Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Классификация и номенклатура вируса гриппа птиц 12
1.2. Структура вируса гриппа птиц 13
1.3. Изменчивость вируса гриппа птиц 15
1.4. Экология вируса гриппа птиц 17
1.5. История вируса гриппа птиц 20
1.5.1. Распространение вируса H5N1 23
1.5.2. Распространение вирусов H5Nx 30
1.5.3. Распространение вируса ВПГП в России 33
1.6. Патогенез .35
1.7. Диагностика гриппа птиц 42
1.8. Профилактика и контроль заболевания 52
1.9. Заключение по обзору литературы .54
2. Материалы и методы 56
2.1. Методы 56
2.1.1. Выделение и культивирование вируса гриппа птиц 56
2.1.2. Определение титра инфекционности ВГП 57
2.1.3. Определение среднего времени гибели эмбрионов 57
2.1.4. Инактивация и контроль авирулентности ВГП 58
2.1.5. Получение положительной и нормальной (отрицательной) сывороток крови кур к ВГП 59
2.1.6. Получение 1%-ной суспензии эритроцитов петуха 59
2.1.7. Определение гемагглютинирующей активности и идентификация ВГП в РТГА 59
2.1.8. Определение титра антител к ВГП в сыворотках крови птиц в РТГА 61
2.1.9. Определение нейраминидазного подтипа вируса гриппа в реакции торможения нейраминидазной активности 62
2.1.10. Обнаружение вируса гриппа в РДП 64
2.1.11. Выявление антител к ВГП в сыворотках крови птиц в РДП 65
2.1.12. Индикация генома ВГП типа А подтипа H5 и проверка на отсутствие контаминации образца посторонними вирусами и микоплазмами (методами ПЦР и ОТ-ПЦР) 66
2.1.13. Молекулярно-генетические методы исследований 66
2.1.14. Определение индекса патогенности вируса гриппа 69
2.1.15. Определение стерильности 70
2.1.16. Статистическая обработка результатов 71
2.2. Материалы 71
2.2.1. Вирус 71
2.2.2. Куриные эмбрионы .71
2.2.3. Лабораторные животные 71
2.2.4 Вакцины 71
2.2.5 Химические реагенты 72
2.2.6 Растворы, буферные смеси и ферменты 72
2.2.7 Оборудование 73
3. Результаты собственных исследований 75
3.1. Изучение биологических свойств ряда изолятов ВГП, полученных в Российской Федерации в период 2014-2017 гг 75
3.1.1. Выделение вируса гриппа птиц 75
3.1.2.Определение типовой специфичности по гемагглютинину выделенных ВГП, в период 2014-2017 гг 87
3.1.3. Определение типовой специфичности по нейраминидазе ВГП, выделенных в период 2014-2017 гг .89
3.1.4. Определение инфекционной активности изолятов 89
3.2. Определение стерильности изолятов ВГП 91
3.2.1.Определение стерильности изолятов ВГП микробиологическими методами 91
3.2.2.Подтверждение отсутствия контаминации изолятов ВГП молекулярно-генетическими методами 92
3.3.Изучение биологических свойств ВГП при инфицировании кур .93
3.4.Изучение биологических свойств ВГП при инфицировании утят 102
3.5.Изучение биологических свойств ВГП при инфицировании индюшат 107
3.6. Изучение протективных свойств отечественных серийных вакцин в отношении ВГП подтипов H5N1 и H5N8, выделенных в 2015-2016 гг 109
4. Обсуждение 112
5. Заключение (выводы) 115
6. Практические предложения 116
7. Список литературы 117
Приложения 144
- Экология вируса гриппа птиц
- Диагностика гриппа птиц
- Выделение вируса гриппа птиц
- Изучение протективных свойств отечественных серийных вакцин в отношении ВГП подтипов H5N1 и H5N8, выделенных в 2015-2016 гг
Экология вируса гриппа птиц
Главные представители экологической ниши и генофонда ВГП – это дикие птицы водного (отряд гусеобразные Anesriformes) и околоводного (отряд ржанкообразные Charadriformes) комплексов, которые являются основным источником распространения вируса [213, 215]. Тем не менее, вирус выделяли от множества видов птиц (более 100), млекопитающих, в том числе человека [111, 267].
