Содержание к диссертации
Введение
1 Роль микроорганизмов в патогенезе наружного отита у собак и характеристика их биологических свойств (обзор литературы) 10
1.1 Этиология наружного отита у собак 10
1.2 Патогенные свойства микроорганизмов, вызывающих наружные отиты у собак 14
1.3 Секретируемые факторы персистенции условно-патогенных микроорганизмов 20
Собственные исследования 29
2 Материалы и методы исследования 29
2.1 Выделение и идентификация микроорганизмов 29
2.2 Методы определения биологических свойств грибов рода Malassezia 32
2.3 Методы определения факторов персистенции микроорганизмов 34
2.4 Методика совместного культивирования грибов рода Malassezia и бактерий рода Staphylococcus 39
2.5 Метод определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам 39
2.6 Методы статистической обработки результатов 41
3 Видовой состав микроорганизмов, выделенных от собак с наружными отитами 42
4 Характеристика биологических свойств грибов рода malassezia в микробиоценозе наружного слухового прохода собак 51
4.1 Факторы вирулентности и персистенции грибов рода Malassezia, выделенных при отитах 51
4.2 Чувствительность к антимикотикам грибов рода Malassezia, выделенных при отитах 59
5 Характеристика биологических свойств бактерий в микробиоценозе наружного слухового прохода собак 65
5.1 Факторы персистенции бактерий, выделенных при отитах 65
5.2 Чувствительность к антимикробным средствам бактерий, выделенных при отитах 77
6 Изучение особенностей межмикробных взаимодействий m. pachydermatis и бактерий рода staphylococcus 90
Обсуждение результатов исследования 93
Выводы 102
Практические предложения 104
Список сокращений 105
Библиографический указатель 1
- Патогенные свойства микроорганизмов, вызывающих наружные отиты у собак
- Методика совместного культивирования грибов рода Malassezia и бактерий рода Staphylococcus
- Чувствительность к антимикотикам грибов рода Malassezia, выделенных при отитах
- Чувствительность к антимикробным средствам бактерий, выделенных при отитах
Введение к работе
Актуальность темы. Наружные отиты являются одной из самых рас
пространенных патологий у собак (Oliveira L.C., 2008; Lehner G., 2010;
Linek M., 2011). Их возбудителями могут быть бактерии, дрожжеподобные
и плесневые грибы, а также грибково-бактериальные ассоциации (Овчинни
ков Р.С. с соавт., 2013). Нередко заболевание переходит в хроническую форму,
а его длительность достигает трех и более лет (Ершов П.П., 2008). Существен
ный вклад в длительное переживание микроорганизмов в организме хозяина
вносят секретируемые факторы персистенции (Бухарин О.В., 1999, 2006).
Однако, у микроорганизмов, выделенных при наружных отитах у собак, изучена лишь антилизоцимная активность (Пензурова С.А. с соавт., 2012).
В патогенезе отитов у собак значимую роль играют симбионтные взаимоотношения микроорганизмов, колонизирующих наружный слуховой проход (Ершов П.П., 2008). В условиях микробных ассоциаций между ними могут возникать неоднозначные взаимоотношения, что оказывает существенное влияние на течение инфекционного процесса (Долгушина В.Ф., Долгушин И.И., 2004; Karagozov I. et al., 2004). В подобных ситуациях многими исследователями (Вахитов Т.Я., 2007; Семенов А.В., 2009; Yang Y.L., 2003; Dubuis Ch., Haas D., 2007) существенным признается определение у выделенных культур факторов патогенности и персистенции и оценка характера взаимоотношений, складывающихся между сочленами микробных сообществ в том или ином биотопе.
Исследования последних лет направлены на решение вопросов, связанных с оптимизацией тактики лечения отитов, поскольку эмпирическое применение рекомендуемых антибактериальных препаратов зачастую не дает желаемого эффекта в борьбе с патогенными микроорганизмами и проблема их устойчивости приобретает все большую значимость (Cafarchia C. et al., 2012; Carrillo-Muoz A.J. et al., 2013; Figueredo L.A. et al., 2013; Chiavassa E. et al., 2014; Iatta R. et al., 2014; Buommino E. et al., 2015).
В связи с вышеизложенным, важное значение приобретают сведения об особенностях таксономического спектра, факторах патогенности и пер-систенции, а также резистентности к антимикробным препаратам возбудителей отитов у собак. В то же время остается неизученным вопрос об изменении пер-систентных характеристик данных микроорганизмов в условиях межмикробных взаимоотношений.
Целью настоящего исследования явилось изучение видового состава и биологических свойств микроорганизмов, выделенных при наружных отитах у собак, а также особенностей межмикробных взаимодействий в условиях in vitro.
Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:
-
Изучить микробиоценоз наружного слухового прохода у собак с отитами и выявить наиболее часто встречающиеся микроорганизмы.
