Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Лейкоз крупного рогатого скота 8
1.2. Историческая справка 8
1.3. Характеристика возбудителя 9
1.3.1. Морфология и химический состав 10
1.3.2. Геном вируса 14
1.4. Этиология бычьего лейкоза 15
1.5. Особенности патогенеза 16
1.6. Эпизоотология лейкоза крупного рогатого скота 19
1.6.1. Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в РФ 20
1.6.2. Эпизоотическая ситуация в Республике Татарстан 21
1.7. Методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота 22
1.7.1. Гематологический метод 23
1.7.2. Реакция иммунодиффузии (РИД) 24
1.7.3. Иммуноферментный анализ (ИФА) 26
1.7.4. Полимеразная цепная реакция (ІГЦР) 27
1.7.5. ПЦР-ПДРФ-анализ 28
1.7.6. Филогенетический анализ 29
1.7.7. Посмертная диагностика лейкоза крупного рогатого скота 30
1.8 .Экономический ущерб от лейкоза крупного рогатого скота 31
1.9. Профилактика лейкоза крупного рогатого скота 31
1.10. Заключение по обзору литературы 32
Собственные исследования 33
2. Материалы и методы исследования 33
3. Результаты собственных исследований 40
3.1. Эпизоотическая ситуация по Республике Татарстан в отношении лейкоза крупного рогатого скота з
3.1.1. Сводные данные результатов серологических и гематологических исследований животных на лейкоз крупного рогатого скота за 2006-2014 гг . 40
3.1.2. Степень инфицированности крупного рогатого скота в разрезе районов Республики Татарстан по состоянию на 2010-2014 гг 40
3.2. Генотипирование изолятов вируса бычьего лейкоза, выявленных среди поголовья крупного рогатого скота в Республики Татарстан 46
3.3. Типизация депонированных в GenBank NCBI представителей BLV в зависимости от выбранных стратегий геноидентификации 50
3.4. Разработка и апробация стратегии ІТЦР-ПДРФ-генотипирования ВБЛ согласующейся с филогенетической классификацией возбудителя 60
3.5. Систематизация информационных данных о фактах выявления представителей нового (8-го) генотипа BLV в различных регионах мира 89
4. Обсуждение результатов исследования 93
5. Выводы 104
6. Практические предложения 105
Список сокращений и условных обозначений 106 список использованной литературы 108
Приложения 1
- Геном вируса
- Методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота
- Сводные данные результатов серологических и гематологических исследований животных на лейкоз крупного рогатого скота за 2006-2014 гг
- Разработка и апробация стратегии ІТЦР-ПДРФ-генотипирования ВБЛ согласующейся с филогенетической классификацией возбудителя
Геном вируса
Возбудитель лейкоза кр.рог.ск. - онкогенный вирус (РНК-содержащий) рода Oncovirus семейства Retroviridae [76, 89, 102, 113, 122]. Вирус бычьего лейкоза (ВБЛ) в морфологическом аспекте проявляет схожесть с возбудителями, вызывающими лейкоз у других видов животных. При этом, антигенная структура вируса существенно различается. Известен серовариант вируса, к которому восприимчивы, помимо кр.рог.ск. еще и овцы и козы.
По структуре и морфологии вирус бычьего лейкоза относится к типу С, а по онкогенным свойствам делится на три группы: 1) медленнотрансформирующийся, или вирус хронического лейкоза; 2) быстротрансформирующийся, или вирус острого лейкоза. 3) трансрегулирующиеся вирусы (по структуре и морфологии вирусы схожи с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). Геном вируса бычьего лейкоза содержит гены, кодирующие как структурные белки (gag-ген), включая гликопротеид оболочки (ewv-ген), так и обратную транскриптазу (/?о/-ген), Вирус имеет в своем геноме онкогены V-onko [18]. Согласно данным многих ученых вирусные частицы (вирионы) имеют выраженный полиморфизм.
