Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 13
1.1 Этиологическая структура и возбудителей респираторных и желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота 13
1.2 Диагностика респираторных и желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота 25
1.3 Специфические меры борьбы и профилактики респираторных и желудочно-кишечных инфекций телят 37
ГЛАВА 2 Материал и методы 55
2.1 Материалы исследований .55
2.2 Методы исследований .57
ГЛАВА 3 Результаты собственных исследований .74
3.1 Клинико-эпизоотологический, вирусологический и серологический мониторинг респираторных и желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота 74
3.2 Разработка и усовершенствование тест-систем для серологической диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота 94
3.2.1 Анализ структурных белков некоторых штаммов вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота .94
3.2.2 Усовершенствование технологии изготовления иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота 102
3.2.3 Испытание метода иммуноблотинга для серологической диагностики герпесвирусной типа 1 инфекции КРС 118
3.3 Разработка технологии изготовления, методов контроля и применения ассоциированной инактивированной вакцины против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и хламидиоза крупного рогатого скота .121
3.3.1 Изучение чувствительности различных линий культур клеток к вирусам ПГ-3, ИРТ и хламидиям крупного рогатого скота .121
3.3.2 Изучение факторов, влияющих на репродукцию вируса ПГ-3 и герпесвируса типа 1 КРС в культуре клеток 124
3.3.3 Изготовление экспериментальных образцов ассоциированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза КРС и изучение их антигенной активности в лабораторных условиях 129
3.3.4 Определение оптимальной иммунизирующей дозы ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины на кроликах .131
3.3.5 Контроль качества экспериментальных серий ассоциированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза КРС .133
3.3.6 Оценка эффективности ассоциированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза КРС в экспериментальных условиях 134
3.3.7 Определение антигенной активности и оптимальной иммунизирующей дозы ассоциированной вакцины в опытах на естественно восприимчивых животных 141
3.3.8 Оценка эффективности применения ассоциированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза КРС в производственных условиях 146
3.4 Разработка технологии изготовления, методов контроля и применения полиспецифической сыворотки против респираторных и желудочно кишечных инфекций телят
3.4.1 Изыскание оптимальных схем гипериммунизации животных продуцентов для изготовления полиспецифической сыворотки против
респираторных и желудочно-кишечных инфекций телят .149
3.4.2 Оценка лечебно-профилактической эффективности гипериммунной сыворотки при респираторных заболеваниях молодняка КРС 157
3.4.3 Производственные испытания полиспецифической сыворотки против респираторно-кишечных инфекций молодняка телят 163
Заключение .167
Рекомендации производству 1
- Диагностика респираторных и желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота
- Методы исследований
- Усовершенствование технологии изготовления иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота
- Контроль качества экспериментальных серий ассоциированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза КРС
Введение к работе
Актуальность темы. Ускоренное развитие животноводства, как известно, стало одним из приоритетных направлений агропромышленного комплекса Российской Федерации. Для этого создается принципиально новая технологическая база молочного скотоводства на основе строительства и модернизации комплексов и закупки высокопродуктивного племенного поголовья КРС. Реализация этих задач в значительной степени зависит от полноты наших знаний о биологии возбудителей инфекционных заболеваний и степени применения научно-обоснованных специальных и организационных форм борьбы с ними [220].
Для современного животноводства социально-экономическое значение имеют наиболее распространенные вирусные респираторно-кишечные инфекции молодняка и патология репродуктивных органов взрослого поголовья КРС, связанные с бесплодием, ранней эмбриональной смертностью и абортами, снижением молочной и мясной продуктивности, увеличением гибели молодняка и повышением риска возникновения вторичных бактериальных инфекций [25,40,54,93,147].
В развитии этих форм патологии КРС доминирующими признаны герпесвирус типа 1 (ИРТ-ИПВ), вирус вирусной диареи-болезни слизистых оболочек (ВД-БС), вирус парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальный (PC) вирус, аденовирусы, рота-, корона-, парво-, реовирусы, а также возбудители хламидиоза, патогенные виды микоплазм, различные бактерии и их ассоциации [176,237,275,298].
Из большого числа вирусов, герпесвирус типа I занимает особое место. Его роль в инфекционной патологии КРС связана с повсеместным распространением и способностью к латенции, многообразными клиническими признаками проявления и тяжестью их течения. Животное, находящееся в состоянии латенции, становится потенциально опасным и недостаточно контролируемым источником рассеивания вируса во внешнюю среду.
