Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Биологические свойства фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных Щепитова Наталья Евгеньевна

Биологические свойства  фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных
<
Биологические свойства  фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных Биологические свойства  фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных Биологические свойства  фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных Биологические свойства  фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных Биологические свойства  фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных Биологические свойства  фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных Биологические свойства  фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных Биологические свойства  фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных Биологические свойства  фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных Биологические свойства  фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных Биологические свойства  фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных Биологические свойства  фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных Биологические свойства  фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных Биологические свойства  фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных Биологические свойства  фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Щепитова Наталья Евгеньевна. Биологические свойства фекальных изолятов энтерококков, выделенных от животных: диссертация ... кандидата биологических наук: 06.02.02 / Щепитова Наталья Евгеньевна;[Место защиты: Башкирский государственный аграрный университет].- Уфа, 2015.- 152 с.

Содержание к диссертации

Введение

I Обзор литературы 10

1.1 Общая характеристика бактерий рода Enterococcus 10

1.2 Экология бактерий рода Enterococcus 12

1.2.1 Распространённость бактерий рода Enterococcus в кишечном биотопе 12

1.2.2 Распространённость бактерий рода Enterococcus в окружающей среде 16

1.3 Биологические свойства бактерий рода Enterococcus 19

1.3.1 Антагонистическая активность бактерий рода Enterococcus 19

1.3.2 Факторы патогенности и персистенции бактерий рода Enterococcus 25

1.3.3 Антибиотикорезистентность бактерий рода Enterococcus 30

1.4 Практическое применение бактерий рода Enterococcus 32

II Собственные исследования 37

2.1 Материалы и методы исследований 37

2.1.1 Выделение и идентификация бактерий рода Enterococcus 37

2.1.2 Методы изучения биологических свойств бактерий рода Enterococcus 43

2.1.2.1 Определение факторов патогенности бактерий рода Enterococcus 43

2.1.2.2 Определение факторов персистенции бактерий рода Enterococcus

2.1.2.3 Определение антибиотикочувствительности бактерий рода Enterococcus 49

2.1.2.4 Определение антагонистической активности бактерий рода Enterococcus 52

2.1.3 Метод воспроизведения листериозной экспериментальной инфекции 55

2.1.4 Статистическая обработка результатов 57

2.2 Видовой состав фекальных изолятов энтерококков 59

2.3 Характеристика факторов патогенности фекальных изолятов энтерококков

2.4 Характеристика персистентных свойств фекальных изолятов энтерококков 63

2.5 Характеристика антибиотикорезистентности фекальных изолятов энтерококков 67

2.5.1 Фенотипическая характеристика антибиотикорезистентности фекальных изолятов энтерококков 67

2.5.2 Генотипическая характеристика антибиотикорезистентности фекальных изолятов энтерококков 75

2.6 Антагонистическая активность фекальных изолятов энтерококков in vitro 78

2.6.1 Характеристика антагонистической активности фекальных изолятов энтерококков 78

2.6.2 Влияние факторов макроорганизма на антагонистическую активность фекальных изолятов энтерококков in vitro

2.6.2.1 Оценка воздействия хлороводородной кислоты на антагонистическую активность фекальных изолятов энтерококков 81

2.6.2.2 Оценка воздействия жёлчи на антагонистическую активность фекальных изолятов энтерококков 84

2.6.3 Генотипическая характеристика бактериоциногении фекальных изолятов энтерококков 87

2.7 Антилистериозная активность Enterococcus faecium Ef790SAU in

vivo 89

III Обсуждение результатов исследований 94

Выводы 106

Практические предложения 108

Список сокращений 109

Библиографический список

Распространённость бактерий рода Enterococcus в окружающей среде

Название «энтерококк» впервые было применено М.Е. Thiercelin (1899) для обозначения грамположительного диплококка кишечного происхождения. F.W. Andrewes и T.J. Horder (1906) впервые выделили этот микроорганизм от больного эндокардитом и предложили название Streptococcus faecalis.