-
Оценить биологические свойства микрофлоры наружного слухового прохода у собак с отитами, выявить их связь с характером течения заболевания,
дать сравнительную оценку персистентных свойств микроорганизмов при моно- и ассоциированной инфекции.
-
Охарактеризовать чувствительность микроорганизмов, выделенных при наружных отитах у собак, к антимикробным средствам.
-
Изучить особенности межмикробных взаимодействий в экспериментальных условиях.
Научная новизна. Проведен сравнительный анализ видового разнообразия микроорганизмов, выделенных из наружного слухового прохода собак при разных формах течения отитов. Установлено, что доминирующими видами являются M. pachydermatis и S. hyicus.
Впервые изучен широкий спектр биологических свойств микроорганизмов, выделенных при наружных отитах у собак, включающий факторы вирулентности, персистенции, способность к образованию биопленок и чувствительность к антимикробным средствам. Охарактеризованы биопрофили микроорганизмов, выделенных при разных формах течения наружного отита.
Установлены значимые персистентные свойства, характеризующие микроорганизмы, выделенные при хронической форме наружного отита. Наличие в бактериально-грибковых ассоциациях стафилококков с высокой антикарно-зиновой активностью и M. pachydermatis с высоким уровнем антигемоглобино-вой активности определяет длительность течения отита.
Впервые проведено исследование способности условно-патогенных грибов рода Malassezia и бактерий, выделенных при отитах, изменять в условиях in vitro концентрацию цитокинов ИЛ-4, ИЛ-8 и ИФН-. Установлено, что штаммы грибов Malassezia и S. hyicus, выделенные при хронической форме заболевания, обладают более выраженной, по сравнению со штаммами, изолированными при острых формах, антицитокиновой активностью в отношении ИЛ-4.
Показано, что микроорганизмы, изолированные из наружного слухового прохода при отитах, характеризуются вариабельной резистентностью к антимикробным средствам, которая зависит от видовой принадлежности микроорганизмов и формы течения заболевания.
При изучении межмикробных связей грибов Malassezia spp. и бактерий рода Staphylococcus установлено преимущественное обоюдное повышение ан-тилизоцимной активности и коэффициента биопленкообразования, а также приобретение ими способности образовывать биопленки.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные расширяют представление о биологических свойствах микроорганизмов, выделенных при разных формах течения наружных отитов у собак, а также характере межмикробных взаимодействий.
Результаты о распространенности и выраженности факторов персистен-ции у микроорганизмов, выделенных при отитах у собак, могут быть использованы при прогнозировании течения заболевания у животных.
При выборе антибактериальных препаратов для эмпирической терапии и профилактики рецидивов у собак с наружными отитами необходимо учиты-
вать региональный регистр антибиотико- и антимикотикорезистентности выделенной микрофлоры.
Методология и методы исследования. При проведении исследований и изложении материала были применены общенаучные и специальные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, микробиологические методы. Использование перечисленных методов и статистический анализ экспериментальных данных обеспечили объективность и достоверность полученных результатов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Наличие в бактериально-грибковых ассоциациях, выделенных при наружных отитах, стафилококков с высокой антикарнозиновой активностью и M. pachydermatis с высоким уровнем антигемоглобиновой активности определяет длительность течения заболевания.
-
Межмикробные бактериально-грибковые взаимоотношения при наружном отите у собак характеризуются преимущественным повышением факторов персистенции микроорганизмов-ассоциантов.
Связь работы с плановыми исследованиями и научными программами. Диссертационная работа выполнялась в рамках темы открытого плана НИР ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный аграрный университет»: «Биологические свойства условно-патогенной и нормальной микрофлоры организма животных в норме и при патологии» (№ гос. регистрации 0120.1450283).
Апробация работы. Материалы работы были доложены и обсуждены на Всероссийском конкурсе на лучшую научную работу среди студентов, аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений Министерства сельского хозяйства Российской Федерации по Приволжскому федеральному округу (Казань, 2013); международной научно-практической интернет-конференции, посвященной 65-летию кафедры паразитологии Ставропольского ГАУ «Современные тенденции в ветеринарной медицине» (Ставрополь, 2013); международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы незаразной патологии животных» (Оренбург, 2014); международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы использования биологических ресурсов в сельском хозяйстве в условиях глобализации» (Екатеринбург, 2014); Всероссийской интернет-конференции (Ставрополь, 2014); II Молодежной научно-практической конференции «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2014); международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы ветеринарной науки» (Ульяновск, 2015); Российско-китайской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии (Санкт-Петербург, 2015).
Публикации. Основные научные результаты по теме диссертации опубликованы в восьми печатных работах, из них четыре – в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
Объем и структура диссертационной работы. Работа изложена на 126 страницах компьютерной верстки, содержит введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, 4 главы результатов собственных исследований,
обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения, библиографический список, включающий 193 наименования, в том числе 98 работ иностранных авторов. Текст иллюстрирован 28 рисунками и 2 таблицами.
