЯМР, ДОВ, КД и ИК-спектроскопии, а также дипольных моментов и газожидкостной осмометрии \р! 65]. В то же время, сопоставление результатов расчета этих молекул с геометрией аминокислотных остатков в белках известной трехмерной структуры [60, 6б] показало, что опытные значения углов тр , J\T основной цепи всех остатков находятся только в низкоэнергетических областях (0 т 4.0 ккад/моль) конформационных карт т/ - т/г свободных монопептидов. Удовлетворительное соответствие имеется и между т о о Я сечениями потенциальной поверхности У f , У "Ї ме тиламидов N -ацетил-ot-аминокислот и конформационными состояниями боковых цепей в трехмерной структуре белка [бб - 68]. Обнаружение корреляции между геометрией всех аминокислотных остатков в природных последовательностях и низкоэнергетическими состояниями свободных монопептидов [60, 66 - 68J имело решающее значение в разработке теоретического подхода к решению прямой структурной задачи олигопептидов [45, 46]. Наличие корреляции показало, что ближние взаимодействия определяют для. всех стандартных остатков наборы дозволенных пространственных форм. При свертывании пептидной цепи в нативную структуру только из таких наборов происходит выбор (вначале под действием средних, а затем дальних взаимодействий) конформационных состояний всех остатков. Реальными оказываются лишь те предпочтительные по ближним взаимодействиям кон-формации остатков, сочетание которых в данной аминокислотной последовательности обеспечивает образование самых выгодных стабилизирующих межостаточных контактов. Такім образом, специфичной для нативной структуры любого природного пептида оказывается последовательность конформационных состояніш остатков, а не сами состояния. Ситуация здесь в принципе аналогична химическому строению природных пептидов.
Из-за огромного количества исходных вариантов, которые могут быть составлены из низкоэнергетических конформаций остатков, непосредственное решение прямой структурной задачи возможно лишь для коротких последовательностей, включающих не более 4-5 звеньев. Для более высокомолекулярных пептидов цель может быть достигнута только при разделении всей задачи на ряд менее громоздких задач и их последовательном решении. Возможность использования поэтапного подхода обусловлена наличием согласованности между всеми ближними, средними и дальними взаимодействиями. На этой основе получено решение большого числа прямых структурных задач для весьма сложных олигопептидов и низкомолекулярных белко
Конформационные возможности лейцин-энкефалина
При замене четвертого остатка пептидов ВРРк и N -MeAla 4 ВРРс OOOTBeTCTBeHHO Ha D -Ala - И D -N ЧИеАІа - BPPg ВСЄ CTpyK туры, разрешенные для молекул с ь -конфигурацией, окажутся запрещенными для молекул с другой конфигурацией. Поэтому синтетические аналоги D - Ala4 - BPPg и D -N -MeAia 4 BPPg не будут обладать физиологическими свойствами природного соединения. Альтернативный запрет на структуры действует при условии, когда заменяемый ь -остаток предшествует пролину. Но даже, если это уоловие не соблюдается, включение в ь -последовательность D -аминокислоты, особенно замещенной по азоту, может оказаться наиболее эффективным способом решения обратной структурной задачи. Это завиоит от конкретной последовательности, конформационных возможностей природного пептида и цели исследования. Так, замена ь -остатка, находящегося в интересующей структуре в состоянии В, на D -остаток всегда приведет к её запрету. Если же заменяемый остаток имеет L форму основной цепи, то с включением D -остатка возрастает вероятность реализации соответствующего конформационного состояния, поскольку при этом понижается энергия ближних взаимодействий данного остатка и, расширяется область разрешенных значений его углов Y , Цг (рис. 2), что может привести к установлению более эффективных межостаточных контактов. Большие возможности для целенаправленной детерминации ион омой структуры открываются при замещении глицина на ь - и D -аланин. При первой замене окажутся запрещенными все конформации, в которых углы р , яг глицина попадают в область Р, а конформации с углами тр , у глицина в области ь станут менее вероятными. В случае замены Giy на D -Ala окажутся невозможными конформации о В формой глицина, а менее вероятными с В. формой. Кроме того, включение в цепь D -остатка скажется на взаимоотношении пептида с пептидазами и приведет к пролонгированию его действия.
Решение обратной структурной задачи яонапептидного горюна сна также отроится на основе известного набора всех низкоэнергетических конформации природной молекулы и упоминавшихся выше простейших и встречающихся в природе химических модификаций аминокислотных последовательностей.