Чаще всего вирус гриппа птиц выделяли от представителей семейства утиных (Anatidae), особенно от крякв (Anas platyrchynchos), важно отметить, что данный вид является самым распространенным в большей части Евразии и Северной Америке [84, 144]. Особое значение имеет тот факт, что представители данного семейства, как и другие птицы отряда гусеобразных, являются дальними мигрантами, которые способны преодолевать расстояния в несколько тысяч километров, перенося и распространяя вирус в окружающую среду [10, 84, 92, 223, 251]. У водоплавающих птиц вирус преимущественно реплицируется в желудочно-кишечном тракте и в меньшей степени в дыхательных путях, соответственно инфицирование осуществляется фекально-оральным и/или аэрогенным путями [144]. Жизненный цикл представителей данных отрядов тесно связан с водой, во время миграций на водоемах возникает высокая плотность представителей орнитофауны из различных регионов [92]. Данные условия позволяют обмениваться вирусами гриппа птиц и приводят к возникновению новых вариантов и их распространению [213]. Стоит отметить сезонность данного заболевания, его пик приходится на позднюю осень [213, 222]. Возможно, это связано с тем, что осенью в популяции птиц находится большое количество молодняка, у которого отсутствует специфические антитела, противостоящие вирусу [144]. У взрослых особей, как правило, инфекция, вызванная низкопатогенными штаммами, протекает без ярких признаков заболевания [144]. При изучении инфекционного процесса у диких малых лебедей (Cygnus columbianus bewickii) и крякв, зараженных естественным путём, наблюдали только незначительную потерю массы [86, 117].
Водная среда является оптимальной для сохранения и передачи вируса, в пресной воде он способен сохранять инфекционную активность до 4 дней при 22С, более 30 дней при 0С и еще более продолжительное время в замерзшей почве или во льду [5]. Исследователи полагают, что инфицирование может происходить следующим образом: зараженные птицы выделяют вирус в окружающую среду, контаминируя почву и воду, вирионы в замороженном состояние сохраняются в течение всей зимы, а весной, вернувшиеся в места гнездования дикие птицы, вновь заражаются вирусом [5]. Заражение могут провоцировать поведенческие реакции птиц, а именно - чистка оперенья клювом, сорбированные на перьях вирусы попадают в организм птицы и приводят к инфицированию [105]. Также есть данные, что вирусы гриппа могут сорбироваться не только на перьях птиц, но и в меху млекопитающих, обитающих в водоемах [5].
Прямое или косвенное взаимодействие диких и домашних птиц может приводить к расширению круга хозяев [267]. Особую опасность представляют перепела, так как в их организме клетки содержат рецепторы двух типов (-2,3 и -2,6-связанные сиаловые кислоты), соответственно они восприимчивы к большему разнообразию ВГП, чем другие виды птиц [32]. В случае инфицирования несколькими разными вирусами, перепела могут выступать в роли «смешивающего сосуда» и способствовать образованию новых вариантов вируса [32, 201].
Для человека эндемичны вирусы гриппа птиц с подтипами H1, H2 и H3, долгое время было принято считать, что другие подтипы вируса гриппа птиц не вызывает болезни у человека, но всё изменилось в 1997 г., когда в Гонконге 6 из 18 человек погибли после инфицирования ВПГП с подтипом H5N1 [73]. Также известны спорадические случаи заражения человека подтипами H5N1, H5N6, H6N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7 и H10N8, впрочем, широкого распространения они не получили [31, 42, 67, 232, 258]. Дело в том, что подтипы, которые эндемичны для людей (H1, H2, H3), распознают специфические рецепторы клеток, содержащие в составе -2,6-связанную сиаловую кислоту, в то время как высоковирулентные вирусы (H5 и H7) распознают клеточные рецепторы с -2,3-связаной сиаловой кислотой [42]. Есть данные, объясняющие высокую смертность людей от вируса гриппа H5N1 и объясняющие неэффективную передачу от человека к человеку [48, 238]. Дело в том, что клетки с -2,6-галактозными рецепторами имеются по всему дыхательному тракту от носа и до легких, но клетки с -2,3-галактозными рецепторами тоже есть в легких, они выстилают альвеолы и область вокруг них [48, 238]. Таким образом, H5N1 преимущественно заражает клетки нижних дыхательных путей и вызывает тяжелые повреждения в легких, но вызывает незначительные изменения в верхних дыхательных путях [75, 116]. Еще одним препятствием для вируса гриппа птиц на пути в преодолении межвидового барьера и адаптации к новому хозяину, является их недостаточная полимеразная активность в клетках человека [116]. Исследования, проведенные Yamada и cоавт. [116] показывают, что единичные аминокислотные замены лизина в положении 182 или аргинина в положении 192, в сайте связывания рецептора молекулы HA превращает вирус H5N1 из распознающего птичьи рецепторы в вирус, который распознает человеческие рецепторы [116]. Стоит заметить, что эти изменения в положениях 182 и 192 наблюдались у трёх вирусов H5N1, выделенных от человека, а у более 600 вирусов, выделенных от птиц, эти изменения не были обнаружены [116]. Это можно объяснить тем, что мутации в сайтах связывания с рецепторами HA могут происходить во время ранней фазы инфицирования человека в верхних дыхательных путях, но для обеспечения полной репликации могут потребоваться дополнительные изменения в вирусных белках [266]. Помимо человека, ВГП выделяли от множества видов млекопитающих (свиньи, лошади, собаки, морские котики, ондатры, дикие и домашние кошачьи) [45, 228, 267].