Патогенные свойства микроорганизмов, вызывающих наружные отиты у собак
Грибы рода Malassezia относятся к нормальной микрофлоре кожи человека и теплокровных животных, обеспечивают защиту кожных покровов от колонизации другими микроорганизмами, в том числе и патогенными, однако при нарушении защитных механизмов иммунной системы, влиянии неблагоприятных факторов внешней среды, а также наследственной предрасположенности к заболеванию, в свою очередь, могут явиться причиной развития патологических процессов в организме. Это объясняется наличием у грибов рода Malas-sezia комплекса факторов патогенности.
Определяющую роль в развитии инфекционного заболевания играет коммуникация микроорганизмов при помощи так называемых «сигнальных молекул», контролирующих многие фундаментальные процессы в популяции грибов, в частности процессы их репродукции. В момент достижения популяцией грибов определенной численности, в ней возникает «чувство кворума», что служит стартовым сигналом для активации факторов патогенности (Феофилова Е.П., 2005).
Основными факторами патогенности грибов рода Malassezia являются гидролитические ферменты.
Внеклеточные липазы, выделяемые грибами рода Malassezia, гидролизу-ют липиды кожного секрета до свободных жирных кислот, которые, в свою очередь, могут вызвать повреждение клеточных мембран кератиноцитов (Coutinho S.D. et al., 2000).
Фосфолипазы – ферменты, разрушающие эфирные связи в глицерофос-фолипидах клеточных мембран – играют существенную роль в патогенности грибов рода Malassezia (Бачурская Н.С. и соавт., 2007). и пероксидазную активности (Kiss Установлено, что грибы M. pachydermatis синтезируют фосфатазу и фос-фогидролазу, гиалуронидазу и хондроитин-сульфатазу, эстеразы и липоксиге 15 назу, причастные к воспалению кожных покровов, а также проявляют протеаз-ную, казеиназную, лецитиназную G. et al., 1996; Coutinho S.D. et al., 2000; Mancianti F. et al., 2001; Juntachai W., 2009).
C. Cafarchia с соавт. (2004) показано, что фосфолипазная активность Malassezia spp. играет ведущую роль в возникновении кожных поражений у собак. Авторами установлено, что 93,9 % изолятов M. pachydermatis, выделенных при отитах и дерматитах у собак, способны к продукции фосфолипаз, в то время как штаммы, изолированные от здоровых собак, лишь в 10,6 % случаев обладают фосфолипазной активностью. Аналогичные результаты получены M.L. Machado с соавт. (2010).
Установлено, что штаммы M. pachydermatis, выделенные при поражениях кожи, в 55,9 % случаев обладают фосфолипазной активностью (Figueredo L.A. et al., 2012).
Напротив, S. Coutinho (2005) установлено наличие хондроитин-сульфатазной, гиалуронидазной, фосфолипазной и протеиназной активности у 30 штаммов M. pachydermatis, выделенных от клинически здоровых собак и собак с наружным отитом. При этом достоверных различий в уровне активности ферментов у штаммов исследуемых групп выявлено не было. В этой связи автор предположил, что изученные ферменты не являются определяющим фактором в развитии инфекционного процесса.
В исследовании, проведенном G. Ortiz с соавт. (2013), было показано, что 75.8 % изолятов обладали фосфолипазной активностью при рН среды 6,3, и 97.8 % из них проявляли протеиназную активность. Выраженность фосфоли-пазной активности была выше у штаммов, выделенных из собак с отитами. Протеиназная активность отмечена у 97,9 % штаммов при рН среды 6,8 и у 81% штаммов при рН среды 6,3. Авторы полагают, что фосфолипаза может играть значимую роль в патогенезе хронических отитов у собак, а снижение рН среды способствует уменьшению активности протеиназы и повышает эффективность лечения отитов, вызванных М. pachydermatis. A. Chowdhaiy с соавт. (2005) обнаружили кератинолитические свойства у штаммов Malassezia furfur.
Липоксигеназы – ферменты, вырабатываемые грибами рода Malassezia и обеспечивающие перекисное окисление липидов. C. de Luca с соавт. (1996) наблюдали повышенное образование липопероксидов, когда среда была обогащена полиненасыщенными жирными кислотами. Авторы полагают, что липо-пероксиды способны оказывать токсическое действие на меланоциты.
Грибы рода Malassezia способны метаболизировать триптофан в биологически активные пигменты – производные индола, выполняющие защитную функцию и играющие ключевую роль в депигментации кожных покровов. Наиболее активным соединением является малассезин, вызывающий апоптоз меланоцитов (Krmer H.J. et al., 2005). Питириацитрины обеспечивают грибам защиту от воздействия ультрафиолетового излучения, а также ответственны за процессы депигментации кожных покровов (Machowinski A. et al., 2006).