Другие болезни, как ПГ-3, РСИ, адено-, рота-, корона-, парво- и реовирусная инфекции КРС, хотя не внесены в перечень опасных вирусных инфекций, однако представляют также серьезную экономическую проблему для промышленного животноводства.
Успешная борьба с указанными смешанными инфекциями КРС во многом зависит от быстрой и достоверной диагностики, основанной на применении высокоспецифичных тест-систем, создания высокоактивных моно- и ассоциированных вакцин с учетом современных достижений биотехнологии. Следовательно, разработка и усовершенствование средств и методов лабораторной диагностики и специфической профилактики респираторно-кишечных инфекций молодняка крупного рогатого скота, а также внедрение их в ветеринарную практику все еще остаются в центре внимания современного научного поиска [9,60,64, 320].
Степень разработанности проблемы. В настоящее время изучены клинико-эпизоотологические особенности респираторно-кишечных инфекций молодняка КРС во многих регионах РФ. Однако, анализ литературных данных, свидетельствует о том, что все еще велико удельное значение хламидии, микоплазм, пастерелл, сальмонелл, стрептококков и других многочисленных бактерий в этиологической структуре данной формы патологии. Причем, очень часто хламидии участвуют в качестве этиологического агента в ассоциации с вирусами ИРТ, ПГ-3, аденовирусами и вирусом ВД-БС в различных сочетаниях. При этом заболеваемость протекает тяжело и сопровождается значительным отходом молодняка [190].
В этой связи сохраняется актуальность стабилизации эпизоотической ситуации в крупных промышленных комплексах, повышение качества биологических препаратов, расширение их ассортимента, проведение ветеринарно-санитарных мероприятий с учетом реальной эпизоотической обстановки, получаемых на основе анализа многолетних данных развития эпизоотического процесса на конкретной территории.
Учитывая, что респираторные и желудочно-кишечные инфекции телят имеют полиэтиологичную структуру, в настоящее время из специфических средств активной профилактики широкое применение находят как живые, так и инактивированные моно- и ассоциированные вакцины[12, 101,188].
Важным звеном в формировании специфической защиты новорожденных телят является перевод пассивного молозивного иммунитета в активный путем применения вакцинных препаратов.
В России для этих целей применяют: живые вакцины "Паравак», "Бивак", «Тривак» против ПГ-3, ИРТ, ВД-БС; ассоциированные инактивированные вакцины «ОКЗ», "Комбовак", "Комбовак-Р", "Комбовак-К", "Комбовак-А", против ПГ-3, ИРТ, ВД, PC, адено-, рота - и коронавирусной инфекций, сальмонеллеза, пастереллеза, протеи и эшерихиоза телят; импортные вакцины -«Скоугард 4КС», «Инфорос 3», «Хипробовис-4», «Бови-Шилд ГОЛД», содержащие в своем составе в различных сочетаниях антигены вышеперечисленных инфекционных агентов.
Другими эффективными средствами профилактики и терапии новорожденных телят от смешанных респираторных и желудочно-кишечных инфекций являются поливалентные гипериммунные сыворотки и иммуноглобулины и сыворотка реконвалесцентов. Широкое применение этих препаратов существенно снижает заболеваемость и гибель молодняка.
На сегодняшний день в Российской Федерации производятся два варианта сывороток («Сыворотка против пастереллеза, сальмонеллеза, эшерихиоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита КРС», «Имуносерум») против респираторных и желудочно-кишечных инфекций телят в ФГУП «Армавирская биофабрика». В данных препаратах имеются антитела против основных вирусных и бактериальных агентов. Тем не менее, изучение закономерностей циркуляции и персистенции вирусов ИРТ-ИПВ, ВД-БС, ПГ-3, аденовирусов и
хламидий, оценка иммунологических сдвигов, происходящих в организме больных и переболевших животных, явились для нас основанием для усовершенствования технологии получения полиспецифической гипериммунной сыворотки против смешанных форм респираторно-кишечных инфекций телят.
Несмотря на очевидные успехи в решении проблем сохранности молодняка, все еще проводимый уровень диагностических исследований не соответствует современным требованиям. Кроме того, применение вакцин, производимых в стране, по существующим программам борьбы со смешанными респираторно-кишечными инфекциями молодняка и патологии репродуктивных органов взрослого поголовья КРС, не всегда достигает желаемых результатов.