Диагностика гриппа птиц
Диагностика гриппа птиц – важная часть в борьбе с этим заболеванием, ведь чем быстрее будет установлен возбудитель, тем быстрее можно будет приступать к противоэпизоотическим мероприятиям, чтобы локализовать очаг инфекции [3, 18, 44]. Предварительный диагноз на ГП при возникновении случаев болезни или гибели птиц устанавливают на основании клинических, патологоанатомических и эпизоотологических данных [3, 4]. Окончательный диагноз устанавливают по результатам лабораторных исследований проб патологического материала и сывороток крови [4, 44]. В первую очередь, лабораторная диагностика вируса гриппа птиц направлена на выявлении антигена, его генетического материала (РНК) и/или выделение вируса с последующим его обнаружением и типированием при помощи серологичсеких реакций, а также обнаружение иммунных антител в сыворотках крови [3, 4, 44]. Вирус гриппа птиц имеет долгую историю развития, многие вирусологические методы, применяемые при исследовании и описания данного возбудителя, использовались многие года и хорошо зарекомендовали себя в области диагностики [3, 4, 18, 44].
Первый этап в диагностики гриппа птиц – это отбор проб, которые могут быть представлены внутренними органами, трахеальными/клоакальными смывами, фекалиями и сыворотками крови [211]. Успешное выделение и обнаружение антигена, его нуклеиновой кислоты или антител, будет зависеть от качества отобранного материала. Кроме того, условия транспортировки и хранения очень важны при диагностике гриппа птиц [211]. Низкопатогенный грипп птиц в первую очередь является респираторным заболеванием у домашней птицы и, как правило, у птиц отряда Курообразных вирус размножается в дыхательных путях, а у диких водоплавающих птиц в желудочно-кишечном тракте [211, 228, 229]. Что же касается ВПГП, то это системное заболевание и вирус можно выделить из большинства систем органов [226]. Образцы, собранные в течение трех дней с момента появления клинических признаков, дают лучшие результаты при выделении вируса и обнаружении его РНК [211]. Сбор образцов от павшей птицы нужно производить как можно быстрее, чтобы лучше сохранить вирус для дальнейших манипуляций [211]. При транспортировке рекомендуется использовать сердечно-мозговой бульон или специальные транспортные среды, содержащие буферные белки (триптон, пептон и др.), присутствие белка повышает шансы на сохранение жизнеспособности вируса при транспортировке. Если образцы не будут использованы для бактериологических исследований, рекомендуется добавить антибиотики для предотвращения роста бактериальной микрофлоры [211]. Вирусы ГП нестабильны в окружающей среде и быстро инактивируются под воздействием высоких температур, а также при высыхании [3, 4, 211]. Транспортировка сухих тампонов снижает вероятность выделения вируса, поэтому смывы должны быть сразу помещены в одну из транспортных сред, описанных выше. Отобранные образцы рекомендуется охладить и как можно быстрее отправить в лабораторию. Температура 2-8С наиболее оптимальная для транспортировки и хранения образцов [211]. Стоит помнить, что многократное замораживание-оттаивание снижает уровень титра вируса, антиген можно не обнаружить, если он присутствует в малых количествах. Замораживать образцы рекомендуется если исследования будут проводиться более чем через 48 часов [211]. Для сбора мазков (смывов) рекомендуется использовать полиэстеровые тампоны с пластиковыми ручками, а не ватные тампоны с деревянными ручками. Вирусы гриппа птиц реплицируются преимущественно в дыхательной системе и желудочно-кишечном тракте, поэтому следует отбирать ротоглоточные и клоакальные смывы, данные образцы подходят для выделения вируса и молекулярно-биологических исследований [3, 4, 211]. Хранить пробы смывов хранятся около недели при 4С и несколько месяцев при -20С или ниже [3, 4, 211].