Благодаря ряду персистентных свойств грибы рода Malassezia способны к длительному существованию на поверхности кожных покровов хозяина.
Одним из механизмов длительного выживания в условиях макроорганизма, является способность образовывать биопленки – надорганизменные структуры, обеспечивающие защитные и трофические функции (Мальцев С.В., 2011). F.T. Cannizzo (2007) установил, что грибы M. pachydermatis способны к образованию биопленок на поверхности таких субстратов как полистирол и полиуретан.
Впоследствии L.A. Figueredo с соавт. (2012) была выявлена способность к образованию биопленок у штаммов M. pachydermatis, выделенных от здоровых собак и собак с поражениями кожи. При этом штаммы, выделенные при поражениях кожи, в 55,9 % обладали фосфолипазной активностью, а также более выраженной способностью к образованию биопленок по сравнению со штаммами, выделенными у здоровых животных. Авторы предполагают, что продукция фосфолипазы коррелирует с образованием биопленок, вызывая или усиливая поражения кожи у собак. Весьма важным является тот факт, что грибы рода Malassezia устойчивы к механизмам фагоцитоза и способны ингибировать образование провоспали-тельных цитокинов (Ashbee H. et al., 2002).
Фагоцитоз является важным неспецифическим иммунным механизмом для элиминации микроорганизмов. В то же время, литературные данные о фагоцитозе и киллинге грибов рода Malassezia ограничены. Опытами in vitro показано, что нейтрофилы захватывают Malassezia в комплемент-зависимом процессе, который выходит на плато после 40 минут. Через 2 часа погибает только 5 % от общего числа клеток грибов (Richardson M.D., Shankland G.S., 1991).
Липиды клеточной стенки грибов Malassezia spp. обеспечивают их защиту от фагоцитоза, а также подавляют воспалительные процессы (Boekhout T. et al., 2010).
Наличие липидной капсулы у грибов рода Malassezia способствует их длительному переживанию в условиях макроорганизма (Kantarcioglu S. et al., 2005). Также липидная оболочка на поверхности клеток грибов Malassezia spp. выполняет функцию осмопротектора (устойчивость к концентрации NaCl в среде до 18 %), а также снижает проницаемость клеточной мембраны для некоторых антисептиков (например, мирамистина) (Гейдебрехт O.B. и соавт., 2003; Арзуманян В.Г. и соавт., 2005).
Наличием липидной капсулы вокруг клеток грибов рода Malassezia, а также липидами клеточной стенки обусловлено ингибирование синтеза цито-кинов ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО- иммунокомпетентными клетками (Kesavan S. et al., 1998, 2000).
Питириарубины – пигменты, вырабатываемые грибами рода Malassezia из триптофана, подавляют высвобождение продуктов окислительного «взрыва» из активированных гранулоцитов, что обеспечивает слабую воспалительную реакцию в организме хозяина и длительное персистирование микроорганизма (Krmer H.J. et al., 2005).
Методика совместного культивирования грибов рода Malassezia и бактерий рода Staphylococcus
В монокультуре, наряду с преобладающим в общей структуре S. hyicus (25,7 %), были выделены также P. aeruginosa (5,7 %), S. xylosus (2,86 %), Enter-ococcus sp. (2,86 %).
В ассоциациях «бактерии-бактерии» доминировали стафилококки видов S. xylosus (в 60 %) и S. hyicus (в 40 %). S. xylosus выделяли с бактериями родов Bacillus, Corynebacterium, а также вида K. terrigena (по 2,86 %). S. hyicus - с E. coli и P. vulgaris (по 2,86 %).
В ассоциации с M. pachydermatis выделяли по одному виду бактерий: P. vulgaris (2,86 %), S. xylosus (8,6 %), S. hyicus (17,1 %), S. intermedius (2,86 %); по два вида – S. xylosus и K. oxytoca (2,86 %); S. hyicus и бактерии рода Corynebacterium; S. hyicus и P. vulgaris; S. gallinarum и E. coli (по 2,86 %). Штаммы M. obtusa высевали в ассоциации с Corynebacterium sp. и S. hy-icus (2,86 %), а M. furfur – в ассоциации с Corynebacterium sp. и Streptococcus sp. (2,86 %). Далее нами был изучен микробиоценоз наружного слухового прохода при разном течении отита (острая и хроническая формы течения заболевания).
При анализе частоты встречаемости грибов выявлено, что Malassezia при хронической форме течения заболевания выделялись на 29,7 % чаще, чем при острой (76,9 % и 47,2 %, соответственно). При этом показатель микробной об-семененности грибов рода Malassezia в наружном слуховом проходе собак составил от 1 106 до 1 108 КОЕ/тампон при остром течении отита, а у собак с хроническим течением заболевания данный показатель варьировал от 1 105 до 1 107 КОЕ/тампон.