Цель и задачи. Целью исследований являлась разработка и усовершенствование технологии изготовления эффективных биологических препаратов для диагностики и специфической профилактики респираторно-кишечных заболеваний молодняка крупного рогатого скота.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
1. Провести клинико-эпизоотологический и сероиммунологический мониторинг респираторно-кишечных инфекций КРС в животноводческих хозяйствах Приволжского федерального округа и ряда регионов РФ;
2.Выделить из патологических и клинических материалов, взятых от павших и больных животных, возбудителей указанных форм патологий и идентифицировать их на основе изучения иммунобиологических свойств;
3. Усовершенствовать технологию получения основных иммуноком-
понентов иммуноферментной тест-системы, предназначенной для
серологической диагностики инфекционного ринотрахеита КРС;
4. Теоретически и экспериментально обосновать необходимость создания
ассоциированной вакцины на основе наиболее иммуногенных штаммов вирусов
и хламидий;
5. Изыскать наиболее эффективные технологии получения лечебно-
профилактических сывороток против респираторных и желудочно-кишечных
инфекций телят раннего возраста;
6. Разработать нормативные документы, регламентирующие изготовление,
контроль качества и применение ассоциированных вакцин и полиспецифических
сывороток.
Научная новизна работы. В результате проведения клинико-эпизоотологического, вирусологического, серо-иммунологического мониторинга респираторных и желудочно-кишечных инфекций КРС получены новые данные о степени их распространения в неблагополучных хозяйствах Приволжского федерального округа и ряда регионов Российской Федерации.
Впервые разработана «Ассоциированная вакцина против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная».
Впервые апробирован метод иммуноблотинга для серологической диагностики ИРТ крупного рогатого скота.
Усовершенствован способ получения антигена герпесвируса-1 КРС -основного иммунокомпонента, входящего в состав иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики инфекционного ринотрахеита.
Впервые разработана эффективная технология получения в производственных условиях двух вариантов полиспецифической лечебно-профилактической сыворотки против респираторных и желудочно-кишечных инфекций КРС, используя в качестве иммуногенов экспериментальные вакцины, а также биопрепараты, регистрированные Россельхознадзором РФ.
Новизна научных исследований диссертационной работы подтверждена 3-мя авторскими свидетельствами РФ на изобретение.
Теоретическая и практическая значимость. Комплексными клинико-эпизоотологическими, вирусологическими и серологическими исследованиями в хозяйствах Приволжского федерального округа и некоторых регионов РФ установлена полиэтиологичность возбудителей и смешанное течение респираторных и желудочно-кишечных инфекций КРС. Определен характер той или иной формы инфекционного процесса и его экономическое значение. Полученные данные послужили основанием для разработки и усовершенствования средств диагностики и специфической профилактики этих инфекций. На основании результатов исследований разработаны и предложены для внедрения в ветеринарную практику новые эффективные препараты для диагностики и профилактики респираторных и желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота: «Ассоциированная вакцина против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и хламидиоза крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная», «Полиспецифическая сыворотка против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и хламидиоза крупного рогатого скота»,. «Полиспецифическая сыворотка против респираторных и желудочно-кишечных инфекций телят» и «Тест-система иммуноферментная для выявления антител к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИФА-АНТИ-ИРТ)».
По материалам исследований автор награжден золотой медалью «Лауреата ВВЦ»-1999 г. В конкурсе на лучшую продукцию, экспонируемую на выставке «Мир биотехнологии1 2011» ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» награжден медалью за «Ассоциированную вакцину против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза КРС».
Методология и методы исследований. С целью выполнения поставленных задач были использованы клинико-эпизоотологические, вирусологические, бактериологические, серо-иммунологические, патологоанатомические и иммунобиохимические методы исследований. При разработке средств специфической профилактики применены современные достижения биотехнологии. Подробное описание методологии и методов проведения исследований отражены в главе «Материалы и методы».
Положения, выносимые на защиту^
1. Клинико-эпизоотологический, вирусологический, бактериологический,
серологический мониторинг респираторных и желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота.
-
Усовершенствование иммуноферментной тест-системы и апробирование метода иммуноблотинга для серологической диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.
-
Разработка «Ассоциированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза КРС инактивированной эмульсионной» для специфической профилактики смешанных форм респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота.
4. Разработка наиболее эффективной технологии изготовления поли
специфических гипериммунных сывороток против смешанных форм
респираторно-кишечных инфекций молодняка КРС и результаты испытания
лечебно-профилактического действия их в лабораторно-производственных
условиях.
Степень достоверности и апробация результатов. Опыты проведены с использованием большого количества объектов исследования. Статистическая обработка цифрового материала осуществлена с применением компьютерной технологии.