До сих пор, при решении обратной структурной задачи были использованы такие аминокислотные замены, воздействие которых на конформационные возможности молекулы легко поддавались априорной оценке, во всяком случае на уровне формы основной цепи и шейпа. Строгий количественный анализ требовался лишь для определения порядка расположения конформационных состояний по величинам энергии в узком ряду отобранных вариантов. Однако, все замены, не касающиеся остатков глицина и пролина, не ведут к априорному исключению каких-либо форм и шейпов пептидного окелета. Влияние таких замен на конформационные возможности зависит не столько от ближних, сколько от средних и дальних взаимодействий, т.е. от очень сложной внутримолекулярной контактной системы, определяемой не отдельными остатками, а всей последовательностью. Поскольку в каждом случае ситуация уникальна, то выявить последствия замен даже в отношении форм и шейпов пока можно только расчетным путем. Следующий объект рассмотрения - аналог -пептида, в котором оотатки Ala 2 и Gly 8 заменены на Vai 8. Можно было ожидать, что включение в последовательность сразу двух остатков с объемными и негибкими боковыми цепями существенно изменит энергетическое распределение конформацйи природного нонапептида. Однако до расчета трудно было предположить, что глобальной структурой модифицированной последовательности станет конформация УШ, имеющая в выделенном для 8 -пептида ряду самую высокую энергию. Оказалось, что оба остатка валина хорошо вписываются только в структуру УШ, не изменяя её геометрию и не разрушая сложившуюся систему взаимодей о о ствий; стабильность этой структуры у Vai » -аналога возрастает по сравнению с 8 -пептидом на 8.0 ккал/моль.
Следующая модификация &-пептидной последовательности - заметі я на Asp на Asn , самая незначительная в стерическом отношении, но весьма существенная в электронном. Она делает реальными для Asn 5 -S-пептида структуры лишь одного типа eefeefe , среди которых доминирует конформация Па. Как показывает расчет, в этом случае изменения касаются только двух межостаточных взаимодейст с Я т вий, а именно контактов Asn с Gin и с Trp . Отсутствие отрицательного заряда у остатка в пятом положении, являющегося центральным в структуре Па снимает электростатическое отталкивание между остатками первой пары (о +6.8 ккал/моль у природного -пептида до +0.2 у Asn -аналога). Одновременно,правда, иочезает стабилизирующее полярное взаимодействие между остатками второй пары, которое, однако, у S -пептида в конформацйи Па значительно менее эффективно (-3.0 ккал/моль).
Аналог Tyi^-D- Ala2- Gly3- Phe4- Leu5- - Arg6
Полученные нами низкоэнергетические конформации [р -Ala 2]-ЛЭК приведены в табл. 9, энергетические характеристики самой стабильной конформации каждой формы основной цепи [D -Ala ]-ЛЭК показаны в табл. 10, Результаты расчета показали, что в по-следовательнооти ЛЭК замена Gly fc на D -Alar приводит к сильной энергетической дифференциации конформации, форм основной цепи и шейпов. Из 16 возможных типов структур только конформации трех, а именно ffff , fffe и efff оказались низкоэнергетическими (табл. 9). В отличие от молекулы ЛЭК, конформации шейпа effe для его аналога являются высокоэнергетичными. Их относительная энергия повысилась в среднем на 3.0 ккал/моль по сравнению с конформация-ми того же шейпа молекулы ЛЭК. Это, по-видимому, связано с тем, что в низкоэнергетических конформациях шейпа efff второй остаток находится в В форме основной цепи, которая менее предпочтительна для D-стереоизомера,
Глобальной структурой аналога [D -Ala ] ЛЭК является В LP % L32 шейпа ffff в этой конформации дипептидные взаимодействия вносят -9,2 ккал/моль, трипептидные —1.7 ккал/моль, тетрапептид-нне —3,3 ккал/моль и пентапептидные —10.1 ккал/моль. именно последняя составляющая и делает эту конформацию самой выгодной. Энергия конформации В2РНВ2В32 шейпа fffe всего на 0.1 ккал/моль выше энергии глобальной конформации. Здесь более ослаблено пента-пептидное взаимодействие между остатками Туг и Leu , а три- и тетрапептидные взаимодейотвия сильнее. Самый большой вклад в стабилизацию этой конформации вносят дисперсионные взаимодействия (-20.7 ккал/моль). нооительная энергия которой равна 3.0 ккал/моль. На основе результатов расчета можно предположить, что в физиологических условиях о аналог D - Ala -ЛЭК не будет выполнять все функции, присущие природной молекуле ЛЭК. Неосуществимой отанет функция молекулы, для реализации которой необходима структура ЛЭК типа effe . Т.о» результаты конформационного анализа аналога [D - Ala ] лейцш-энкефалина дают возможность сделать следующие предположения - во-первых, этот аналог сможет осуществлять не все функции ЛЭК, а лишь те, при которых его пространственное строение должно быть ffff , fffe и отчасти efff типов, И во-вторых, вследствие заме ? 2 ны аминокислотного остатка Gly на D - Ala молекула аналога приобретает большую устойчивость к действию раощепляющих ферментов, что замедляет ферментативный гидролиз этого аналога в организме и, следовательно, пролонгирует его действие» Аналог Туг I- D- Ala2- Gly3- Phe4- Leu5-Arg 6.