При изучении видового состава выделенных грибов рода Malassezia установлено, что 87,5 % штаммов как при остром, так и хроническом течении заболевания, представлены видом M. pachydermatis. M. obtusa выделены в 12,5 % случаев только при хроническом течении отита; M. furfur – при остром инфекционном процессе (12,5 % случаев) (в соответствии с рисунком 4).
При хроническом течении отита грибы рода Malassezia были выделены в 10,0 % случаев в монокультуре и в 70,0 % случаев – в ассоциациях с бактериями (в соответствии с рисунком 5). При этом частота встречаемости грибов в ассоциации с S. intermedius составила 10,0 %, с S. xylosus и K. oxytoca – 10,0 %; с бактериями рода Corynebacterium и S. hyicus – 20,0 %, с S. xylosus – 20,0 %, с S. hyicus – 10,0 % случаев. % 100 80 60 40 20 0
Структура микробиоценоза наружного слухового прохода у собак с хроническим отитом В 10,0 % случаев бактерии высевались в монокультуре (P. aeruginosa) и в 10,0 % случаев – в ассоциации (K. terrigena и S. xylosus). В 40,0 % случаев высевались ассоциации из двух микроорганизмов: в большинстве случаев M. pachy-dermatis высевались со стафилококками (S. xylosus, S. hyicus и S. intermedius), а в 30,0 % случаев выделяли ассоциации из трех микроорганизмов: M. pachyder-matis, S. hyicus, Corynebacterium sp. и M. pachydermatis, S. xylosus, K. oxytoca.
При остром течении инфекционного заболевания грибы рода Malassezia были выделены в 17,6 % случаев в монокультуре, и в 29,4 % – в ассоциациях с бактериями (в соответствии с рисунком 6).
При этом частота встречаемости грибов в ассоциации с S. xylosus составила 2,94 %, с S. hyicus – 14,70 %, с S. gallinarum и E. coli – 2,94 %, с P. vulgaris – 5,88 %, с бактериями родов Streptococcus и Corynebacterium – 2,94 % случаев.
В 41,2 % случаев бактерии высевались в монокультуре, преимущественно, это были штаммы S. hyicus. Ассоциации из двух видов бактерий высевались в 11,8 % случаев, чаще это были ассоциации из энтеробактерий и стафилокок 48 ков; ассоциации из грибов и одного вида бактерий высевались в 23,5 % случаев, при этом, чаще всего M. pachydermatis высевались со стафилококками.
Ассоциации из двух видов бактерий и грибов высевались в 5,88 % случаев, так M. pachydermatis высевался со стафилококком и энтеробактериями, а M. furfur – со стрептококком и коринебактерией.
Видовой состав и частота встречаемости бактерий, выделенных из наружного слухового прохода собак с наружными отитами, представлен на рисунке 7.
Частота встречаемости бактерий, выделенных из наружного слухового прохода собак, при разных формах течения отита Стафилококки выделялись при остром течении процесса у собак в 65,7±8,2 % случаев, при хроническом инфекционном процессе – в 63,6±8,2 % случаев. S. xylosus выделяли как при остром, так и при хроническом течении заболевания (в 11,4 % и 36,3 % случаев, соответственно). Штаммы S. hyicus ssp. chromogenes встречались в 51,4 % случаев при остром течении и в 18,2 % – при хроническом течении инфекционного процесса.
S. gallinarum выделялись в 2,9 % только при остром течении заболевания, в то время как S. intermedius – в 9,1 % случаев лишь при хронических отитах.
Энтеробактерии выделяли при остром течении инфекционного процесса в 14,3 %, а при хроническом течении – в 18,2 % cлучаев. При этом штаммы P. vulgaris и E. coli изолировали только при остром течении заболевания (в 8,6 % и 5,7 % случаев, соответственно), а при хроническом отите в 9,1 % случаев выделялись виды K. oxytoca и K. terrigena.
Штаммы P. aeruginosa были выделены при остром течении заболевания в 2,85 % случаев, а при хроническом инфекционном процессе – в 9,1 % случаев.
Бактерии рода Corynebacterium при острой форме отита выделяли в 8,6 %, а при хроническом течении заболевания – в 9,1 % случаев.
Бактерии родов Streptococcus, Enterococcus и Bacillus были изолированы в 2,85 % случаев только при остром течении отита.
Как видно из представленных результатов, микрофлора наружного слухового прохода собак при отитах достаточно разнообразна и представлена как монокультурами, так и ассоциациями, при этом чаще всего встречаются микроорганизмы родов Staphylococcus (71,4 %) и Malassezia (57 %) при более низкой частоте выделения энтеробактерий, неферментирующих бактерий, стрептококков, энтерококков, коринебактерий. Доминирующее положение по распространенности занимали виды S. hyicus и M. pachydermatis.