В последующее десятилетие различные авторы изучали и описывали выделенные ими штаммы так называемого S. faecalis, но в 1919 г. S. Orla-Jensen при характеристике штаммов S. glicerinaceus и S. faecium применил понятие «энтерококк». J.M. Sherman подчеркнул, что термин «энтерококк» используется для обозначения разных микроорганизмов - начиная от наименования любого фекального стрептококка, до определения организмов, которые оказались идентичны S. faecalis (Murray В.Е., 1990). Первую схему классификации рода Streptococcus, в который входили энтерококки, предложил J.M. Sherman. Согласно его классификации данные микроорганизмы были разделены на четыре группы: пиогенные (pyogenic), зеленящие (yiridans), молочные (lactic) и энтерококки (enterococcus). Энтерококками считали микроорганизмы, способные расти при 10 и 45 С, в 6,5% NaCl и при значении рН 9,6, которые выживали при 60 С в течение 30 минут. В соответствии с серологической классификацией R.C. Lancefield (1933), энтерококки агглютинировались антисыворотками группы D.

Применение молекулярно-генетических методов (гибридизация нуклеиновых кислот) позволило К.Н. Schleifer и R. Kilpper-Balz в 1984 году показать только отдалённое сходство S. faecalis со стрептококками. В 1984 г. было предложено выделить стрептококки, определяемые классификацией J.M. Sherman как энтерококки, в отдельный род Enterococcus. Первые виды, которые на основании филогенетических доказательств, полученных в результате секвенирования 16S рРНК, были отнесены к новому роду - Streptococcus faecalis и Streptococcus faecium обозначенные, соответственно, как Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium (Schleifer K.H., Kilpper-Balz R., 1984). Дальнейшие исследования доказали, что многие штаммы стрептококков могут считаться отдельными видами рода Enterococcus на основании родства нуклеиновых кислот (Collins M.D. et al., 1984).

Энтерококки принадлежат к домену Bacteria, типу Firmicutes, классу Bacilli, порядку Lactobacillales, к семейству Enterococcaceae (Ludvig W. et al., 2009). Род Enterococcus представлен грамположительными, неспорообразующими, факультативно анаэробными бактериями, которые имеют яйцевидную или сферическую форму и могут располагаться в мазках короткими цепочками, парами или отдельными клетками. Размер клеток составляет 0,6-2,0x0,6-2,5 мкм. Чётких капсул энтерококки не образуют, культуры отдельных видов подвижны за счёт редких жгутиков. По типу питания относятся к хемоорганотрофам. Для энтерококков характерен метаболизм бродильного типа. Бактерии осуществляют гомоферментативное молочнокислое брожение разнообразных углеводов с образованием L(+)-молочной кислоты, но не газа, в связи с чем их относят к молочнокислым микроорганизмам. Энтерококки могут синтезировать длинноцепочечные жирные кислоты насыщенного неразветвленного или мононасыщенного типа. Пептидогликан построен по типу Lys-D-Asp или Lys-Ala2-3. Содержание в ДНК G+C варьирует в пределах от 35 до 45% (Svec Р., DevrieseL.A.,2009).

Большинство штаммов реагирует с антисывороткой группы D, и некоторые реагируют с антисывороткой группы Q. Гидролиз L-пирролидонил-Р-нафтиламида является характерной особенностью. Способны расти при концентрации NaCl до 6,5% и жёлчи до 40%, при значении рН 9,6, в диапазоне температур 10-45 С, устойчивы к 0,4% азиду натрия. Оптимальные условия культивирования энтерококков: 35-37 С, рН 7,5 (Определитель бактерий Берджи, 1997).

Энтерококки являются комменсалами желудочно-кишечного тракта многих организмов, от насекомых до человека. Численность и видовой состав кишечных представителей специфичны и сильно варьируют в зависимости от вида хозяина (Koneman E.W. et al, 1997).

В 1946 году М. Ostrolenk и А.С. Hunter в небольших количествах выделили бактерии рода Enterococcus из 51 образца фекалий различных видов животных (кошка, мышь, морская свинка, кролик, собака, крыса, курица, обезьяна) и человека.