Пространственная структура этого аналога молекулы ЛЭК изучена на основе оптимальных конформаций двух его других аналогов -[D - Ala2]- и [Arg 6]-ЛЭК, рассмотренных выше. Полученные при этом низкоэнергетические конформаций аналога [D - Ala , Arg 6]-ЛЭК показаны в табл. II, а энергетические характеристики самой стабильной конформаций каждой формы основной цепи - в табл. 12.
Относительная энергия 28 конформаций этого аналога ниже 5.0 ккал/моль. Все они принадлежат семи разным формам основной цепи, пяти шейпам. Взятые за основу расчета низкоэнергетические варианты аналога [Arg 6]-ЛЭК оказались перспективными и сохранены для р- Ala2, Arg 6]-аналога. Низкоэнергетичеокие шейпы основной цепи аналога [D Ala , Arg 6]-ЛЭК, полученные в результате его конформационного анализа, показаны на рис 8.
Относительная энергия конформации B2PRR2B21B5522 шейпа ffffe равна 0,9 ккал/моль, В этой конформации вклад ди- три-, тетра- и пентапептидных взаимодействий соответственно составляет --10,0, -3,9, -5.1 и -7,0 ккал/моль. Как видно, первые два взаимодействия в этой конформации слабее, чем у глобальной, а гекса-пептидное взаимодействие очень мало,
У конформации %РЕВ3В32%22 шейпа fffее относительная энергия составляет 3,2 ккал/моль, В этой конформации стабилизирующее действие оказываю! в основном ди- и пентапептидные взаимодействия. Они равны -8,4 и -9.3 ккал/моль соответственно, В целом сильное стабилизирующее действие оказывают невалентные взаимодействия, порядка -29,0 ккал/моль,
Т,о, можно предположить, что молекула [D - Ala2, Arg 6]-ЛЭК может сохранять только некоторые биологические функции природного гормона. Но её действие в организме вероятно будет пролонгированным, Аналог Туг - D-Ala 2-Gly 3-Phe 4-А1а 5-Arg 6.
Поскольку пространственная структура этого аналога исследована на основе результатов расчета рассмотренной выше молекулы [п-А1а 2t Arg 6]-ЛЭК, то для этой молекулы были рассчитаны конформации только пяти лучших шейпов пептидного скелета, а именно: fffef , ffffe , effff , efffe и fffee , Найденные предпочтительные конформации показаны в табл. 13, а энергетические характеристики самых стабильных конформации каждой рассмотренной формы основной цепи даны в табл. 14
Фрагменты Phe 4- Arg7 и Arg 6- Arg9
Впервые выделенный Голдштейном и сотр. [І27І из экстракта гипофиза свиньи N-концевой тридекапептид динорфина обладает биологической активностью целого пептида, последовательность динорфина (І-ІЗ) включает лейцин-энкефалин. Аминокислотную последовательность динорфина определяли, сочетая автоматический метод Эд-мана и гидролиз карбоксипептидазами А и Y \l28j. Предполагают, что динорфин является предшественником двух пептидов ІА (N-концевого 17 членного фрагмента) и IB (С-концевого 13 членного фрагмента), образующихся в результате ферментативного гидролиза пептидной связи Ьуз - Arg 19 [128].
Динорфин отличается от других опиатных пептидов тем, что он взаимодействует с опиатными рецепторами препарата подвздошной кишки морской свинки в 50 раз сильнее р -эндорфина, в 200 раз лучше морфина и в 700 раз сильнее ЛЭК [127]. Динорфин может играть роль в регуляции ответов на изменение водно-солевого обмена, а также участвовать в процессах, связанных с деторождением и кормлением [129], Биологическая активность динорфина была резистентной к разрушению цианогенбромидом.