Каталазная активность выявлена у 100 % выделенных штаммов Malas-sezia spp. Каталаза – фермент, который разлагает образующуюся в процессе биологического окисления перекись водорода на воду и молекулярный кислород, а также окисляет в присутствии перекиси водорода низкомолекулярные спирты и нитриты. Этот фермент способен предотвращать действие системы перекиси водорода, которая является одной из наиболее активных фунги-цидных факторов и, тем самым, дает возможность грибам размножаться в условиях макроорганизма (Шевяков М.А., 2000).
Липолитическая активность была выявлена у 100 % штаммов грибов, выделенных от больных животных. Липолитические ферменты используются грибами для расщепления жиров на глицерин и жирные кислоты, которые в дальнейшем включаются в обмен веществ (Брокерхоф К., Дженсон Р., 1978).
Фосфолипазная активность была обнаружена у 50 % штаммов М. pachydermatis, выделенных от собак с отитами.
Протеолитическая активность была выявлена у всех изученных штаммов M. pachydermatis. Активность протеазы у штаммов M. рachydermatis, выделенных от больных животных, составляла 2,5±0,03 мг/мин-мл.
Гемолитической активностью M. pachydermatis не обладали.
В данной работе у дрожжеподобных грибов M. pachydermatis впервые была определена антиоксидантная активность (АОА) – способность инактиви-ровать свободные радикалы. Эта активность обусловлена наличием в клетке ряда ферментов, таких как каталаза, супероксиддисмутаза, глутатионперокси-даза и др., обеспечивающих ее защиту от свободнорадикальных реакций. У 100 % изученных штаммов была зарегистрирована АОА со средним значением признака, равным 1,01±0,09 ед. кв.
Далее, у грибов рода Malassezia, выделенных от собак с отитами, были изучены распространенность и выраженность антилизоцимной активности, способности к образованию биопленок, антикарнозиновой, антигемоглобино-вой, антицитокиновой активностей.
Штамм M. obtusa, выделенный при обострении хронического отита в монокультуре, обладал АЛА, равной 1,7 мкг/мл ОП, АнтиHbA – 6,99 г/л, АЦА в отношении ИЛ-4 – 51 % и ИФН- – 44 %. АКрА, способность к биопленкообра-зованию и инактивации ИЛ-8 у данного штамма не выявлены.
У штамма M. furfur, выделенного при остром течении заболевания в монокультуре, АЛА составила 2,1 мкг/мл ОП, АКрА – 0,8 мг/мл, АЦА в отношении ИЛ-4 – 39 %, ИЛ-8 – 27 % и ИФН- – 23 %. Антигемоглобиновая активность и способность к образованию биопленок не выявлена.
Штамм M. furfur, выделенный при остром отите в ассоциации со Streptococcus spp. и Corynebacterium spp., обладал АЛА, равной 2,1 мкг/мл ОП, АКрА – 2,9 мг/мл, КБ – 1,1 у.е., АЦА в отношении ИЛ-4 – 1,5 %, ИЛ-8 – 33 % и ИФН- – 15 %. Антигемоглобиновую активность данный изолят не проявлял.
Распространенность и выраженность факторов персистенции у M. pachy-dermatis представлены на рисунках 8 и 9. Установлено, что выделенные штаммы M. pachydermatis в 100 % случаев обладали способностью к инактивации лизоцима. При этом антилизоцимная активность штаммов M. pachydermatis, выделенных в монокультуре, составила 2,04±0,06 мкг/мл ОП, а в ассоциации – 2,02±0,04 мкг/мл ОП. Достоверной разницы в выраженности антилизоцимного признака у грибов при разных формах течения отита также выявлено не было. Так, при хроническом течении заболевания среднее значение АЛА у M. pachydermatis составляло 2,0±0,07 мкг/мл ОП, при остром – 2,1±0,04 мкг/мл ОП.
Чувствительность к антимикотикам грибов рода Malassezia, выделенных при отитах
Энтеробактерии, выделенные при остром течении заболевания, были способны инактивировать карнозин в 40±2,0 % случаев, со средним значением признака 1,0±0,05 мг/мл, тогда как изоляты от собак с хроническим отитом данным свойством не обладали.
Способностью к биопленкообразованию характеризовались 80±4,0 % штаммов энтеробактерий, выделенных при остром течении заболевания, и 50±2,5 % – при хроническом, с КБ 1,72±0,18 у.е. и 2,3±0,2 у.е., соответственно.
Антигемоглобиновая активность была распространена среди всех изученных штаммов энтеробактерий. Среднее значение показателя для штаммов, выделенных при хронических отитах, было равно 13,98±2,63 г/л, а при острой форме заболевания – 14,46±2,28 г/л.
Антицитокиновой активностью в отношении ИЛ-4 обладали все изученные штаммы энтеробактерий. Изоляты, выделенные при хроническом отите, инак-тивировали 49±2,1 % ИЛ-4, при остром отите – 42,6±1,91 %.
Способность к инактивации ИЛ-8 проявили 50±2,5 % изолятов, выделенных при хроническом процессе, и 40±2,0 % культур – при остром, со средними значениями признака, равными 70±0,01 % и 61±2,0 %, соответственно.