Основные положения диссертационной работы представлены и доложены: на ежегодных заседаниях ученого совета ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (1980-2015 г.г.); на международных и всероссийских научно-практических конференциях и конгрессах (Москва 1981-2005; Казань 1982-2016; Новосибирск 1983, 1991; Владимир 1995, 2003; Витебск 1996; Курск 1996; Щелково 1996, 2000; Краснодар 1997; Ульяновск 2003; Киев 2011; Уфа 2014).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликована 71 научная работа, из них 17 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, в том числе 3 авторские свидетельства на изобретения.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 278 страницах компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, заключение с рекомендациями производству, список сокращенных терминов, список использованной литературы (всего 345 источников, в том числе 105 зарубежных), список иллюстрированного материала и приложения. Диссертация содержит 41 таблицу и иллюстрирована 27 рисунками.
Диагностика респираторных и желудочно-кишечных инфекций крупного рогатого скота
Аденовирусная инфекция чаще проявляется энзоотически, поражая отдельные группы животных, быстро распространяясь на все стадо. Чаще всего заболевают телята в возрасте от 2 недель до 4-х месяцев. Болезнь проявляется повышением температуры тела до 41,5 0С, слезотечением, серозным истечение из носа, кашлем, затрудненным дыханием и диареей. Телята гибнут через 1-3 дня после появления первых симптомов болезни. Среди телят раннего возраста смертность достигает 60%. У животных старшего возраста болезнь часто приобретает хроническое течение: отмечают кашель, диарея, истощения, отставание в росте и развитии.
В специфической профилактике аденовирусной инфекции КРС предпочтение отдают применению инактивированной вакцины. У вакцинированных коров антитела сохраняются в течение 6 месяцев после отела, а у телят -4 мес. после вакцинации.
Вакцинация стельных коров – основное направление профилактики аденовирусной инфекции у новорожденных телят. Вполне естественно, что выраженность пассивного иммунитета у телят зависит от исходного уровня антител в молозиве и его количества, потребленного в первые 24 часа жизни [54, 330].
В настоящее время установлено, что респираторно-синцитиальный вирус является важным этиологическим агентом энзоотической бронхопневмонии телят и вспышек респираторных болезней у взрослых высокопродуктивных животных [54]. Болезнь встречается во всем мире [297]. Серопозитивность животных к вирусу колеблется в пределах 30-70%. В некоторых странах частота возникновения вспышек инфекции высока, и считается, что вирус ответственен за 60% энзоотических вспышек респираторных болезней молодняка КРС в молочных и 70% в мясных стадах [293].
Частота вспышек болезни коррелирует с плотностью животных на единицу площади и возрастом восприимчивых животных, а также с вводом новых животных-вирусоносителей в стадо. Более высокую восприимчивость к заражению вирусом проявляют молодые неиммунные животные, а относительная устойчивость взрослого скота объясняется приобретенным иммунитетом, вызванным многократным контактом с вирусом в течение жизни. Заболеваемость, как правило, составляет 60-80%, а летальность в некоторых случаях может достигать 20% [323].
В структуре заболеваний новорожденных телят основное место занимают нарушения функции пищеварения, проявляющиеся диареей и, как следствие, резко выраженной дегидратацией, токсемией и иммунодефицитом. Указанная патология регистрируется у 50-100% телят, а гибель может достигать 30-50% и более от народившегося молодняка [135].
При диареях новорожденных телят выделяют рота-, корона-, парво-, того-, калици-, пести-, астро- и реовирусы. Наиболее актуальными являются рота- и коронавирусная инфекции КРС. Возбудители последних двух инфекций обладают высоким тропизмом к эпителиальным клеткам слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта новорожденных телят и вызывают у них тяжелый и быстротекущий энтерит, часто заканчивающийся летальным исходом. Эти вирусы способны вызвать болезнь самостоятельно, а также в виде ассоциации - рота-коронавирусной инфекции, в которой могут также участвовать вирус диареи-болезни слизистых оболочек и токсикогенные колибактерии [81, 97, 245, 302].
Известно, что хламидии имеющие уникальный цикл развития и являющиеся облигатными внутриклеточными паразитами, вызывают широкий спектр клинических проявлений инфекционных болезней: пневмонии, аборты, энтериты, менингоэнцефалиты, конъюнктивиты и артриты, которые приводят к гибели животных, снижению их продуктивности и племенной ценности, недополучение приплода, а также представляют угрозу здоровья людей.
При этом хламидии обладают способностью вызывать как острое заболевание, так и латентную инфекцию с длительным носительством. Участвуя в ассоциации с герпесвирусом типа I, вирусами вирусной диареи, парагриппа-3, адено-, парво-, реовирусами, микоплазмами и бактериями в различных сочетаниях, они отягощают течение ряда заболеваний животных. Инфекционный процесс протекает тяжело и сопровождается значительным отходом животных.