J.O. Mundt (1963) изучил распространённость фекальных энтерококков у животных в дикой природе. Энтерококки были обнаружены в фекалиях млекопитающих (71% случаев), рептилий (86%) и птиц (32%). При этом от травоядных млекопитающих энтерококки выделялись спорадически, а от хищных млекопитающих, таких как лисы, медведи, кабаны - в большинстве случаев.

В своей работе L.A. Devriese et al. (1987) выделили и идентифицировали 255 штаммов энтерококков из кишечника животных. Они показали, что наиболее часто выделяемыми видами энтерококков являлись Е. hirae и Е. faecium. Культуры Е. durans и Е. gallinarum были найдены ими только в кишечнике домашней птицы, штаммы Е. avium выделены от коров и свиней, но не от птицы.

По данным V. Kolodjieva et al. (2006), Е. faecalis является наиболее частым изолятом из кишечника человека, обнаруживается в кишечнике домашней птицы, собак и некоторых сельскохозяйственных животных. Е. faecium выявляется в кишечнике людей, разных видов животных, более резистентен к антимикробным препаратам, чем Е. faecalis. Е. avium выделяют из кишечника птиц, собак, человека. Бактерии видов Е. durans, Е. hirae, Е. gallinarum и Е. flavescens известны как редкие кишечные изоляты.

Видовой состав бактерий Enterococcus sp. в образцах фекалий животных и человека с использованием полимеразной цепной реакции изучили В.А. Layton et al. (2010). Ими отмечено, что наиболее часто обнаруживаемыми видами энтерококков были Е. faecium и Е. faecalis. Е. hirae выделяли из 44% проб фекалий. Из всех проб фекалий лошадей были изолированы штаммы Е. hirae, но отсутствовал вид Е. faecalis. Распределение видов Е. avium, Е. casseliflavus, Е. durans, Е. hirae существенно зависело от видовой принадлежности организма-хозяина.

Некоторые виды энтерококков являются специфичными для своих хозяев. Так, в кишечной микрофлоре домашних голубей был обнаружен новый вид Е. columbae (Devriese L.A. et al., 1990). При исследовании микрофлоры слепой кишки ослов A. de Vaux et al. (1998) изолировали штамм энтерококков, который был определён как новый вид Е. asini, вошедший в род Enterococcus.

Доминирующие виды энтерококков, обитающие в кишечнике млекопитающих, зачастую представлены культурами Е. faecalis, Е. faecium, Е. hirae, Е. durans, другие виды встречаются реже (Devriese L.A., De Pelsmaecker К., 1987).

Бактерии рода Enterococcus присутствуют в кишечном биотопе крупного рогатого скота. Наиболее разнообразная энтерококковая микрофлора представлена у телят. В её составе обнаруживались виды Е. avium, Е. cecorum, Е. durans, Е. faecalis, Е. faecium и Е. hirae. Взрослые коровы характеризовались меньшим видовым разнообразием энтерококков (Devriese L.A. et al., 1992). С поверхности миндалин телят были выделены виды Е. faecalis и Е. raffinosus.

У лошадей обнаружены фекальные изоляты Е. faecalis, Е. faecium, Е. casseliflavus, Е. gallinarum, Е. hirae (Thai L.A. et al., 1995).

Установлено, что из кишечника свиней чаще всего изолируются энтерококки видов Е. faecalis и Е. faecium, при этом Е. faecium выделяется в небольших количествах (Devriese L.A. et al, 1994). Согласно другим исследованиям, в кишечнике свиней обитают бактерии видов Е. hirae и Е. cecorum (Devriese L.A., HaesebrouckF., 1991).

Изучение микрофлоры кишечника кошек и собак позволило выявить в её составе микроорганизмы рода Enterococcus. По данным L.A. Devriese et al. (1992), культуры Е. faecalis чаще всего встречались в кишечнике этих видов животных, однако Е. hirae был изолирован от собак примерно в том же проценте случаев, что и Е. faecalis. Для энтерококковой микрофлоры кишечника кошек в большей степени характерен вид Е. cecorum.