АЦА в отношении ИФН- обладали 50±2,5 % изолятов энтеробактерий, выделенных при хроническом инфекционном процессе, со значением признака, равным 20±1,5 % инактивации, в то время как штаммы, выделенные при острой форме отита данным свойством не обладали.
Все штаммы P. vulgaris, выделенные только при острой форме отита, обладали АЛА, равной 0,63±0,09 мкг/мл ОП, КБ – 2,0±0,06 у.е., АнтиHbA – 14,1±3,1 г/л, АЦА в отношении ИЛ-4 – 43,33±3,38 %.
В 33,3 % случаев изоляты обладали АКрА (0,5±0,01 мг/мл), АЦА в отношении ИЛ-8 (47±3,8 %). Не обладали АЦА в отношении ИФН-.
Штаммы E. coli, выделенные только при остром течении заболевания, в 100 % случаев обладали АЛА, равной 0,6±0,03 мкг/мл ОП, АнтиHbA – 15±3,9 г/л, АЦА в отношении ИЛ-4 – 41,5±0,5 %. 50 % изолятов характеризовались АКрА, равной 1,5±0,04 мг/мл, КБ – 1,3±0,07 у.е., АЦА в отношении ИЛ-8 – 75±1,6 %. Не обладали АЦА в отношении ИФН-.
Бактерии рода Corynebacterium высевались только в ассоциациях с другими микроорганизмами. Все выделенные штаммы коринебактерий обладали антилизоцимной активностью со средним значением признака, равным 0,68±0,03 мкг/мл ОП. Среднее значение АЛА у штаммов Corynebacterium spp., выделенных при хроническом отите составило 0,65±0,05 мкг/мл ОП, при остром течении заболевания – 0,7±0,04 мкг/мл ОП.
Антикарнозиновая активность была зарегистрирована у 50 % культур ко-ринебактерий, изолированных при остром течении инфекционного процесса, со средним значением признака, равным 2,2±0,5 мг/мл, в то время как штаммы, выделенные при хроническом отите, данным признаком не обладали.
Способность формировать биопленки проявляли все штаммы Corynebacerium spp., выделенные при острых отитах, со средним значением КБ 1,1±0,05 у.е., тогда как у изолятов, выделенных при хроническом инфекционном процессе, это свойство выявлено не было.
Антигемоглобиновой активностью обладали все изученные штаммы кори-небактерий, со средним значением признака 21,99±3,6 г/л. Установлено, что значение АнтиHbA штаммов, выделенных при хроническом инфекционном процессе, составило 27,43±3,63 г/л, что в 1,7 раза выше, чем при остром течении заболевания – 16,55±2,65 г/л.
Коринебактерии проявляли АЦА в отношении ИЛ-4, ИЛ-8 и ИФН- в 75±3,8 %, 100 % и 50±2,5 % случаев, при этом значения признака у штаммов составили 50±8,7 %, 60±7,7 % и 13,8±1,5 %, соответственно.
Коринебактерии, выделенные при хроническом инфекционном процессе, обладали антицитокиновой активностью в отношении ИЛ-4 в 50±2,5 % случаев, а при острых отитах – в 100 %, со значениями признака 23±0,2 % и 63,5±3,0 %, соответственно.
АЦА в отношении ИЛ-8 была выявлена у всех изученных изолятов Corynebacterium spp. Установлено, что при остром течении процесса АЦА ко 75 ринебактерий составила 85±2,0 %, что в 2,4 раза выше, чем при хроническом течении процесса – 35±1,2 % (p 0,05).
Таким образом, проведенные исследования позволили установить, что стафилококки, выделенные при хроническом течении заболевания и в ассоциации с грибами и другими бактериями, характеризовались более высокими значениями антикарнозиновой активности; энтеробактерии, выделенные только в ассоциациях, при хронической форме заболевания – высокими значениями АЛА в отличие от штаммов, выделенных при остром течении заболевания, которые характеризовались способностью к инактивации карнозина. Коринебактерии, выделенные при хроническом течении отита, обладали более высокими значениями антигемоглобиновой активности и способностью к инактивации ИФН- по сравнению со штаммами, выделенными при остром течении заболевания, которые, в свою очередь, характеризовались высокими значениями способности к инактивации ИЛ-4 и ИЛ-8, а также наличием АКрА и способности к образованию биопленок.
Чувствительность к антимикробным средствам бактерий, выделенных при отитах
Проведенными нами исследованиями установлено также, что и для штаммов S. hyicus, основного ассоцианта грибов Malassezia, была характерна высокая распространенность и выраженность антицитокиновой способности в отношении ИЛ-4 при хронической форме заболевания. Полученные результаты указывают на активное участие метаболитов оппортунистических грибов Malassezia и их ассоциантов в локальных иммунорегуляторных процессах, что может влиять на течение и исход инфекционного процесса.