Динорфин обладает своеобразным действием на аналгезию, вызываемую у мышей опиоидами, такими как морфин, р -эндорфин (БЭР) и аналоги лейцин-анкефалина. Он ослабляет аналитический эффект морфина, усиливает обезболивающее действие больших доз БЭР, не ослабляя при этом эффект малых доз БЭР, Динорфин (I - 13) не вы зывает аналгезию. Предполагают, что динорфин оказывает модулирующее действие на аналитический эффект морфина, БЭР и некоторых других эндогенных опиоидов [130]«
Динорфин также влияет на поведение мышей, усиливая при центральном введении в мозг чувство голода, однако, эти эффекты не устраняются налакооном [l3l]# Действие динорфина (I-I3) полностью блокируется налакооном, но для подавления активности динорфина (I-I3) требуется в 13 раз более высокая его концентрация, чем для подавления действия ЛЭК или норморфина [127]. Высокоочищеиные мембраны мозга мышей быстро деградируют динорфин (I-I3), что указывает на присутствие соответствующей протеазы в мембранах мозга»
Казароссианом и сотр. [132] получена высокочувсвительная специфическая количья антисыворотка (Ас) к конъюгату биологически активного фрагмента I-I3 динорфина» Препарат Ас не реагирует о ЛЭК, входящим в структуру динорфина (I-I3). Исследование перекрестной реакции Ас с укороченными фрагментами динорфина (I-I3) показало, что С-концевой остаток лизина-13 и свободная аминогруппа Туг не существенны для иммунореактивности динорфина (I-I3). В то же время, последовательное укорачивание динорфина (I-I3) с С-конца, начиная с 12 го остатка ведет к постепенному снижению иммунореактивности, которая становится крайне низкой после удаления 9-го остатка и практически отсутствует в динорфине (1-5), т.е. лейцин-энкефалине [132] В этой же работе было показано, что замещение Gly на в- Ala2 в динорфине (I-I3) приводит к снижению иммунореактивности [l32].
Чавкин и Голдштейн [іЗЗ] изучали различные участки молекулы динорфина (І-ІЗ) в её взаимодействии с рецепторами нервного сплетения мышц морокой свинки. Удаление аминокислот с С-конца динорфина (І-ІЗ) показало, что лизин-13, лизин-Н и аргинин-7, по-види 115 мому, нужны для сохранения выоокого уровня взаимодействия пептида с рецепторами. Удаление N-концевого тирозина приводило к утрате биологической активности пептида» Авторы \_133"\ предполагают, что ТТ 7 Lys и Arg , по-видимому, нужны для проявления специфичности взаимодействия с рецепторами динорфина (I-I3), отличающимися от мю-рецепторов в той же ткани. Вюстер и др. [l34] вводили мышам одновременно в течение 6 дней [D - Ala , D - Leu5]-ЛЭК (I), как агонист дельта-опиатных рецепторов (-0Р), и суфентанил (П) как агонист j«.-0P. При сравнении опиоидных активностей динорфина (I-I3), [D - Ala. D -Leu 5]-ЛЭК, ЛЭК, суфентанила и др. на препарате vas deferens в концентрациях в 140 - 2500 раз больших для толерантных к I + П мышей, чем для контрольных мышей,получили, что активность динорфина (I-I3) уменьшалась незначительно. На этом основании авторы [l34]предполагают, что существуют опиатные рецепторы, специфичные к динорфину (I-I3) и функционирующие независимо от f-- и о 0Р, Таким образом, динорфин (I-I3) и ЛЭК взаимодействуют с различными популяциями опиатных рецепторов.
Спектроскопическими методами изучена структура динорфина (I-13) в воде и других оредах Спектры КД водных растворов динорфина свидительствуют о его неупорядоченности и весьма лабильной структуре [135] Наряду с полифункциональностью,динорфин (I-I3) обладает высокой чувствительностью,специфичностью каждого своего действия А это по-видимому, связано о тем,что молекула динорфина (I-I3) в физиологических условиях не является статистически флуктуирующим клубком, а имеет вполне определенный набор изоэнергетических кон-формаций различных типов Учитывая большое число выполняемых ди норфином функций, можно ожидать, что этот набор является весьма представительным. Для изучения структурно-функциональной организации олигопептида на атомно-молекулярном уровне необходимо знание полного набора низкоэнергетических и фйзиологически"активных" конформационных состояний молекулы. Решение этой задачи получено нами для N-концевого тридекапептида динорфина и ряда его аналогов методом теоретического конформационного анализа в полярной и неполярной средах.