Пробы внутренних органов используются при выделении вируса, молекулярно-генетических и иммуногистохимических методов исследования [211]. Положительные результаты при выделении вируса из внутренних органов (кроме дыхательной и пищеварительной систем), может указывать на системное заболевание, вызванное ВПГП [211]. Пробы внутренних органов должны отбираться стерильным инструментом и помещены в стерильную маркированную двухслойную упаковку (пластиковые пакеты или пробирки). Для диагностических исследований на наличие вируса ГП или его НК, следует отбирать следующие органы: трахея, легкие, воздухоносные мешки, кишечник, селезёнку, почки, головной мозг, печень и сердце [211]. Пробы органов могут быть упакованы индивидуально, либо объедены в пулы, объединять рекомендуется органы из одной систем, например, органы дыхательной системы (трахея, легкие, воздухоносные мешки), пищеварительная система (толстый и тонкий кишечник), паренхиматозные органы (печень, почки, селезенка) [211]. Свежие пробы органов могут быть сразу заморожены при -70С без использования транспортных сред и гомогенизированы при проведении вирусологических исследований [148].
Предварительный диагноз на ГП может быть поставлен после исследований проб сывороток крови на наличие специфических антител [3, 4, 44]. Антитела, в первую очередь, указывают на длительную циркуляцию вируса в стаде. Для исследования сывороток крови применяют следующие методы: иммуноферментный анализ (ИФА), реакция диффузной преципитации (РДП), и реакция торможения гемагглютинации (РТГА) [3, 4, 44]. Методы ИФА и РДП выявляют антитела к матриксному и нуклеокапсидному белкам и не являются типоспецифичными, в отличие от РТГА, в которой антитела обнаруживаются к определенному подтипу гемагглютинина [44]. Рекомендовано отбирать сыворотку не позднее чем через 7 дней после появления клинических признаков, а также в фазе выздоровления через 2-4 недели [3, 4, 44]. Кровь отбирают в объеме от 2 до 4 мл из подкрыловой вены в шприц объемом 5 мл, после сбора необходимо набрать максимальное количество воздуха в цилиндр шприца и положить шприц на бок, чтобы максимально увеличить площадь соприкосновения крови со стенками шприца [211]. Что бы отделить сыворотку, шприц инкубируют 4 часа при 37С, после отделения сгустка сыворотку отбирают в чистую пробирку и центрифугируют на низких оборотах для осаждения эритроцитов [211].
При проведении молекулярно-биологических работ важным этапом является эффективная экстракция и очистка вирусной РНК [211]. Исследуемые образцы можно разделить на две группы: концентрированные (вируссодержащие материалы) и клинические образцы, которые, как правило, представлены пробами органов или смывами. Чаще всего, для выделения нуклеиновой кислоты используют коммерческие наборы [211].
С начала 2000-х гг. в лабораторной диагностике ГП стали широко применять полимеразно-цепную реакцию обратной транскрипции в реальном времени (ОТ-ПЦР) для обнаружения вирусного генетического материала [211, 212]. Главные преимущества данного метода – это высокая чувствительность, высокая специфичность и быстрое время постановки реакции. Кроме того, ОТ-ПЦР выявляет все вирусы гриппа А, так как выявление направлено на консервативные гены М или NP [211, 212]. При постановке ПЦР-ОТ в режиме реального времени продукт ПЦР визуализируют с помощью флуорогенного зонда или красителя, связывающие нуклеиновую кислоту в режиме реального времени, т.е. во время каждого цикла ПЦР [79, 211, 212].