Большинство вирионов имеют сферическую форму диаметром 90-120 нм, состоящие из сердцевины, внутренней белковой мембраны и липидосодержащей наружной мембраны. На поверхности внешней оболочки имеются пепломеры (шипики) с утолщением пуговкообразной формы на конце (8-11 нм), состоящие субъединиц, которые образованы двумя типоспецифичными вирусными белками (gp51, gp30).B сердцевине различают капсулу сердцевины с иксоэдральным происхождением и нуклеотид, расположенный в центре вириона размером 60-90 нм. [50]. В вирионах обнаружено 4-6 белка, один из них непосредственно связан с РНК [126]. В состав наружной оболочки входят 2 белка - поверхностный (SU) и трансмембранный (ТМ) [62], на них имеются типоспецифические антигенные детерминанты, индуцирующие синтез вируснейтрализующих антител. Белки сердцевины являются группоспецифическими антигенами. Более 10 ферментов ассоциировано с сердцевиной вирионов. В отличие от других вирусов, убивающих инфицированную ими клетку, ретровирусы лишь приводят к хронической инфекции чувствительных к заражению ими клеток. Даже продолжительная экспрессия генов вируса, как правило, не приводит к цитотоксическому эффекту с последующей гибелью инфицированной клетки. Может лишь усиливаться клеточная пролиферация или не обнаруживаются никаких изменений характера роста клеток [60].
Химический состав вирусных частиц (вирионов) следующий: на 60% состоят из протеинов, на 35% - из липидов, доля нуклеиновые кислот и углеводов - 2,2% и 0,5%, соответственно.
Благодаря же своим биологическим свойствам, вирус встраивается в геном хозяина посредством ДНК-копии и значительное время ни чем себя не проявляет, что обуславливает латентный период развития заболевания [31]. Ранее проводимые сероэпидемиологические исследования на возможную связь лейкоза человека и животных показывали, что инфицированных вирусом бычьего лейкоза людей не выявлено [49].
Устойчивость. Известна чувствительность вируса к воздействиям температур: повторное замораживание и оттаивание, или 15-ти минутное нагревание при 56С убивает вирус. Также вирус чувствителен к жирорастворителям, детергентам [60]. Пастеризация молока 16 секунд при 74С разрушает вирус, теряется его инфекционность. Прямой солнечный свет инактивирует вирус в течение 4 ч, УФ лучи - в течение 30 мин. (120 Вт на расстоянии 1 м). BLV полностью теряет активность в растворах едкого натра (0,5%, мин, 22С), этанола (2,0%, 4 ч, 22С), формальдегида (0,5%, 8 ч, 37С), фенола (0,5%, мин, 4С). В жидком азоте лимфоциты, сохраняют инфекционность в течение нескольких лет. Вирус способен длительное время локализоваться в клетке, итерированным в геном хозяина, проявляя свое патогенное действие лишь при снижении иммунореактивности организма инфицированного животного [47].
Антигенная структура. Вирионный состав представлен шестью белками, четыре из которых являются негликозилированными, а два -гликозилированными, что установлено методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле и гельфильтрацией в присутствии гидрохлорида гуанидина.
Антигенная вариабельность и родство. В антигенном отношении BLV имеет отличия от других вирусных патогенов типа С. Так, не выявлено родства между белком р24 BLV и группоспецифическими антигенами вирусов лейкоза кошек, мышей и др. животных.
Локализация вируса, вирусоносительство, персистенция. Вирус бычьего лейкоза может быть выявлен в молозиве и молоке лактирующих животных. Однако, не удалось выделить вирус из мочи, носовых истечений, слюны зараженных животных. Теленок, инфицированный до рождения или после, естественным путем, или экспериментально, остается зараженным на всю оставшуюся жизнь.
Структурные нарушения в клеточном геноме предположительно являются основной причиной для последующей опухолевой трансформации клеток. А неспособность антител элиминировать вирус может быть объяснена тем, что данный патоген, как правило, локализован в пораженных лимфоцитах. Инфицированные лимфоциты передают геном провируса своему потомству в процессе деления клеток. BLV может также передаваться от клетки к клетке минуя стадию вирусных частиц, подобно герпесвирусному механизму клеточного прикосновения [63].
Методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота
Лейкоз кр.рог.ск. наносит существенный экономический ущерб сельскому хозяйству. Отсутствие планомерной борьбы усугубляет эпизоотическую ситуацию в отношении данной болезни, которая является причиной потери продуктивности, вынужденной и преждевременной выбраковки и убоя животных, невозможности использования больных животных для дальнейшего воспроизводства стада, гибели животных и утилизации туш; затрат на оздоровительные мероприятия неблагополучными хозяйствами, в том числе от накладываемых на них ограничений, что особенно может быть ощутимо для племенных хозяйств. Мероприятия по ликвидация лейкоза кр.рог.ск. требуют больших затрат и на диагностику данной болезни, карантин завезенного скота, изоляцию зараженных животных и на другие ветеринарные и санитарные мероприятия [66].