Факторы патогенности и персистенции бактерий рода Enterococcus

Клиническое значение бактерий рода Enterococcus напрямую связано с их устойчивостью к антибактериальным препаратам (АБП), что способствует колонизации биотопа и развитию инфекционного процесса (Benenson S. et al., 2009; Arias C.A., Murray B.E., 2012). Лечение энтерококковых инфекций может быть затруднено в связи с природной устойчивостью энтерококков к ряду антибиотиков, в частности к Р-лактамам, цефалоспоринам, низким концентрациям аминогликозидов, фторхинолонам, клиндамицину.

Помимо природной резистентности энтерококков за последние два десятилетия появилась приобретенная резистентность к другим антимикробным агентам - высоким концентрациям Р-лактамов и аминогликозидов, гликопептидам, тетрациклину, эритромицину, хлорамфениколу, ципрофлоксацину, линезолиду (Cetinkaya Y. et al, 2000; Chow J. W., 2000).

Большое количество антибиотиков применяется в животноводстве для лечения и профилактики инфекционных заболеваний, стимулирования роста животных, при этом бактерии желудочно-кишечного тракта часто приобретают устойчивость к широкому спектру антибактериальных препаратов, в том числе клинически важных для человека.

В 1993 году J. Bates et al. сообщили о выделении ванкомицинрезистентных штаммов Е. faecium из кишечника сельскохозяйственных животных и птиц: крупного рогатого скота, свиней, овец, кур. L.A. Devriese et al. (1996) выявили широкую распространённость резистентности к ванкомицину среди культур энтерококков, изолированных от сельскохозяйственных и домашних животных. Ванкомицинрезистентные изоляты Е. faecium обнаружены в кишечнике лошадей и собак (8%), кур (7%), свиней (6%), резистентные штаммы Е. durans, Е. gallinarum и E.faecalis выделены из фекалий кур, фазана и лошади, соответственно.

C.L. Tremblay et al. (2011) охарактеризовали спектр антибиотикорезистентности культур Е. faecalis и Е. faecium, изолированных из содержимого слепой кишки цыплят-бройлеров и индюшат. Большинство штаммов энтерококков проявили устойчивость к бацитрацину, эритромицину, канамицину, линкомицину, хинупристин/дальфопристину, стрептомицину, тетрациклину, в то время как сохраняли чувствительность к хлорамфениколу, линезолиду и ванкомицину.

По данным C.R. Jackson et al. (2011), резистентность к линкомицину (92,3% штаммов), флавомицину (71,9% штаммов) и тетрациклину (24,5% штаммов) выявлена среди изолятов Е. hirae, Е. faecalis и Е. faecium, выделенных от крупного рогатого скота.

Установлен высокий процент резистентности Enterococcus sp., выделенных от свиней, к макролидам и тетрациклинам (Tremblay C.L. et al., 2012). В исследовании S. Ramos et al. (2012), ванкомицинрезистентные энтерококки были выделены из образцов фекалий свиней, крупного рогатого скота и овец, при этом изолированные от свиней штаммы проявили устойчивость к тетрациклину и эритромицину. Широкое применение антимикробных препаратов в животноводстве привело к различным изменениям бактериальных геномов (Schwarz S., Chaslus-Dancla Е., 2001) и способствовало приобретению микроорганизмами, колонизирующими желудочно-кишечный тракт животных, антибиотикорезистентности (McEwen S.A., Fedorka-Cray P.J., 2002). Животные могут выступать в качестве резервуара для резистентных штаммов энтерококков (Van den Bogaard А.Е. et al., 2002; Vignaroli С. et al, 2011). Исследования, в которых сравниваются молекулярно-генетические характеристики антибиотикорезистентных энтерококков, выделенных от человека и животных, подтверждают возможность передачи штаммов от животных-компаньонов человеку при тесных контактах (Hammerum A.M. et al, 2000; Freitas A.R. et al, 2011).

Таким образом, изучение устойчивости к антибактериальным препаратам фекальных энтерококков животных является важным для оценки их значения как резервуара генов резистентности.

Бактерии рода Enterococcus являются представителями группы молочнокислых бактерий и находят широкое применение в пищевой промышленности при приготовлении кисломолочных и ферментированных продуктов питания. Некоторые штаммы энтерококков используются в качестве пробиотиков для улучшения здоровья человека и животных.