Бронхопневмония телят, вызываемая хламидиями, характеризуется лихорадкой, развитием ринита, бронхита, пневмонии и в ряде случаев сопровождается двухсторонним конъюнктивитом и диареей. Клиническое проявление болезни сильно варьируют от латентного до тяжелой пневмонии и энтерита с острым и хроническим течением. По-видимому, это зависит от возраста животного, вирулентности возбудителя и сопутствующих агентов вирусной и бактериальной природы. Так, желудочно-кишечными расстройствами страдают чаще всего телята в возрасте от 2 до 16 дней, а поражением органов дыхания от 10-20 дней до 5-6 мес. При изучении патогенеза экспериментальной инфекции телят, протекающей с подъемом температуры, бронхопневмонией и диареей, в период с 7 по 21-й день, был обнаружен антиген хламидий в различных органах, без выраженной органотропии. Особенно многочисленное скоплений зрелых элементарных телец хламидий было выявлено в тимусе, бронхиальных лимфатических узлах и селезенке. Через 7 дней после начала опыта накопление антигена в слизистой оболочке носа и трахеи было выражено сильнее, чем в легких. При вскрытии обнаружились мелкие очаги уплотнения в верхушечных, сердечных и кранио-вентральных участках диафрагмальных долей легких. Имело место фиброзный перетонит, фиброзные спайки между печенью и диафрагмой, толстым и тонким отделами кишечника и брюшной.
Методы исследований
Разработка компонентов иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики ИРТ КРС Технология получения антигена вируса ИРТ для изготовления иммуноферментной тест-системы Получение биомассы вируса инфекционного ринотрахеита осуществляли на перевиваемых линиях культуры клеток ЛЭК, МДВК и ТR методами роллерного и стационарного культивирования. Инфицирование вирусом ИРТ 2-3–х суточной культуры клеток проводили в дозе 0,1-1,0 lg ТЦД 50/клетка после замены ростовой среды на поддерживающую. Зараженные культуры клеток инкубировали при температуре 370С в течение 30-36 часов. Для выделения высокоактивного антигена герпесвируса типа 1 для иммуноферментной тест-системы были применены 3 метода очистки и концентрирования вирусной биомассы.
Первый метод – биомассу вируса ИРТ подвергали 3-х кратной заморозке при Т - 200С с последующим оттаиванием при 370 С. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость повторно центрифугировали при g=90000, в течение 60 минут. Образовавшийся осадок диспергировали в фосфатном буфере рН 7,2-7,4 и очищали скоростным центрифугированием через 40 % раствор сахарозы при g=100000 в течение 1 часа.
Второй метод – вируссодержащую культуральную жидкость обрабатывали ультразвуком на аппарате УЗДН-2Т при 22 кгц, 0,5 Ватт/см2-120 секунд. Разрушенные фрагменты клеток удаляли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 минут. После этого надосадочную жидкость смешивали с ПЭГ-6000 в концентрации 7 % и оставляли на контакт в течение 14-18 ч при 40С. Концентрирование вирусной биомассы осуществляли центрифугированием при 8000 об/мин в течение 40 минут. Дальнейшую очистку вирусного антигена проводили аналогично, что и при первом методе. Третий метод – вирусную биомассу, не подвергавшуюся замора живанию осаждали центрифугированием при 17000 об/мин в течение 30 минут. Затем осадок ресуспензировали в гомогенизаторе при 40 С с 2 %-ным раствором тритона Х-100 в соотношении 1:1, после чего фрагменты разрушенных клеток удаляли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость смешивали в соотношении 3:1 с насыщенным раствором сульфата аммония и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин, в результате чего происходило расслоение вирусной суспензии на 3 фракции. Затем вируссодержащую среднюю фракцию отбирали и диализировали против дистиллированной воды в течение 26-40 ч. Далее вирусный антиген центрифугировали через градиент плотности (20-60 %) сахарозы при g=100000 в течение 1 часа.
Получение контрольных сывороток Для определения активности антигенов вируса ИРТ, полученных тремя вышеперечисленными методами, а также для проверки активности экспериментальных серий иммуноферментной тест-системы, была разработана эффективная схема гипериммунизации кроликов очищенным препаратом герпесвируса типа 1 с целью получения контрольной положительной сыворотки. При отработке данной схемы готовили смесь антигена с полным адъювантом Фрейнда и вводили с двух сторон внутрикожно в 5-и точках, в области спины. Повторное введение антигена кроликам проводили подкожно в области плечевого пояса через 90 дней с неполным адъювантом Фрейнда. На 10-ый день после повторной инъекции антигена у подопытных животных отбирали пробы крови для серологических исследований. Кролики, с высоким уровнем специфических антител в РН и ИФА к антигену вируса ИРТ, использовались нами в дальнейшем как доноры для получения специфической сыворотки. В опытах по получения контрольной положительной сыворотки КРС для иммуноферментной тест-системы были выбраны две схемы иммунизации 6-и серонегативных к герпесвирусу типа 1 бычков (по 3 головы на каждую схему) в производственных условиях.