С распространением заболеваемости собак наружным отитом и широким использованием антимикробной терапии проблема устойчивости микроорганизмов к лекарственным препаратам приобретает все большую значимость (Ni-jima M. et al., 2011; Carrillo-Munoz A.J. et al., 2013; Figueredo L.A. et al., 2013; Cafarchia C. et al., 2014;). Кроме того, в клинической практике, как правило, наиболее тяжело протекают инфекции, вызванные микроорганизмами с множественной лекарственной устойчивостью. Поэтому определение спектра анти-микотической/антибактериальной резистентности выделенных микроорганизмов является косвенным показателем их вирулентности. Большинство коммерческих препаратов, предназначенных для лечения инфекционных отитов, содержат комбинацию активных веществ, оказывающих противобактериальное, противогрибковое и противовоспалительное действие (Овчинников Р.С., 2013). Исследованиями многих зарубежных авторов доказана высокая эффективность терапии Malassezia-отитов комбинированными препаратами, содержащими в составе антибиотики, антимикотики и кортикостеро-иды (Bensignor E., Grandemange E., 2006; Cole L.K. et al., 2007; Hensel P. et al., 2009).
Нами определена устойчивость к актимикробным препаратам грибов и бактерий, выделенных при разных формах наружных отитов. Полученные данные могут быть использованы при выборе эффективных препаратов для эмпирической терапии указанного заболевания и составлении регистра резистентности и чувствительности к антимикробным препаратам приоритетных возбудителей наружного отита у собак. Установлена более высокая резистентность к широкому кругу используемых в клинической практике антимикробных препаратов у штаммов, выделенных в монокультуре при разных формах течения наружного отита, а также микроорганизмов, выделенных при остром течении процесса, что также необходимо учитывать при выборе препаратов для лечения собак с данной патологией.
Условно-патогенные микроорганизмы, обладая рядом факторов патоген-ности, способны вызывать инфекционный процесс, причем чаще в том случае, если они находятся в ассоциации с другими бактериями. Одновременное присутствие нескольких возбудителей приводит не только к суммированию болезнетворных возможностей, но и вызывает взаимное усиление факторов вирулентности ассоциантов (Изикаев В.М., 2013).
В условиях микробных ассоциаций между микроорганизмами могут возникать неоднозначные взаимоотношения, в подобных ситуациях многими исследователями существенным признается определение у выделенных культур факторов патогенности и персистенции, а также оценка характера взаимоотношений (Вахитов Т.Я., 2007; Семенов А.В., 2009).
Установлено, что для оценки межмикробных взаимодействий в качестве биомишеней можно использовать персистентные свойства микроорганизмов (антилизоцимную активность и способность образовывать биопленки) (Бухарин О.В., 2011).
Поэтому далее нами были изучены межмикробные взаимодействия стафилококков и M. pachydermatis, как наиболее часто выделяемых микроорганизмов под контролем вышеуказанных факторов персистенции в условиях in vitro.
Проведенными исследованиями установлено преимущественное обоюдное повышение экспрессии АЛА и КБ у изученных бактерий и грибов, а также приобретение ими способности образовывать биопленки при межмикробных взаимодействиях.
Взаимная стимуляция антилизоцимной активности и способности образовывать биопленки может быть одним из механизмов, способствующих формированию патологического микробиоценоза, на фоне которого возникает заболевание, и его хронизации.
Полученные данные подтверждают выявленный ранее феномен оппозит-ного (усиление/подавление) влияния микроорганизмов на биологические свойства пары микросимбионтов в условиях микросимбиоценоза (Бухарин О.В. с соавт., 2011). Изучение особенностей межмикробных взаимодействий в ассоциациях бактерий, включающее изменение уровня экспрессии факторов их па-тогенности и персистенции, позволяет получить новые данные о механизмах формирования микросимбиоценозов при разных формах течения инфекционного процесса (Лахтин В.М. с соавт., 2009).
Подтверждением этому являются данные, полученные О.А. Капустиной (2013), которая при изучении межмикробных связей индигенной и ассоциативной микрофлоры кишечника и репродуктивного тракта человека при дисбиозе и инфекционно-воспалительных заболеваниях установила преимущественное подавление факторов персистенции C. albicans под действием микроорганизмов рода Lactobacillus и E. faecium, являющихся представителями нормальной микрофлоры; и повышение персистентного потенциала C. albicans под действием условно-патогенного штамма E. faecalis. Подводя итог проделанной работе, следует заключить: наличие в бакте риально-грибковых ассоциациях, выделенных при наружных отитах, стафило кокков с высокой антикарнозиновой активностью и M. pachydermatis с высоким уровнем антигемоглобиновой активности определяет длительность течения за болевания; межмикробные бактериально-грибковые взаимоотношения при наружном отите у собак характеризуются преимущественным повышением факторов персистенции микроорганизмов-ассоциантов.