Положение в отношении данной болезни усложняется тем обстоятельством, что развитие характерных клинических и патологических проявлений нередко может происходить в течение и нескльких лет. Валовая продуктивность скота уменьшается вследствии снижения объема и качества производимой продукции, ограничений на использование молока, недополучения приплода, утилизации туш больных лейкозом животных, сдачей на мясо племенного молодняка, полученного от больных животных. 1.9. Профилактика лейкоза крупного рогатого скота
При разработке мер по профилактике лейкоза кр.рог.ск. и борьбе с этой болезнью, необходимо досконально знать все пути его распространения. Вопросы этиологии и патогенеза лейкозной инфекции изучаются и по сей день.
В последние десятилетия значительно расширились объемы научных исследований, получены информативные данные в отношении эффективной организации противолейкозных мероприятий, позволяющих планировать грамотную систему оздоровительных программ в соответствии со степенью инфицированности неблагополучного стада. Однако, и они требуют дальнейшего совершенствования в контексте научно-производственных исследований эпизоотии лейкоза крупного рогатого скота. Бесспорно, изучение эпизоотического процесса в отношении данной вирусной инфекции с последующим совершенствованием системы противолейкозных мероприятий, является крайне актуальной задачей, особенно для такой отрасли животноводства, как молочное скотоводство.
В результате проведения многолетних противолейкозных мероприятий в Европейских странах лейкоз КРС фактически ликвидирован [92]. Однако, ситуация в Восточной Европе отличается от таковой в Западной Европе, так как болезнь до сих пор присутствует в Болгарии, Греции, Эстонии, Латвии, Польше, Румынии, Украине. Более 10 и 30% молочного и мясного скота в США и Аргентине, соответственно, инфицированы BLV [87].
В заключении следует отметить, что благодаря использованию достижений молекулярной биологии природа вируса бычьего лейкоза изучена достаточно подробно: установлена морфология вириона, определена последовательность нуклеотидов генома, функции отдельных генов, разработаны методы геноидентификации с применением методов ГЩР-ПДРФ-и филогенетического анализа секвенированных последовательностей ДНК BLV, разработаны методы ранней диагностики с использованием полимеразной цепной реакции, иммуноферментного анализа и иммунной преципитации. Однако, учитывая значительную распространенность этой инфекции во многих странах мира и низкую эффективность проводимых в настоящее время мер по оздоровлению животноводческих хозяйств от этой инфекции необходимо продолжать исследования по усовершенствованию методов диагностики лейкоза и мер оздоровления и профилактики.
Исследования проводились в 2011-2014 годы на кафедре биологической и неорганической химии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана», ФГБУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория» Россельхознадзора РФ (г. Казань), ГБУ «Республиканская ветеринарная лаборатория» РТ (г. Казань), в НПК «Синтол» (г. Москва), а также в сельхозпредприятиях районов Республики Татарстан Российской Федерации (РТ РФ).
При проведении эпизоотологических исследований анализировались статистические данные ветеринарной отчетности, результаты лабораторной диагностики на лейкоз крупного рогатого скота по РИД и гематологии.
Молекулярно-генетическому исследованию было подвергнуто 100 проб крови BLV-позитивных коров сельхозпредприятий 16 районов РТ на предмет идентификации выявленных представителей вируса бычьего лейкоза (ВБЛ), как на основе филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса ewv-гена возбудителя, так и ПЦР-ПДРФ-генотипирования (табл. 1).
Сводные данные результатов серологических и гематологических исследований животных на лейкоз крупного рогатого скота за 2006-2014 гг
В результате проведения многолетних противолейкозных мероприятий в Европейских странах лейкоз КРС фактически ликвидирован [92]. Однако, ситуация в Восточной Европе отличается от таковой в Западной Европе, так как болезнь до сих пор присутствует в Болгарии, Греции, Эстонии, Латвии, Польше, Румынии, Украине. Более 10 и 30% молочного и мясного скота в США и Аргентине, соответственно, инфицированы BLV [87].