Благодаря своей кислотопродукции, термотолерантности, протеолитической и эстеролитической активностям, бактерии рода Enterococcus являются важным компонентом ферментированных пищевых продуктов. Энтерококки часто применяются для производства традиционных сыров в странах Средиземноморья (Gelsomino R. et al, 2001; Sarantinopoulos P. et al., 2002). Численность Enterococcus sp. в сырах колеблется в пределах от 104 до 106 КОЕ/г, доминирующими видами являются Е. faecium и E.faecalis (Garcia М.С. et al., 2002; Gelsomino R. et al., 2002).

Определение антибиотикочувствительности бактерий рода Enterococcus

Длительному переживанию энтерококков в организме хозяина способствуют факторы персистенции, направленные на инактивацию механизмов резистентности макроорганизма (Бухарин О.В., 1999). Одним из механизмов, направленных на выживание микроорганизмов в условиях макроорганизма путем преодоления механизмов неспецифической защиты хозяина, является антилизоцимная активность.

Способность деградировать лизоцим присуща многим видам микроорганизмов. Благодаря данному свойству микрофлора приобретает способность к заселению различных экониш и длительному переживанию (персистированию) в организме хозяина.

Изучение антилизоцимной активности Enterococcus sp. показало, что данный признак встречался у 100% изолятов. Уровень выраженности антилизоцимного признака характеризовался межвидовой вариабельностью (в соответствии с рисунком 2.4.1).

Средние значения АЛА штаммов Е. hirae составили 1,61 ±0,016 мкг/млед. ОП, культур Е. durans - 1,59±0,024 мкг/млед. ОП, изолятов E.faecium - 1,58±0,014 мкг/млед. ОП. По сравнению с культурами видов Е. hirae, Е. durans и Е. faecium достоверно меньшим уровнем АЛА обладали штаммы Е. faecalis (1,15±0,217 мкг/млед. ОП) (р 0,001) и Е. casseliflavus (1,28±0,088 мкг/млед. ОП) (р 0,01). Экспрессия антилизоцимной активности штаммов Е. flavescens составила в среднем 1,45±0,153 мкг/млед. ОП. Примечание: - достоверность различий уровня антилизоцимной активности культур Е. casseliflavus по сравнению с культурами видов Е. hirae, Е. durans, E.faecium - (р 0,01); - достоверность различий уровня антилизоцимной активности культур Е. faecalis по сравнению с культурами видов Е. hirae, Е. durans, E.faecium - (р 0,001).

Одним из естественных факторов защиты макроорганизма является природный дипептид карнозин. Способность бактерий к его инактивации, определяющаяся как антикарнозиновая активность (АКрА), - это важный механизм персистенции, особенно для микроорганизмов, колонизирующих слизистые оболочки.

Изучение распространённости антикарнозиновой активности среди энтерококков, выделенных из фекалий продуктивных животных, показало, что 100% изолятов обладали данным свойством (в соответствии с рисунком 2.4.2). АКрА высокого уровня была выявлена у 58,8±6,89% кишечных изолятов, среднего уровня - у 23,5±5,93% культур, низкого уровня - у 17,7±5,34% штаммов.

Среднее значение АКрА фекальных штаммов Е. faecium (1,63±0,197 мг/мл) было в 1,5 раза меньше такового у штаммов Е. durans (2,37±0,224 мг/мл) и Е. faecalis (2,52±0,292 мг/мл) (р 0,05). Экспрессия признака у культур Е. hirae составила 1,93±0,248 мг/мл, у изолятов Е. flavescens -1,84±0,447 мг/мл. Минимальное значение активности было зарегистрировано у культур Е. casseliflavus (1,51±0,595 мг/мл).

Enterococcus sp. Исследование выраженности АКрА бактерий, учитывающее видовую принадлежность организма-хозяина, выявило достоверно высокий уровень АКрА энтерококков, выделенных из кишечника крупного рогатого скота, по сравнению со штаммами, изолированными из фекалий свиней и лошадей (р 0,05). Так, АКрА у культур, выделенных из фекалий крупного рогатого скота, составляла 2,47±0,173 мг/мл, у изолятов из фекалий коз - 2,01±0,365 мг/мл, у изолятов из фекалий лошадей и свиней - 1,72±0,277 и 1,69±0,197 мг/мл, соответственно.