Первая схема гипериммунизации животных включала в себя 4-х кратную с интервалом 7 дней внутривенную инъекцию вакцинного штамма «ТК-А (ВИЭВ)В-2» герпесвируса типа 1 с инфекционным титром 6,0 lg ТЦД 50/мл. Антиген подопытным бычкам вводили в возрастающих дозах: 10,0; 20,0, 40,0 и 40,0 мл/гол. Через 7 дней после последней иммунизации брали пробы крови для серологических исследований. Животные, с высокими титрами антител к герпесвирусу типа 1, использовались нами в дальнейшем как продуценты специфической контрольной сыворотки.
Вторая схема гипериммунизации бычков основывалась на 4-х кратном, с интервалом 14 дней, внутримышечном введении в области средней трети шеи по 2,0 см3/гол. концентрированного эмульгированного в вакцинном масле антигена вируса ИРТ. Взятие крови у подопытных животных, с целью получения специфической контрольной сыворотки, проводили через 5-7 дней после заключительного цикла иммунизации. Получение антивидового конъюгата против Ig быка для иммуноферментной тест-системы Выделение иммуноглобулинов из сыворотки крови КРС осуществляли методом осаждения насыщенным раствором сульфата аммония и очисткой на хроматографической колонке с сефадексом G-50 и в дальнейших экспериментах использовали их в качестве антигена для иммунизации кроликов. Препарат животным вводили 3-х кратно с интервалом 6 дней подкожно в 10-ти точках вдоль позвоночника с обеих сторон. Четвертая заключительная инъекция антигена проводилась внутривенно в дозе 72 мг. Тотальное взятие крови осуществлялось через 7 суток после последнего введения иммуноглобулина. Активность и специфичность гипериммунной сыворотки проверяли в ИФА и РДП. В дальнейшем глобулины из гипериммунных сывороток кроликов получали путем высаливания насыщенным раствором сульфата аммония. Затем глобулины очищали через колонку с сефадексом G-150. Отбор фракций проводили в пенициллиновые флаконы, количество белка в них определяли при длине волны 280 нм на спектрофотометре СФ-46.
Выделенные фракции объединяли и затем концентрировали в воздушном потоке в диализных мешках при 6-80С до конечного содержания белка 15 мг/мл. Конъюгацию иммуноглобулинов с пероксидазой хрена осуществляли по методу Nakane P. и Kawaoi A. (1974). Специфичность и активность препарата проверяли в ИФА и РДП с использованием сыворотки крови КРС, лошади, свиньи, овцы, кролика, морской свинки и мыши. Разработка лабораторного регламента изготовления и контроля тест-системы ИФА-АНТИ-ИРТ При постановке ТФ-ИФА существенную роль играет сенсибилизация вирусным антигеном иммунологических планшет. Учитывая данное обстоятельство, перед нами была поставлена задача определить оптимальную иммобилизирующую концентрацию антигена по белку, а также выбрать способы адсорбции его на планшеты. Концентрацию белка в антигене определяли на спектрофотометре СФ-46. В дальнейшем на растворе КББ (pH 9,6-9,8) готовили разведения антигена в концентрациях 3, 5 и 10 мкг/мл для сенсибилизации иммунологических планшет.
Усовершенствование технологии изготовления иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота
При постановке иммуноферментного анализа с вирусными препаратами, взятыми на каждых стадиях очистки, с пулом проб сыворотки крови животных-реконвалесцентов крупного рогатого скота было установлено, что концентрирование антигена начинается при осаждении вируссодержащей культуральной жидкости (проба №2, табл. 6). После обработки вирусной биомассы детергентом зарегистрировано лишь незначительное повышение иммунологической активности вирусного препарата, так как на этом этапе происходит высвобождение вируса из клеточного комплекса (проба №3). Самая высокая активность антигена была выявлена во фракциях №2 и №3 после ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. (пробы №5 и №6). При этом его концентрация в 5-10 раз (за вычетом контроля) была выше чем в первоначально взятой вируссодержащей культуральной жидкости (проба №1).