В заключении следует отметить, что благодаря использованию достижений молекулярной биологии природа вируса бычьего лейкоза изучена достаточно подробно: установлена морфология вириона, определена последовательность нуклеотидов генома, функции отдельных генов, разработаны методы геноидентификации с применением методов ГЩР-ПДРФ-и филогенетического анализа секвенированных последовательностей ДНК BLV, разработаны методы ранней диагностики с использованием полимеразной цепной реакции, иммуноферментного анализа и иммунной преципитации. Однако, учитывая значительную распространенность этой инфекции во многих странах мира и низкую эффективность проводимых в настоящее время мер по оздоровлению животноводческих хозяйств от этой инфекции необходимо продолжать исследования по усовершенствованию методов диагностики лейкоза и мер оздоровления и профилактики. Исследования проводились в 2011-2014 годы на кафедре биологической и неорганической химии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана», ФГБУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория» Россельхознадзора РФ (г. Казань), ГБУ «Республиканская ветеринарная лаборатория» РТ (г. Казань), в НПК «Синтол» (г. Москва), а также в сельхозпредприятиях районов Республики Татарстан Российской Федерации (РТ РФ).
При проведении эпизоотологических исследований анализировались статистические данные ветеринарной отчетности, результаты лабораторной диагностики на лейкоз крупного рогатого скота по РИД и гематологии.
Молекулярно-генетическому исследованию было подвергнуто 100 проб крови BLV-позитивных коров сельхозпредприятий 16 районов РТ на предмет идентификации выявленных представителей вируса бычьего лейкоза (ВБЛ), как на основе филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса ewv-гена возбудителя, так и ПЦР-ПДРФ-генотипирования (табл. 1).
ВСЕГО ОБРАЗЦОВ 100 Экстракция тотальной ДНК из цельной крови крупного рогатого скота осуществлена с помощью коммерческого набора «ДНК-сорб Б» согласно инструкции производителя (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ).
При постановке ПНР с выделенными образцами провирусной ДНК BLV использовалась модификация «nested» ПЦР (табл. 2) с применением «внешних» («env5032» и «env5608») и «внутренних» («env5099» и «env5521») праймеров, инициирующих на заключительном этапе реакции амплификацию фрагмента ewv-гена ВБЛ длиной 444 Ьр [76, 102, 90].
Эндонуклеазы рестрикции, подобранные для ПЦР-ПДРФ-генотипирования BLV в соответствии с филогенетической классификацией: PvuII, Sspl, Hphl (изошизомер AsuHPT), НаеШ, BstYI (изошизомер BstXll). Соответствующий ПДРФ-протокол генотипирования BLV, согласующийся с филогенетичекой классификацией, представлен в табл. 3. ПЦР-ПДРФ-моделирование: NEBcutter v.2.0 ((http://tools.neb.com/ NEBcutter2/). Детекция результатов ПЦР- и ПЦР-ПДРФ-анализа выполнена методом горизонтального электрофореза в 2,5% агарозном геле в буфере ТВЕ (рН 8,0), содержащем этидий бромид с последующей визуализацией результатов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (к=3\0 нм). Размеры фрагментов ДНК оценены по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами. В работе использованы реактивы для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим» (Россия). Секвенирование продуктов амплификации локуса ewv-гена выявленных изолятов провируса ВБЛ выполнено на генетическом анализаторе «ABI PRISM 3100» (Applied. Biosystems, США) в НПК «Синтол» (Россия) с использованием праймеров «env5099» и «env5521» в качестве сиквенсных.
Разработка и апробация стратегии ІТЦР-ПДРФ-генотипирования ВБЛ согласующейся с филогенетической классификацией возбудителя
В заключении следует отметить, что благодаря использованию достижений молекулярной биологии природа вируса бычьего лейкоза изучена достаточно подробно: установлена морфология вириона, определена последовательность нуклеотидов генома, функции отдельных генов, разработаны методы геноидентификации с применением методов ГЩР-ПДРФ-и филогенетического анализа секвенированных последовательностей ДНК BLV, разработаны методы ранней диагностики с использованием полимеразной цепной реакции, иммуноферментного анализа и иммунной преципитации. Однако, учитывая значительную распространенность этой инфекции во многих странах мира и низкую эффективность проводимых в настоящее время мер по оздоровлению животноводческих хозяйств от этой инфекции необходимо продолжать исследования по усовершенствованию методов диагностики лейкоза и мер оздоровления и профилактики. Исследования проводились в 2011-2014 годы на кафедре биологической и неорганической химии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана», ФГБУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория» Россельхознадзора РФ (г. Казань), ГБУ «Республиканская ветеринарная лаборатория» РТ (г. Казань), в НПК «Синтол» (г. Москва), а также в сельхозпредприятиях районов Республики Татарстан Российской Федерации (РТ РФ).