К важнейшим свойствам кишечных энтерококков, позволяющим им закрепиться в естественном экотопе, относится способность образовывать биоплёнки, представляющие собой скопления микроорганизмов, включенных в общий полисахаридный матрикс и ассоциированных с биологической или небиологической поверхностью (Vu В. et al., 2009).

При определении способности энтерококков образовывать биоплёнки установлено, что 20,3±3,16% штаммов формировали плёнки на абиотической поверхности. Культуры Е. faecium обладали данной способностью в достоверно большем проценте случаев - 40,0±7,30%, чем штаммы Е. hirae и Е. durans (15,3±5,76 и 16,6±6,20%, соответственно) (р 0,05). Количество биоплёнкоформирующих штаммов Е. flavescens составило 20,0± 10,32%.

Коэффициент биоплёнкообразования (КБ) изолятов энтерококков варьировал от 1,2 до 1,4. Для штаммов Е. faecium средний КБ составил 1,3±0,05, а для культур non-faecium видов - 1,2±0,01 (р 0,05).

Наибольший процент штаммов, формирующих биоплёнки, был выделен от лошадей (33,3±7,85%) и коз (28,5±9,85%). Культуры, изолированные от крупного рогатого скота, обладали данным свойством в 11,1±4,27% случаев, от свиней - в 17,6±5,33% случаев.

Известно, что поверхностный белок энтерококков, кодируемый геном esp, участвует в образовании биоплёнок на абиотических поверхностях (Whitman R.L. et al., 2007), однако ни у одного из изученных штаммов данный ген не обнаружен.

Таким образом, полученные результаты позволили выявить ранее неизвестное свойство фекальных энтерококков - их антикарнозиновую активность. Кроме АКрА у бактерий рода Enterococcus определялся ещё один секретируемый фактор персистенции - способность к инактивации лизоцима и способность образовывать биоплёнки.

В настоящее время бесконтрольное применение антибиотиков в медицине и ветеринарии сопровождается быстрым темпом формирования устойчивости микроорганизмов к антибактериальным препаратам (АБП). Обладая высокой скоростью размножения, резистентные штаммы бактерий могут стать доминирующими представителями микробной популяции кишечного биотопа животных, поскольку имеют преимущество перед чувствительными штаммами. Кишечник животных может служить источником резистентных культур энтерококков, способных передаваться людям при непосредственном контакте с животными, через продукты питания и объекты внешней среды (Trivedi К. et al., 2011).

Оценка воздействия жёлчи на антагонистическую активность фекальных изолятов энтерококков

Имеются данные о том, что бактерии рода Enterococcus сохраняют жизнеспособность при прохождении через желудочно-кишечный тракт, поскольку устойчивы к действию хлороводородной кислоты и жёлчи (Strompfova V. et al., 2004). Однако изменения кислотности среды влияют на бактериоциногенную активность энтерококков. В работе К. Banwo et al. (2013) показано выраженное снижение антимикробной активности бактериоцинов при высоких значениях рН и сохранение их свойств при более низких. Это обуславливается тем, что оптимальный уровень кислотности среды для производства бактериоцинов молочнокислыми бактериями часто находится ниже такового для роста микроорганизмов. Предположительно, снижение активности объясняется адсорбцией молекул бактериоцинов на клеточной поверхности бактерий-продуцентов, что зависит от рН среды клеток и более выражено при высоких значениях водородного показателя (Parente Е., Ricciardi А., 1999). В более ранних исследованиях В. Gedek (1987) установил, что жёлчные соли снижают рост и антимикробную активность лактобактерий в отношении тест-культуры В. subtilis АТСС 6633.

Таким образом, эволюционно сложившаяся устойчивость энтерококков к факторам макроорганизма способствует успешной колонизации и функциональной активности бактерий в кишечном биотопе.