Таким образом, нами усовершенствован метод выделения антигена герпесвируса типа 1, основанный на десорбции вирионов с инфицированных клеток детергентом с последующим концентрированием и очисткой высокоскоростным центрифугированием в градиенте сахарозы.
Общеизвестно, что основными критериями повышения специфичности и чувствительности иммуноферментных тест-систем для диагностики вирусно-бактериальных инфекций является получение высокоактивных и специфичных антигенов и контрольных сывороток.
При получении контрольной специфической сыворотки крови крупного рогатого скота для иммуноферментной тест-системы использовали две схемы гипериммунизации 6-и (по 3 головы на каждую схему) серонегативных к герпесвирусу типа 1 откормочных бычков вакцинным штаммом «ТК-А (ВИЭВ)-В2» и концентрированным, инактивированным антигеном эпизоотического штамма «КА-9» вируса инфекционного ринотрахеита КРС.
В первой схеме подопытным животным вводили внутривенно 4-х кратно с интервалом 7 дней очищенный от клеточной биомассы вакцинный штамм герпесвируса типа 1 с инфекционным титром 6,0 lg ТЦД 50/мл.
Вторая схема гипериммунизации откормочных бычков основывалась на 4-х кратном, с интервалом 14 дней, внутримышечном инъекции концентрированного эмульсионного антигена герпесвируса типа 1КРС. В таблице 7 представлены результаты оценки уровня антител в реакции нейтрализации и ИФА к вирусу ИРТ в специфических сыворотках крупного рогатого скота, полученных по двум вышеописанным схемам гипериммунизации подопытных животных. Таблица 7 - Уровень специфических антител у гипериммунизированных животных к герпесвирусу типа 1 КРС № схем иммуни зации Способы введения антигена № животных РН ИФА,ОП4901:400 1. Четырехкратная внутривенная инъекция вакцинного шт. герпесвируса типа 1 (инфек. титр 6,0 lg ТЦД/50 мл) 218 245 262 1:64 1:128 1:128 0,88 1,28 1,19 Среднее значение титров антител по группе (п=3; Р 0,05) 1:106±0,07 1,12±0,12 2. Четырехкратная внутримышеч-ная инъекция концентрирован-ного масляного антигена вируса ИРТ (конц. белка 3,5-4,2 мг/мл) 189 212 238 1:128 1:64 1:64 1,11 0,85 0,92 Среднее значение титров антител по группе (п=3; Р 0,05) 1:85±0,09 0,96±0,11
Данные таблицы свидетельствуют о том, что у подопытных бычков обеих групп регистрируются в высоких титрах антитела как в реакции нейтрализации от 1:64 до 1:128, так и в ИФА при разведение сывороток 1:400 значение ОП490 колеблется от 0,85 до 1,28. При этом, средние значения уровня специфических антител у животных первой группы составили в РН -1:106, в ИФА величина ОП490–1,12, а во второй–1:85 в РН и ОП490–0,96 в ИФА соответственно. Таким образом, нами разработаны эффективные схемы гипериммунизации крупного рогатого скота, позволяющие получать специфичные и высокоактивные контрольные диагностические сыворотки для проведения иммунохимических анализов.
Контрольную специфическую сыворотку кролика для оценки активности и специфичности антигенов герпесвируса типа 1, выделенных тремя вышеперечисленными способами обработки вируссодержащей культуральной биомассы (воздействия температуры, ультразвука и неионного детергента) получали путем гипериммунизации их очищенным вирусным антигеном по методу G. Bailey (1984) в нашей модификации.
С этой целью подопытным кроликам внутримышечно в объеме 1,0 см3 вводили антиген, содержащий 200 мг вирусного белка с неполным адъювантом Фрейнда ("грунд" иммунизация). Затем, через 14 дней, провели повторную иммунизацию животных эмульсией очищенного герпесвирусного антигена в концентрации 100 мкг /см3 с полным адъювантом Фрейнда внутрикожно в 10 точек по 10 мкг /см3 вдоль позвоночного столба кролика. При исследовании проб сыворотки крови кроликов после завершения цикла иммунизации средние значения титров антител составили 1:128 в реакции нейтрализации и при разведении 1:400 величина ОП 490 в ИФА регистрировался на уровне 1,342±0,015.
Контроль качества экспериментальных серий ассоциированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза КРС
Высокий процент заболеваемости и выбраковки новорожденных телят был зарегистрирован в 6-и крупных молочных комплексах с импортным поголовьем скота. При обследовании животных в данных хозяйствах были выявлены случаи массовой диареи с летальным исходом до 15-50% молодняка. Следует также отметить, что респираторные заболевания до 50% регистрировались среди телят больных и переболевших гастроэнтеритами [237].