Полимеразную цепную реакцию стали широко применять в диагностике ГП с начала 2000-х гг. в качестве прямого метода и быстрого метода, основанного на обнаружении в качестве аналита специфичных участков генома возбудителя [211, 212]. Метод характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, позволяет проводить стандартизацию процедуры исследования и контролировать процесс обработки на всех этапах. Высокая аналитическая чувствительность ПЦР обеспечивается за счет лежащей в основе метода амплификации – многократного увеличения количества фрагмента нуклеиновой кислоты [211, 212]. Цикличность реакции достигается путем многократного (45-45 раз) последовательного повторения шагов инкубации реакционной смеси при разных температурах [79, 211, 212].
Выделение вируса гриппа птиц
За период 2014-2017 г. в референтную лабораторию вирусных болезней птиц ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» поступали пробы патологического материала от диких и домашних птиц для исследований, направленных на выявление и идентификацию вируса гриппа птиц типа А. Полученные пробы биологического материала (пробы внутренних органов, фекалии, трахеальные и клоакальные смывы) исследовали, рекомендуемым МЭБ, методом при диагностики гриппа -выделением вируса на развивающихся 9-11-суточных свободных от патогенной микрофлоры куриных эмбрионах. Индикацию гемагглютинирующего вируса в экстраэмбриональной жидкости КЭ проводили в РГА, а его дальнейшую дифференциацию в РТГА. Нейраминидазный подтип вируса определяли при помощи РИНА. Вирусовыделением исследовали все пробы от диких птиц, от домашних птиц в работу брали только пробы в которых был выявлен геном ВГП при молекулярно- генетических исследованиях. Всего было исследовано 3135 проб из них 2728 проб от диких и 408 проб от домашних видов птиц (табл. 1).
Все выделенные изоляты ВГП типа А за период 2014-2017 гг. представлены в табл. 2. Всего было выделено 89 изолятов ВГП при этом от диких видов птиц был выделено 34 изолятов, а от домашних 55 изолята. В 2014 г. было выделено 4 изолята только от домашних птиц при вспышке болезни в Алтайском крае. В 2015 году было выделено 7 изолятов от диких видов птиц, среди домашних птиц случаев выделения ВГП типа А не зафиксировано. В 2016 году было выделено 18 изолятов, из них 8 от диких птиц и 10 от домашних птиц. В 2017 г. было выделено 60 изолятов ВГП типа А, из них 41 от домашних птиц и 19 изолятов от диких, в том числе синантропных птиц.
Согласно данным представленным в табл. 3, пробы патологического материала из которых были выделены ВГП типа А поступили для исследований из 6 федеральных округов 16 регионов РФ, кроме того две пробы поступили из Республики Казахстан при вспышке инфекции среди диких лебедей на побережье Каспийского моря. Самое большое количество изолятов выделено из проб, поступивших на исследования из Центрального федерального округа, вирус изолировали в 29 случаях, из них 17 поступили из Московской области и 12 из Воронежской области, следует подчеркнуть, что упомянутые изоляты были выделены в первой половине 2017 года.
Так же стоит отметить, что из материала, отобранного от диких птиц, гнездящихся на побережье озера Убсу-Нур Республики Тыва, вирус гриппа выделяли в 2015 и 2016 гг., однако в 2017 году при вспышке гриппа птиц типа А выделить вирус не удалось. Дело в том, что данная территория входит в зону высокой степени риска по гриппу птиц ввиду высокой концентрации мигрирующих видов птиц на гнездовом ареале.
Согласно данным представленным в табл. 3, пробы патологического материала из которых были выделены ВГП типа А поступили для исследований из 6 федеральных округов 16 регионов РФ, кроме того две пробы поступили из Республики Казахстан при вспышке инфекции среди диких лебедей на побережье Каспийского моря. Самое большое количество изолятов выделено из проб, поступивших на исследования из Центрального федерального округа, вирус изолировали в 30 случаях, из них 17 поступили из Московской области, 12 из Воронежской области и 1 из Кстромской области, следует подчеркнуть. Стоит отметить, что из материала, отобранного от диких птиц, гнездящихся на побережье озера Убсу-Нур Республики Тыва, вирус гриппа выделяли в 2015 и 2016 гг., однако в 2017 году при вспышке гриппа птиц типа А выделить вирус не удалось. Дело в том, что данная территория входит в зону высокой степени риска по гриппу птиц ввиду высокой концентрации мигрирующих видов птиц на гнездовом ареале.