При проведении эпизоотологических исследований анализировались статистические данные ветеринарной отчетности, результаты лабораторной диагностики на лейкоз крупного рогатого скота по РИД и гематологии.
Молекулярно-генетическому исследованию было подвергнуто 100 проб крови BLV-позитивных коров сельхозпредприятий 16 районов РТ на предмет идентификации выявленных представителей вируса бычьего лейкоза (ВБЛ), как на основе филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса ewv-гена возбудителя, так и ПЦР-ПДРФ-генотипирования (табл. 1).
Экстракция тотальной ДНК из цельной крови крупного рогатого скота осуществлена с помощью коммерческого набора «ДНК-сорб Б» согласно инструкции производителя (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ).
При постановке ПНР с выделенными образцами провирусной ДНК BLV использовалась модификация «nested» ПЦР (табл. 2) с применением «внешних» («env5032» и «env5608») и «внутренних» («env5099» и «env5521») праймеров, инициирующих на заключительном этапе реакции амплификацию фрагмента ewv-гена ВБЛ длиной 444 Ьр [76, 102, 90].
Эндонуклеазы рестрикции, подобранные для ПЦР-ПДРФ-генотипирования BLV в соответствии с филогенетической классификацией: PvuII, Sspl, Hphl (изошизомер AsuHPT), НаеШ, BstYI (изошизомер BstXll). Соответствующий ПДРФ-протокол генотипирования BLV, согласующийся с филогенетичекой классификацией, представлен в табл. 3. ПЦР-ПДРФ-моделирование: NEBcutter v.2.0 ((http://tools.neb.com/ NEBcutter2/). Детекция результатов ПЦР- и ПЦР-ПДРФ-анализа выполнена методом горизонтального электрофореза в 2,5% агарозном геле в буфере ТВЕ (рН 8,0), содержащем этидий бромид с последующей визуализацией результатов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (к=3\0 нм). Размеры фрагментов ДНК оценены по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами. В работе использованы реактивы для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим» (Россия).
Секвенирование продуктов амплификации локуса ewv-гена выявленных изолятов провируса ВБЛ выполнено на генетическом анализаторе «ABI PRISM 3100» (Applied. Biosystems, США) в НПК «Синтол» (Россия) с использованием праймеров «env5099» и «env5521» в качестве сиквенсных. Табл. 2. Протокол «Nesed»-IIQP (локус g/iv-гена BLV)
Номера доступа (Accession Number, A/N) депонированных в GenBank NCBI в 2013 г. нуклеотидных последовательностей локуса ewv-гена изолятов провируса BLV, выявленных у крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан: КС867136-КС867150, КС886607-КС886634 (табл. 4).
Задачей данного раздела исследования являлось установление генотипической принадлежности изолятов ВБЛ, циркулирующих в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан, в соответствии с филогенетической классификацией возбудителя на основе анализа секвенированных последовательностей локуса ewv-гена провируса BL V.
В результате сравнительного филогенетического анализа выравненных нуклеотидных последовательностей локуса ewv-гена изолятов провируса BLV, выявленных у кр.рог.ск. в животноводческих хозяйствах 16 районов Республики Татарстан, установлена их генотипическая принадлежность.
Так, из 100 идентифицированных изолятов 64 относились к 4-му генотипу BLV, 28 представителей ВБЛ принадлежали кластеру 7-го генотипа, а остальные 8 происследованных образцов провируса характеризовались признаком нового, недавно обоснованного нами 8-го генотипа возбудителя (табл. 12).
Дополнительно, по результатам оценки гетерогенности типовых представителей BLV по ewv-гену был проведен анализ внутри- и межгенотипической гетерогенности известных генотипов ВБЛ, информационные данные которого представлены в обобщенной табл. 13.