Проведённый молекулярно-генетический анализ выявил в геноме фекальных культур энтерококков генетические детерминанты, ответственные за синтез энтероцинов А, В, Р, L50A, L50B и бактериоцина 31. Наиболее распространёнными были гены entA (16,7±2,93%) и entP (33,4±3,70%).

В популяции фекальных энтерококков установлена широкая распространённость генов бактериоциногении (что согласуется с данными К. Nigutova et al. (2005), V. Strompfova et al. (2008)), напрямую коррелирующая с наличием антилистериозной активности и активностью в отношении вирулентных изолятов вида Е. faecalis. Выявленная закономерность находит подтверждение в работах W. Theppangna et al. (2007) и G.B. Ozdemir et al. (2011), которые охарактеризовали спектр антимикробной активности наиболее часто встречающихся у штаммов Enterococcus sp. бактериоцинов А и Р. Названные энтероцины ингибируют рост Listeria sp., Lactobacillus sp., Pediococcus sp., Enterococcus sp., Carnobacterium sp., Leuconostoc sp., Lactococcus sp., Clostridium sp. и выявляются практически в одинаковом проценте случаев.

На следующем этапе работы мы предприняли попытку изучения антагонистической активности энтерококков in vivo на модели экспериментального листериоза морских свинок.

В качестве штамма-антагониста была выбрана культура Enterococcus faecium Ef790SAU, выделенная из кишечника свиньи, обладающая выраженным антилистериозным эффектом in vitro и не имеющая факторов патогенности на уровне фено- и генотипа.

Листериоз представляет собой бактериальное сапрозоонозное инфекционное заболевание людей и животных, возбудителями которого являются патогенные бактерии рода Listeria. Одним из путей реализации антимикробной активности энтерококков в модели экспериментального листериоза может быть ускорение элиминации листерий из внутренних органов животных.

Результаты определения показателя микробной обсеменённости внутренних органов (селезёнки, печени, кишечника и его содержимого) соответствовали данным выживаемости животных опытной и контрольной групп (гибель 33,3% животных из группы контроля). Количество листерий в органах морских свинок опытной группы на третьи и пятые сутки инфекции было значимо меньше, чем в органах животных контрольной группы. Таким образом, штамм Enterococcus faecium Ef790SAU обладает защитным эффектом при экспериментальном листериозе морских свинок.

Аналогичный протективный эффект культуры Lactobacillus delbrueckii UFV-H2b20 обнаружен L.M. dos Santos et al. (2011) при экспериментальной листериозной инфекции гнотобионтных мышей. Результаты исследований доказывают увеличение количества клеток Купфера в печени, сопровождающееся элиминацией листерий из органа. Другим возможным объяснением эффективного устранения возбудителя может являться производство иммунными клетками хемокинов, привлекающих большое число иммунокомпетентных клеток в инфицированный орган. V. Veckman et al. (2003) доказали, что лактобактерии способны индуцировать экспрессию генов хемокинов макрофагами.

Полученные нами результаты согласуются с данными H.J. Choi et al. (2012), показавшими в работе иммуномодулирующее действие культуры Enterococcus faecium JWS 833, выделенной из кишечника птицы (утки), при экспериментальном листериозе мышей. Штамм Enterococcus faecium JWS 833 повышал концентрацию в сыворотке крови оксида азота (II) и воспалительных цитокинов (ИЛ-ір, ФНО-а) при внутривенном заражении животных, при этом количество клеток листерий в печени снижалось.

Вероятно, аналогичная способность Enterococcus faecium Ef790SAU модулировать секрецию цитокинов, повышать функциональную активность фагоцитирующих клеток крови обеспечивает её положительное действие в качестве эффективного средства защиты от листериоза.

Оценивая фактические данные в целом, следует выделить следующие моменты: кишечный биотоп продуктивных животных разных видов характеризуется особенностями видового состава бактерий рода Enterococcus; энтерококки, изолированные из желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных разных видов, обладают специфичным биопрофилем; авирулентные, антагонистически активные энтерококки, выделенные из кишечника животных, могут быть использованы в качестве биопрепаратов для защиты от листериоза.