Видовое разнообразие птиц от которых были выделены ВГП типа А за период 2014-2017 гг. представлено в табл. 4. За указанный промежуток времени вирус был выделен от представителей 9 отрядов, 13 семейств и 17 родов. От домашних птиц вирус чаще всего выделяли от кур (34 изолята) и индеек (8 изолятов), а также от представителей отряда гусеобразных - гусей (4 изолята) и уток (3 изолята). Среди диких птиц наибольшее число случаев выделения вируса от лебедей (10 изолятов) и цапель (4 изолята), а также от уток, чомги и чаек (по 3 изолята). Таким образом вирус среди диких птиц чаще всего выделяли от представителей отряда гусеобразных (13 изолятов). Также стоит отметить случаи выделения ВГП типа А среди синантропных видов птиц, вирус изолировали от сороки (1 изолят) и воробья (1 изолят).
Изучение протективных свойств отечественных серийных вакцин в отношении ВГП подтипов H5N1 и H5N8, выделенных в 2015-2016 гг
Для изучения протективных свойств серийных вакцин, производимых на Территории Российской федерации, в отношении двух изолятов ВГП A/H5 с разными подтипами нейраминидазы, A/pelican/Astrakhan/272/15 H5N1 и A/goose/Kalmykia/813/16 Н5N8. В исследовании использовали вакцину «POKROV BIO Грипп птиц» произведенную Покровским заводом биоприпоратов и вакцину «ФЛУ Протект H5» произведенную Ставропольской биофабрикой. Обе вакцины в своей основе содержат штамм подтипа H5N1, выделенного при эпизоотиях в 2005 г.
В эксперименте использовали месячных, серонегативных к ВГП, цыплят. Было сформировано 4 группы, гр. №№ 1, 2 и 3по 20 цыплят, гр. № 4 состояла из 10 цыплят. Цыплят из гр. № 1 иммунизировали вакциной «POKROV BIO Грипп птиц», цыплят из гр. № 2 иммунизировали вакциной «ФЛУ Протект Н5». Птиц из гр. № 3 не иммунизировали. Цыплят из гр. № 4 инокулировали стерильным ФБР и содержали в качестве отрицательного контроля. Во всех случаях птиц инокулировали в область грудной мышцы в объеме 0,5 см3. Всем птицам на протяжении всего опыта был предоставлен открытый доступ к воде и корму. Заражение высоковирулентными изолятами производили спустя 21 сут. после иммунизации. Через 14 и 21 сут. после вакцинации были отобраны сыворотки крови с целью выявления антител к ВГП в РТГА и ИФА.
На протяжении 21 сут. после вакцинации птица во всех группах оставалсь клинически здоровой. Перед заражением гр. №№ 1, 2 и 3 были разделены на две подгруппы, для заражения разными изолятами ВГП, A/pelican/Astrakhan/272/15 H5N1 и A/goose/Kalmykia/813/16 Н5N8. Результаты наблюдения клинического состояния цыплят представлены в табл. 16.
Учет патогенного действия вируса, используемого для контрольного заражения, проводили по специфической гибели птиц и наличию клинических признаков инфекции. У вакцинированных птиц всех опытных групп, которые не погибли в течение 10 сут. после заражения и были отнесены к категории «больные», отмечали угнетенное состояние, анорексию и взъерошенность оперения, в группе птиц, привитых вакциной «POKROV BIO Грипп птиц», данные признаки постепенно стали исчезать к концу эксперимента. В контрольной группе кур, инфицированных вирусом ВГП Н5N1 («Астрахань») регистрировали первые клинические признаки заболевания через 48 часов (таблица 2), через 72 часа отмечали первые случаи гибели птиц, через 5 суток пало 100 % поголовья птиц. У зараженных птиц клинически болезнь проявлялась сильным угнетением, отказом от корма и воды, атаксией, диареей, взъерошенностью оперения, цианозом гребня и сережек, выраженными подкожными кровоизлияниями на голени.
В контрольной группе кур, инфицированных вирусом ВГП Н5N8 («Калмыкия») наблюдали клинические признаки заболевания через 48 часов (таблица 2), через 72 часа отмечались гибель всех птиц. У зараженных птиц отмечали только угнетение, диарею, атаксию, взъерошенное оперение. В интактной группе (отрицательный контроль) птицы оставались клинически здоровыми на всем протяжении эксперимента.