Для решения проблемы быстрой и точной диагностики, рациональной профилактики и лечения крайне важным является раскрытие их этиологии. Расшифровку природы наблюдаемых заболеваний осуществляли с серологическими и вирусологическими методами исследований с учетом эпизоотологических особенностей, клинической картины и результатов патологоанатомического вскрытия. С целью определения спектра
инфекционных агентов, циркулирующих у животных в каждом конкретном хозяйстве, комплексно изучали уровень гуморальных антител к основным возбудителям респираторных болезней с применением специальных диагностикумов. Наиболее показательны были результаты исследований сывороток крови сухостойных коров и телят до 30 дневного возраста: если выявление наиболее высокого процента положительно, но реагирующих новорожденных животных было обусловлено с уровнем молозивного иммунитета, а у матерей это связано с повышенным накоплением специфических антител перед отелом [69, 102, 177]. Известно, что лабораторные исследования доказательны в тех случаях, когда у больных животных удается выделить вирусы и обнаружить нарастание к ним антител. Поэтому в своих исследованиях мы стремились сочетать выявление сероконверсии в парных пробах сыворотки крови с выделением возбудителей, хотя последнее является весьма трудоемким, в тоже время необходимым условием для установления этиологического значения их при респираторных инфекциях [54, 106]. В результате проведенных исследований было выделено 16 инфекционных агентов, идентифицированных как вирус ПГ-3, ИРТ, аденовирус, вирус ВД-БС КРС и как возбудитель хламидиоза КРС. Электронномикроскопическое исследование подтвердило достоверность результатов их серологической идентификации. Кроме того, при более детальном изучении их путем экспериментального заражения телят удавалось воспроизвести заболевание, сходное в клинико-патологическом отношении с естественными случаями болезни.
В течение 1980-2015 гг. серологическими методами была выявлена этиологическая структура наблюдаемых респираторно кишечных инфекций в 248 неблагополучных хозяйствах 20-и республик и областей РФ: у телят обнаружились парагриппозная инфекция (76,5%), инфекционный ринотрахеит (41%), вирусная диарея (28,0%), аденовирусная инфекция (24,9%) и хламидиоз (30,1%). Следовательно, в обследованных нами хозяйствах в этиологии респираторных заболеваний молодняка КРС доминирующее положение занимают вирусы ПГ-3, ИРТ, аденовирусы и хламидии. Полученные нами данные сопоставимы с результатами многочисленных исследователей [18, 46, 169, 179, 225,268].
Наряду с этим, важно отметить и другое обстоятельство, имеющее на наш взгляд, не только практическое, но и теоретическое значение: в 64,2% случаях было установлено одновременное нарастание титров антител к двум, трем и даже четырем возбудителям. Эти вирусные, хламидийные и в ряде случаев микоплазменные ассоциации постоянного или случайного состава, по-видимому, широко распространены и представляют одну из эволюционно сложившихся форм существования микроорганизмов в биосфере. Речь идет о сложном характере взаимодействия вирусных и других микробных популяций на фоне измененной реактивности клетки и организма.
Учитывая вышеизложенное, организация эффективных мер борьбы и профилактики респираторных и желудочно-кишечных инфекций телят во многом зависит от быстрой и достоверной их диагностики.
Предварительный диагноз на респираторные и желудочно-кишечные инфекции телят можно поставить в практических условиях путем проведения клинико-эпизоотологических и патологоанатомических исследований. Однако, в связи с тем, что вышеуказанные заболевания молодняка КРС вызываются ассоциацией вирусно-бактериальной микрофлоры, то достоверный диагноз можно поставить только на основании комплексных лабораторных исследований [141, 156, 275].
Известно, что из экономических значимых инфекционных болезней у КРС в России диагностируется ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, ротавирусная, коронавирусная и другие инфекции новорожденных телят. Во многих хозяйствах на ограниченной территории содержатся большое количество крупного рогатого скота различного происхождения и, соответственно, с различным иммунным статусом и циркуляцией различных микроорганизмов. Все это требует особого подхода к проблеме диагностики и профилактики упомянутых выше наиболее актуальных инфекционных болезней [154]. В этой связи при подозрении на эти болезни алгоритм комплексных исследований может быть осуществлен следующим образом: 1 Исследование спермы быков-производителей методом ПЦР для исключения (или подтверждения) передачи вирусов в процессе осеменения коров; 2. Исследование сыворотки крови без молозивных телят на наличие противовирусных антител методами ИФА и РН для исключения возможности (или подтверждения) внутриутробного инфицирования плодов. 3. При абортах - исследование биоматериала плода методом ПЦР на наличие вирусов;